Research Article
Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
Амилоидоподобные осаждения является отличительной чертой различных заболеваний и затрагивает множество различных органов. Этот документ описывает применение люминесцентных конъюгированных oligothiophene флуоресценции пятнать в сочетании с методами микроскопии флуоресцирования. Этот метод окрашивания представляет собой мощный инструмент для обнаружения и исследования белков агрегатов в клинических и научных установок.
Белки, которые депозит как амилоида в тканях по всему телу может быть причиной или следствием большого числа заболеваний. Среди них мы находим нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и Паркинсона болезнь, страдает прежде всего центральной нервной системы и системных амилоидоза, где амилоид A сыворотки, Транстиретин и легкие цепи IgG депозит как амилоида в печени, Кистевой туннель, селезенки, почек, сердца и других периферических тканей. Амилоид известны и изучены для более чем столетие, часто с использованием амилоида конкретных красителей, например красный Конго и Тиофлавин Т (ThT) или Тиофлавин (ThS). В этой статье мы представляем гептамер формил Тиофен уксусной кислоты (hFTAA) в качестве примера недавно разработанных дополняет эти красители, называется светящиеся конъюгированных oligothiophenes (LCOs). hFTAA проста в использовании и совместима с совместно окрашивание иммунофлюоресценции или других клеточных маркеров. Обширные исследования доказали, что hFTAA обнаруживает более широкий спектр болезни связанные белком агрегатов, чем обычные амилоида красители. Кроме того hFTAA также может применяться для оптического назначения различных агрегированных Морфотипы разрешить исследования амилоида фибриллярных полиморфизма. В то время как изображений методология не является обязательным, мы здесь продемонстрировать гиперспектральных изображений (HIS), лазерная сканирующая конфокальная микроскопия и флуоресценции жизни изображений (FLIM). Эти примеры показывают некоторые методы обработки изображений, где LCOs может использоваться как инструменты, чтобы получить более подробные сведения о формировании и структурные свойства Амилоиды. Является важным ограничением в технику, для всех обычных оптической микроскопии методы, требование для микроскопические размеры агрегатов разрешить обнаружение. Кроме того агрегат должен состоять из повторяющихся β-лист структуры для привязки hFTAA. Чрезмерной фиксации и/или эпитоп экспозиции, что изменить статистическую структуру или конформации можно сделать бедных hFTAA привязки и таким образом создают ограничения для точных изображений.
Отложение амилоида в ткани является патологическим отличительной в число заболеваний, как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, амилоидоз системный и прионы заболеваний. Несмотря на распространенность заболеваний, связанных с амилоид и тот факт, что почти 40 различных белков до настоящего времени были классифицированы как амилоида прекурсоров в человека1мало что известно о связи между амилоида осаждения и болезни фенотип. Гистология образцов от человека пациентов был использован как для диагностики и научных целях. Большое количество животных модели были созданы для изучения корреляции между амилоида бремя и поведение, продолжительность жизни и ряда других фенотипические чтения выходы болезнь прогрессии2,3. Большие усилия предпринимаются также в лекарственных препаратах и дизайн в бой некоторых из наших наиболее опасается широко распространенных заболеваний. Однако оценка связи между генотипом, фенотип, амилоида налета нагрузки и медикаментов является не прямо вперед. Средства для окраски и обработки изображений из амилоида в ткани часто тупым и представить низким разрешением информацию о амилоида формирования и структуру.
Двойное лучепреломление Конго красный, ThT и тыс флуоресценции являются примеры классических методов для обнаружения и анализа амилоида бремя в образцах тканей от пациента биопсии и post mortem образцы и Животные модели болезни4. Эти методы были использованы на протяжении нескольких десятилетий (красный Конго с 1920 года и ThT и производных с 1960 года), и хотя инструментария был уточнен и позволяет для детального анализа, окрашивание процедуры анализа по-прежнему выполняются и так же, как почти полвека назад.
В настоящем документе мы описываем использование высокочувствительных Роман амилоида краситель, hFTAA5, что позволяет обнаружение малых незрелых белка месторождений с высокой точностью, а также обнаружения зрелых амилоид. По сравнению с обычными красками, hFTAA доказана обнаружить широкий спектр болезней связанных белков агрегаты5,6,7. Кроме того hFTAA также может применяться для оптического назначения различных агрегированных Морфотипы8. Здесь мы описываем, hFTAA окрашивание и анализ ткани от установленных животных моделей прионных болезни и амилоид β прекурсоров протеина (APP) трансгенных мышей предназначен для имитации развития зубного налета в болезнь Альцгеймера9,10 . Мы также показать анализ диагностических и post mortem образцов от пациентов, страдающих от системного амилоидоз. LCOs имеют внутренние свойства, которые позволяет им сообщить о конформационных различия в рамках одного налета; и путем объединения двух LCOs с различными свойствами относительно привязки и флуоресценции, разница становится еще более очевидной11. Помощью эпифлуоресцентного микроскопа оснащены фильтрами длинный пас и голова гиперспектральных камеры используется для включения объективной классификации спектральных свойств и записи микроскопии для спектрального анализа. Конфокальный флуоресцентной микроскопии с Перестраиваемый лазер в качестве источника возбуждения используется для оценки трехмерные свойства амилоидных бляшек в более подробно. Перестраиваемый лазер позволяет коллекции возбуждения спектра и шаг меньше выбор выбросов длин волн на микроскопе позволяет совместно изображений LCO флуоресценции и иммунофлюоресценции для определения совместного локализации целевого белка и амилоида. FLIM предлагает беспрецедентные чувствительность к конформационные различия навязаны LCOs и показывает различия, которые не могут быть обнаружены на спектры флуоресценции выбросов.
Основными целями с помощью описанных окрашивание метода являются для облегчения чувствительных обнаружения небольших амилоидоподобные залеми и характеризуют конформационного полиморфизма в пределах амилоидоподобные залеми. Это знание имеет важное значение для понимания основных заболеваний агрегации белков.
Примечание: синтез LCO выполнена в наших лабораториях для более чем десяти лет. По существу применяя протоколы для ароматического электрофильного замещения, палладий катализировано кросс муфта, амид сцепления и Эстер гидролиза, мы синтетически настроить зонды для различных целей 5 , 12. после синтеза, характеристика и очистки, продукт LCO лиофилизированные и хранятся при комнатной температуре. Некоторые из зондов (среди них hFTAA) в настоящее время коммерчески доступных (см. Таблицу материалы).
1. LCO окрашивание раствора
Примечание: Если hFTAA приобретается у поставщика коммерческих, пожалуйста, следуйте поставщика ' s инструкции вместо раздела 1.
2. Подготовка образцов ткани
Примечание: многие типы тканей могут отражаться с использованием hFTAA как маркер амилоида. Смотрите Рисунок 1 примеры. hFTAA чувствительна к совокупных конформации. Окрашивание следует поэтому предпочтительно выполнять на бесперебойность агрегатов без выдержки epitope. Оптимального спектрального качества достигается, если фиксация ткани сведены к минимуму. Поэтому свежий замороженные материал, нежно фиксированной в этиловом спирте во время окрашивания, является предпочтительным. Однако это можно обнаружить амилоидные отложения также в ткани, которая была исправлена с например, формалин. hFTAA обычно проникает в ткань хорошо. Выберите толщину образца, который совместим с предполагаемой изображений техники.
3. Микроскопия
Примечание: используйте флуоресцентным микроскопом оснащены фильтрами длинный пас. Все параметры ниже были использованы для создания изображений на рисунке 4. Корректировка может потребоваться в зависимости от амилоидных образца типа и тканей. Хотя hFTAA привязан к амилоиду устойчив к отбеливанию, рекомендуется выключить источник света, когда образец не рассмотрены или отображаемого.
Чувствительных и селективного окрашивания амилоидоподобные залеми от большое количество белков во многих типах различных тканей из подопытных животных и человека пациентов жизненно важное значение для клинической диагностики, а также научных исследований. В этой статье, мы показываем, каким образом это может быть достигнуто с помощью LCOs, подтверждается hFTAA, для окрашивания и смешанных изображений амилоид от выбора типов тканей. С момента первой публикации на основе Тиофен амилоида лигандов более десяти лет назад13, амилоидных отложений, состоящий из ряда белков в различных тканях были образы с помощью LCOs6,7,11, 14,,1516 (рис. 1). В сочетании с антителами или других гистологические маркеров LCOs обеспечивают отличные инструменты для диагностики и научных целей (рис. 1a, рис. 2). С соответствующим выбором флуоресцентных маркеров несколько флуорофоров может быть imaged же разделе (рис. 1a, hFTAA и DAPI, Рисунок 2a hFTAA в иммунофлуоресценции установки). Это также можно использовать подряд разделы для окрашивания с использованием brightfield и флуоресценции (Рисунок 2Б, hFTAA и DAB Пятнать антитела). Недавно hFTAA было доказано быть весьма перспективным дополнением к Конго красное окрашивание в клинической диагностике7,15 (рис. 3).
Разработка методы визуализации в последние десятилетия увеличилась потребность амилоида красителей, которые могут дискриминацию между минуту, но на же время глубокие различия в амилоидоподобные залеми в количественном выражении. Конъюгированные система в пределах LCO обеспечивает это с уникальной возможностью сообщить о вариации в режиме привязки. Скручивания молекулы может привести к искажению в углы привязки в системе конъюгированных и препятствуют транспорта электронов (рис. 4a). Это в свою очередь отражается на флуоресцентные свойства LCO волны возбуждения и выбросов и выбросов жизни. Мы используем его в вертикальном положении флуоресценции Микроскоп, оснащенных фильтрами длинный пас для выбросов. Для возбуждения и выбросов спектров в конфокальной микроскопии и FLIM мы используем LSM780 с импульсного лазера. Чтобы проиллюстрировать различные методы, мы образы один объект (бета амилоида (значения) доски в APP трансгенные мыши) (рис. 4В–e). Гиперспектральные спектры флуоресценции (рис. 4b) позволяет для оценки спектральной сдвигов и вариации интенсивности в различных регионах памятного знака. Спектра возбуждения в конфокальной микроскопии (рис. 4 c) может использоваться для определения оптимального возбуждения волны вниз по течению эксперименты, например, комбинация окрашивание с несколькими флуорофоров. Этот метод также может оказаться полезным для обнаружения конформационные различия в режиме привязки LCO. Спектр излучения в режиме конфокального может использоваться для определения свойства флуоресценции выбросов от hFTAA или сочетание нескольких флуорофоров для оценки colocalization в комбинации экспериментов с несколькими LCOs или LCO и иммунофлюоресценции комбинации. Флуоресценции жизни hFTAA очень повлияло на небольшие вариации в режиме привязки hFTAA. Таким образом FLIM является мощным инструментом в различении различия, навязанные hFTAA цели привязки (рис. 4 d). Это может использоваться для примера в дискриминации между различными прионных штаммов8. Конфокальный изображений и обработки Z-стеки в трехмерные изображения является полезным инструментом для изучения общей форме агрегатную амилоида (Рисунок 4e). Опять же использование дополнительных флуорофоров может помочь в понимании состав депозита.
Рисунок 1: различные типы и белки агрегатов ткани, показаны h ЗСТСЮА окрашивание: () Мэллори-Денк органы, состоящий из кератина агрегатов в печени (counterstained с DAPI), (b) r p62-позитивных включений в спорадических Включение тела миозит (s-IBM) мышечной ткани, (c) амилоида островка амилоида полипептид человека поджелудочной железы, мозга (d) лёгкие цепи амилоид иммуноглобулинов в кишечнике человека, почесуха (прионы) (e) овец в мыши, (f ) Тратить заболеваний (прионы) в мыши мозга, (g) значения бляшек в APP23 мыши мозга, хронические патологии (h) значения в APP/PS1 мыши мозга и (я) жира биопсии мазки из диагностических образцов Транстиретин амилоида в человека пациентов Градуированные 1-4 согласно стандартным Конго красный (CR) забил. Желтая области показывают hFTAA окрашенных амилоидоподобные залеми и синий аутофлюоресценция из жировой ткани. Длина шкалы бар указывается в каждой панели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: примеры совместного окрашивания с антителами к. () совместно пятнать с амилоида белка сыворотки (AA) иммунофлюоресценции и hFTAA человека AA амилоид на том же разделе. Вверху слева: AA антитела выбросов 640 Нм; верхний правый hFTAA в 488 нм; Нижняя панель наложения изображения показаны colocalization в желтый цвет. (b) антитело пятная и hFTAA флуоресцирования на последовательных участках. Верхняя панель: AA Пятнать антитела DAB, Нижняя панель: hFTAA, отображаемого с помощью фильтра выбросов longpass. Линейки: 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Сравнивая флуоресценции с фильтрами короткий пас на Транстиретин амилоида в сердце человека, окрашенных с Мейера гематоксилином/Конго красный (–d) и Мейера гематоксилином/hFTAA (e). () Brightfield изображение, (b) Brightfield + флуоресценции, (c) Brightfield + скрещенными поляризаторами, (d) Brightfield скрещенные поляризаторы, (e) hFTAA флуоресценции в 405 + флуоресцированияНм + 480 Нм возбуждения (подряд разделы –d). Линейки: 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: свидетельствует тот же объект окрашивали hFTAA и образы с несколькими методами с использованием одного значения зубного налета в возрасте мыши APP23. () флюоресценция свойства hFTAA это продиктовано ее конформационного состояния. Показана структура hFTAA в состоянии плоские и витой. (b) гиперспектральных изображений для оценки непрерывного спектра излучения. Спектры в нижней панели имеют цветовую кодировку по штучной регионы интереса в изображении. (c) (i) Confocal изображений для возбуждения изображений и спектра (ii и iii) и выбросов изображений в режиме фильтра или (iv) спектральных. (d) флуоресценции жизни изображений для обнаружения конформационные различий в амилоида, где коротких продолжительностей жизни находятся на периферии значения зубного налета и жизни раз больше в центре доски. Гистограмма в нижней панели показано распределение времени жизни для всего налета. Изображения окрашен по шкале под гистограммой. (e) конфокальный Z-стек собраны в режиме фильтрации для отображения трехмерной структуры объектов. Длина шкалы бар указывается в каждой панели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
PH PN MB SN являются миноритарных акционеров в Эбба биотехнологии, что коммерциализирует hFTAA под торговой маркой Amytracker545.
Амилоидоподобные осаждения является отличительной чертой различных заболеваний и затрагивает множество различных органов. Этот документ описывает применение люминесцентных конъюгированных oligothiophene флуоресценции пятнать в сочетании с методами микроскопии флуоресцирования. Этот метод окрашивания представляет собой мощный инструмент для обнаружения и исследования белков агрегатов в клинических и научных установок.
Авторы хотели бы поблагодарить Mikael Линдгрен и Ханан Sluzny за консультацией по микроскопии флуоресцирования и Адриано Агусси, Йохан Bijzet, Бауке Hazenberg, Фрэнк Heppner, Матиас Jucker, Therese Klingstedt, Карин Магнуссон, Кристина Sigurdson, Даниэль Sjölander, Christoph Рёккен, Гунилла Westermark, за Westermark и Курт Затлоукал для содействия разделов ткани или микроскопии, отображаемые в этой публикации. Совокупность представленных данных здесь финансируется взносов от шведского мозга фонд (Hjärnfonden), Шведская Альцгеймера Ассоциация (Alzheimerfonden), Шведский исследовательский совет (VR), Ассоциация Йоран Густафссон, Георг & Astrid Olsson, здоровье 7РП ЕС проекта LUPAS и Университете Линчепинга.
| hFTAA/Amytracker545 | Ebba Biotech | ||
| Dako флуоресценный монтажный носитель | Agilent technologies | GM304 | |
| LeicaDM6000 | Leica | ||
| Lumen 200 | Prior | ||
| Spectraview система | ASI спектральная визуализация | ||
| Spectraview программное обеспечение | ASI спектральная визуализация | ||
| LSM780 | Zeiss | ||
| Zen 2010b v6.0 программное обеспечение | Zeiss | ||
| FLIM система | Becker & Hickl | ||
| Ar/ML 458/488/514 | Zeiss | ||
| Настраиваемый лазер In Tune | Zeiss |
