Методическая статья

Высокое разрешение флуоресцентные в Situ гибридизация дрозофилы эмбрионов и тканей с помощью усиления сигнала Tyramide

14.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56281

⸱

19 октября 2017 г.

 ,  ,  , 
1The Terrence Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto

В этой статье

Краткое содержание

Описанные РНК в situ гибридизация протокол позволяет обнаружение РНК в целом дрозофилы эмбрионов или расчлененных тканей. С помощью микротитровальных 96-луночных пластины и усиления сигнала tyramide, стенограммы могут быть обнаружены на высокое разрешение, чувствительность и пропускную способность и при относительно низких затратах.

Аннотация

В наших усилиях, чтобы определить модели выражения и внутриклеточных локализации РНК в масштабах всего генома дрозофилы и в различных тканях мы разработали многочисленные изменения и улучшения наших оригинальный флуоресцентный на месте протокол гибридизации (рыбы). Чтобы облегчить пропускной способности и эффективности затрат, все этапы, от зонда поколения для обнаружения сигнала, выполняются с использованием экзона 96-луночных микротитровальных пластины. Digoxygenin (DIG)-зонды помечены antisense РНК производится с использованием геномной ДНК или клонов cDNA как шаблоны. После фиксации ткани и permeabilization зонды гибридизированных к стенограммы интерес и затем обнаруженные с помощью правопреемства антитела анти КОПАТЬ конъюгированных к биотин, стрептавидина конъюгированных с пероксидазой хрена (ПХ) и дневно конъюгированных tyramide, который присутствии HRP, производит Высокореактивная средней, которая связывает электронно плотной регионов непосредственно примыкает белков. Эти усилители и локализации шаги производить надежные и очень локализованный сигнал, который облегчает обоих клеточном и субклеточном Стенограмма локализации. Протоколы были оптимизированы для производства очень конкретных сигналов в различных тканях и стадии развития. Ссылки предусмотрены также дополнительные варианты, которые позволяют одновременное обнаружение нескольких протоколов, или стенограммы и белков, в то же время.

Введение

Новые методы обнаружения РНК генома общесистемной как РНК seq значительно расширили наши знания, когда и где гены выражены, и на то, что уровни1. Однако они обеспечивают сравнительно бедных временнóго и пространственного разрешения. РНК в гибридизации situ позволяет пространственное распределение стенограммы визуально наблюдается в фиксированных тканей, тем самым раскрывая подробности клеточном и субклеточном локализации2. С помощью флуоресцентной гибридизации in situ (рыба) позволяет даже больше пространственное разрешение, как он позволяет использовать мощный микроскопии методы, такие как конфокальных и легкие лист микроскопии3. Флуоресцентные маркеры например DAPI также может использоваться для установления субцеллюлярные отношения4. РЫБЫ также облегчает наблюдение за несколькими РНК и белков одновременно с четким указанием дублирования на субклеточном уровне. Уникальный реагентов и шаги, необходимые для двойной маркировки можно найти в следующих ссылок на3,5.

Процедуры, описанные здесь используют 96-луночных микротитровальных пластин для всех шагов, включая cDNA шаблон производства (Колония PCR), производство зонд РНК (с использованием стока зависит от полимеразы транскрипции T7, T3 или SP6), в situ гибридизация, и Разработка флуоресцентного сигнала. Достаточное количество эмбрионов или тканей добавляются к каждому хорошо из 96-луночных пластины для оценки последовательности и изменчивости. А затем каждый получает другой зонд. После сигнала развития эмбрионов или тканей от каждой скважины выстроились на отдельных Микроскоп слайды для микроскопического анализа.

Использование tyramide усиления сигнала (TSA) для обнаружения зонд производит надежные сигналы с исключительной субцеллюлярные резолюции 5,6,,78. Субцеллюлярные локализация РНК-это важный механизм регулирования 9 , который появляется происходят практически всех РНК 4,10,11. Эти анализы показали также, что многие стенограмм, которые не определяется РНК seq легко распознаются рыбы 8. Адаптация РНК в situ гибридизация до 96-луночных пластин позволяет анализ до 96 генов интерес одновременно (больше, если дополнительные пластины используются), делая возможным анализ больших наборов данных. Путем разрезания плит на более мелкие разделы, метод также легко адаптируется к всего несколько образцов. Протокол для анализа распределений РНК в большинстве видов тканей. Хотя не показано, он адаптируется к не -дрозофилы тканей также.

Протокол

1. ПЦР-амплификации кДНК шаблонов из плазмид

Примечание: используйте высокое качество плазмида или ДНК, ПЦР созданные шаблоны для РНК зонд синтеза. Дрозофилы гена коллекции (ДГК) библиотеки, генерируемые проектом генома дрозофилы Беркли обеспечивает охват большинства кодирования генов в геноме дрозофилы (см. таблицу 1a). Они также позволяют использовать универсальный грунтовки для амплификации кДНК вставки. Эти амплификаций PCR выполняются на плазмида ДНК в лизатов плазмида содержащих бактериальных культур. Продукты ДНК затем используются как шаблоны для в vitro транскрипция для создания Антисмысловые РНК зонды (см. Таблица 1б).

  1. Дизайн праймеров для того чтобы усилить конкретных Эксон региона гена интереса методом ПЦР (например. от геномной ДНК), желательно с сайта признание полимеразы T7 на конце антисмысловых.
  2. Для экспериментов с менее чем 96 образцов, отрезать ненужные части 96-луночных плит. Накладки с уплотняющей ленты (см. материалы) для всех инкубаций и хранения. Если используются microcentrifuge трубы, соответствующим образом скорректировать объемы.
    Примечание: 96-луночных пластины позволяют использовать многоканальные пипетки для увеличения пропускной способности, а также меньшие объемы для экономии.
Таблица 1а

вектор		 Антибиотик
рабочей концентрации 1: 1000
Праймеров		РНК-полимераза
для
antisense		РНК-полимеразой.
для
чувство
pFLC-яAmppBst_SK (-) _F/RT3T7
pBSt(-)AmppBSt_SK(-)T7T3
pOT2ХлорpOT2_F/RSP6T7
pOTB7хлорpOT2_F/RT7SP6
Таблица 1В
Грунтовкапоследовательности
pOT2_Forward 5 '-AAT-GCA-GGT-TAA-CCT-GGC-TTA-TCG-3 '
pOT2_Reverse 5 '-AAC-GCG-GCT-ACA-ATT-AAT-ACA-TAA-CC-3 '
pBst_SK (-) _Forward 5 '-GAA-ACA-GCT-ATG-ACC-ATG-ATT-ACG-CC-3 '
pBst_SK (-) _Reverse 5 '-CGG-CCA-GTG-AAT-TGT-AAT-ACG-ACT-C-3 '

Таблица 1: A) Генеральной DGC клон информации для усиления cDNA вставляет в плазмиды. B) последовательностей универсального Праймеры для ДГК плазмидов.

  1. растут 250 мкл плазмида содержащих бактериальной культуры в 96-луночных культуры пластин, добавив 240 мкл LB СМИ в колодец с правильного выбора антибиотика (1: 1000 разбавление 1000 X запасов антибиотиков) и 10 мкл оригинала плазмиды содержащих бактерии (от глицерина запас). Уплотнения с уплотнительной лентой.
  2. Инкубировать путем встряхивания на 215 об/мин при 37 ° C ночь (O/N).
    Примечание: Сделайте копию новой бактериальных глицерин cDNA плазмида клон акций заменить оригинал. Не заморозить оригинальный бактериальных запасов, как это может убивать бактерии.
  3. Производить ПЦР шаблоны, развести 10 мкл O/N бактериальной культуры в 90 мкл газобетона ddH 2 O в каждой скважине новой 96-луночных ПЦР-планшете. Денатурируйте ДНК для 5 мин при 95 ° C в Термоциклер. Сразу же место пластину на льду для по крайней мере 5 минут
  4. Подготовить ПЦР-реакции, с помощью соответствующих универсальных грунтовки согласно таблице 2.
< / TR >
реагенты50 мкл пример реакции96 хорошо перемешать
(112 x реакция)		конечная концентрация
1 X2 X PCR полимеразы микс25 мкл2800 мкл
Primer_For (25 пмоль/мкл)0.5 мкл5 6 мкл0,25 пмоль/мкл
Primer_Rev (25 пмоль/мкл)0.5 мкл56 мкл0,25 пмоль/мкл
ddH2O22 мкл2464 мкл
всего48 мкл5376 мкл

Таблица 2: ПЦР Master Mix.

  1. с помощью пипетки, аликвота 48 мкл мастер смесь ПЦР в каждой скважине новой пластинкой 96-луночных ПЦР. 2 мкл каждого шаблона денатурированного плазмида ДНК за хорошо.
    Примечание: Использование между 1 пикограмм (pg) до 1 нанограмм (НГ) плазмидной ДНК. Чрезмерная ДНК шаблон уменьшает выход PCR и специфичность.
  2. Программа 96-луночных ПЦР машины согласно таблице 3 и выполнять амплификацию.
    Примечание: Время расширение в 72° C определяется размером продукта PCR (45 s для ≤ 2.0 КБ, 1,5 мин для ≤ 3.0 КБ, 3 мин для ≤ 4.0 КБ и 3,5 мин для 4,0-5,0 kb). Отжига температура (Tm) определяется последовательность грунтовки. Когда грунт, равен или длиннее 20 nt, ТМ рассчитывается как:
    Tm (° C) = (4 X количество CG) + (2 X количество AT) -4.
и < td строка диапазон = «3» > 30 циклов,
шагтемпературывремяциклы
Первоначальный денатурации95 ° C3 мин1 цикл
усилители
Denaturation, отжига и расширение		95 ° C45 сек
54-58 ° C45 сек
72 ° C45 сек-3,5 мин
Окончательное расширение72 ° C7 мин1 цикл
Хранения4 ° Cпровести

Таблица 3: рекомендуется программа ПЦР.

  1. ПЦР продукта осадков с этанолом (EtOH) и натрия ацетата (NaOAC) (см. таблицу 4).
    Примечание: Если том реакции PCR менее 50 мкл, заполните 50 мкл с ddH 2 O.
    1. Осадок ДНК, перемешать компоненты из таблицы 4 и хранить образцы O/N при-20 ° C или за 30 минут-80 °C.Centrifuge 96-луночных пластина для 45-60 мин в 2250 x g при 4 ° C. Использование 8-канальный коллектор пипетку для cполностью удалите супернатант. Мыть раз с 160 мкл холодный 70% EtOH (РНКазы бесплатно) за 30 мин при 2250 x g при 4 ° C.
      Примечание: Осажденного ДНК можно увидеть в нижней части скважины. Короче, ПЦР продукты требуют больше centrifugations.
    2. Осторожно перевернуть 96-луночных пластины на бумажное полотенце, чтобы удалить последние капли жидкости в каждой скважине (насколько это возможно). Воздух сухой ДНК Пелле за 1 ч при комнатной температуре (RT). Ресуспензируйте осажденный ДНК в 25 мкл РНКазы свободной воды.
      Примечание: 1 h воздух сухой позволит все следы EtOH испарится. Однако очень небольшой объем жидкости (около 1 мкл) должен оставаться в каждой скважине, чтобы предотвратить полностью сушки гранул ДНК. Использование 25 мкл для реакции PCR 50 мкл. Не используйте воду DEPC лечение на данном этапе чтобы избежать вмешательства в vitro транскрипция в следующих шагах.
компоненттомачасть
PCR50 мкл
100% этанола125 мкл2,5 X vol. ПЦР
3 M NaOAc (рН = 5.2, RNase бесплатно)5 мкл10% vol. ПЦР
всего180 мкл

Таблица 4: пример реакции PCR 50 мкл.

  1. проверить размер и доходности продуктов ПЦР, выполнив 5 мкл раствора ресуспензированы ДНК на геле агарозы 1% в буфере 1 X TAE.
    Примечание: В общей сложности 250-500 нг ДНК шаблона требуется для 15 мкл в vitro транскрипция реакции. Образцы с более высокой урожайности может быть разбавлен далее. Урожайность РНК также зависит от последовательности и длина ДНК шаблона. По данным общего руководства для DIG-РНК маркировки с T7 РНК-полимеразы, примерно 10 мкг DIG-меченых РНК производится из 1 мкг линеаризованного шаблона.

2. В vitro транскрипция для создания антисмысловых зонды.

Примечание: важно для работы в среде РНКазы бесплатно. Все реактивов и лабораторной посуды должно быть РНКазы бесплатно (например, сертифицированные DNase/РНКазы бесплатная пластиковая посуда).

компонентфондовой концентрациитома Конечная концентрация
СПС100 мм7 мкл10 мм
CTP100 мм7 мкл10 мм
GTP100 мм7 & # 956; l10 мм
UTP100 мм4,5 мкл6,5 мм
Dig-11-UTP10 мм25 мкл3,5 мм
РНКазы свободной воды< /td > 19,5 мкл
всего70 мкл

Таблица 5: DIG-NTP Mix подготовки.

< таблицы границы = «1» fo:keep-together.within-страницы = «1» fo:keep-с-next.within-страницы = «всегда» > компонент 15 мкл реакции 96 хорошо перемешать
(112 x реакции) Окончательный высококонцентрированные 5 X транскрипции буфера мкл 3,00 3,00 мкл 1 x Dig-NTP смесь (10 мм) 0,75 мкл 0,75 мкл 0,5 мм АБС битор РНКазы 0,25 мкл 0,25 мкл 0,67 U / мкл РНК-полимеразы (T7 или T3 или SP6) 2,00 мкл 2.00 мкл 2.67 U / мкл Свободной воды РНКазы 1,50 мкл 1,50 мкл Всего 7,50 мкл 7,50 мкл

Таблица 6:2 X транскрипции Master Mix.

  1. Подготовить DIG-NTP смеси согласно таблице 5.
    Примечание: Чтобы избежать ошибок, всегда выровнять пластине таким образом, что A1 находится в верхнем левом углу плиты.
  2. Добавить компоненты, описанные в таблице 6 для каждой скважины в новой пластинкой 96-луночных ПЦР (зонд плита). Мкл 7,5 ПЦР продукта (ДНК шаблон) для каждой соответствующей хорошо, используя многоканальные пипетки. Крышка с Пломбировочный скотч.
    Примечание: Оптимальное количество продукта PCR, добавил в транскрипции реакция должна быть между 0,5 и 1 мкг. Если полосы на геле значительно слабее или более интенсивным, объем ДНК, добавил к реакции можно соответственно скорректированы. Точная сумма не является критической.
  3. Инкубировать пластину зонд при 37 ° C для 3,5-4 ч. смесь 15 мкл синтезированный зонд с 35 мкл DEPC лечение ddH 2 O, 125 µL 100% EtOH и 5 мкл 3 M NaOAC (рН = 5.2, RNase бесплатно). Хранить при температуре-80 ° C для по крайней мере 30 min. Центрифуги и мыть, как описано в шагах 1.10.2 и 1.10.3.
  4. Ресуспензируйте осажденный зонд в 25 мкл DEPC лечение ddH 2 O. Запуск 5 мкл на геле агарозы 1% (продолжительность < 20 минут) для проверки целостности и доходность зонда ( рис. 2).
    Примечание: Геля агарозы должна производиться с DEPC лечение ddH 2 O и буфер TAE. Электрофорез геля аппарата должны быть назначены для РНК работать только. Длиннее время работы на низкой скорости гель может привести к деградации РНК в течение электрофорезом.
  5. Смешать оставшиеся 20 мкл синтезированный зонд с 100 мкл раствора гибридизации (таблица 7) и хранить при температуре-80 ° C до тех пор, пока требуется.
    Примечание: Концентрация зонд может быть разбавлен более если полосы являются особенно надежные (см. Рисунок 2 примеры). Гибридизации решение является очень эффективным в предотвращении загрязнения РНКазы. Сразу же добавьте решение гибридизации ресуспензированы зонд, чтобы избежать деградации РНК. Гибридизация раствор должен быть фильтруется через фильтр 0.2 мкм. Для образцов тканей, увеличить моющего средства концентрации в растворе гибридизации, добавив Тритон X-100 до конечной концентрации 0,3%.
компонентобъемконцентрации выпускных экзаменов
DEPC лечение ddH2O11.85 мл23,7%
20 X SSC12,5 мл25% (5 X)
Формамид25 мл50%
0,1 млгепарина (50 мг/мл)0. 2% (0,1 мг/мл)
Один мель ДНК лосося спермы0,5 мл1,0%
Tween-200,05 мл0,1%
Общая50.00 мл100%
< p класс = «jove_content» fo:keep-together.within-страницы = «1» > Таблица 7: решение гибридизации.

3. дрозофила воспитания и эмбриона, личинок и взрослых ткани коллекции.

Примечание: для малых масштабах (бутылки) и масса (коробки) летать воспитания, используют стандартные летать лаборатории протоколы на кукурузной муки на основе продовольствия при 25 ° C. держать надлежащего взрослых и личинок плотности и предоставить дополнительные активные дрожжи порошок на продовольствие поверхностях.

  1. Собирать эмбрионов после стандартных протоколов. Основные шаги эмбриона коллекции проиллюстрированы на рис. 3.
    Примечание: После промывки devitillinized эмбрионов в метаноле, фиксированная эмбрионы могут храниться при температуре-20 ° C на срок до одного года. Permeabilization эмбрионов и после фиксации выполняются на 1 день рыбы протокола.
  2. Подготовьте свежие 40% PFA Стоковый раствор.
    1. Подготовить свежеприготовленные Стоковый раствор 40% параформальдегида (PFA) путем смешивания 10 мл DEPC лечение ddH 2 O до 3,68 г PFA и 70 мкл 2N Кох в 20 мл во флаконе сцинтилляционные стекла, содержащий небольшой переполох бара
      Предупреждение: PFA высокотоксичных с потенциальными последствиями острых и хронических здравоохранения. Читать MSDS (листы данным по безопасности материала) и использовать с надлежащей защиты для глаз, кожи и дыхательных путей.
    2. В Зонта, тепло и перемешать флакона на 3-5 мин на нагревательной пластинки на 200 ° C, пока полностью не растворится PFA. Удалить PFA Стоковый раствор от жары, как только растворяется PFA (не перегреваться).
    3. Прохладно растворенного PFA Стоковый раствор 40% на льду на 5 мин и фильтр с 0,2 мкм фильтром и 10 мл шприц.
  3. Третий Инстар личинки (L3) или взрослого ткани фиксации, закалки и permeabilization
    Примечание: этот протокол должна быть завершена в течение одного дня. Она включает в себя ткани рассечение, фиксации, закалки эндогенного HRP, permeabilization и после фиксации.
    1. Подготовить крепежные решения (Fix-I и исправить-II) согласно таблице 8.
      Примечание: Пикриновая кислота используется в качестве дополнительного фиксатором когда ткань имеет нежный структура, которая должна быть сохранена. Это не хороший фиксатором, когда Ультраструктура ткани должны быть сохранены для электронной микроскопии (EM).
      Предупреждение: Пикриновая кислота является неустойчивым и имеет способность реагировать с другими материалами и создавать взрывоопасные соединений. Использовать и хранить согласно руководящим принципам безопасности.
      2. Личинки
    2. место или взрослых мух в пластиковый Тюбик 50 мл, содержащие 10 мл холодного 1 X PBS и 100 мкл Fix-я решение. Холод на льду за 2 мин до уменьшения личинок и взрослых летать моторики.
    3. Разрез от оконечности 1 мл пластикового наконечника для создания открытие 2-3 мм. Передачи 10-30 личинки или взрослого летит с наконечником 1 мл в чашке Петри (диаметр 9 см) с мелкой слоем ПБС от 50 мл трубки (шаг 3.3.2). Добавить немного PBTT может снизить поверхностное натяжение. Тщательно анализировать личинок (открыт от передней и сжать ткани от задней к передней) или взрослых тканях интерес с парой острые щипцы под областью рассечения.
      Примечание: Около 200-300 личинки или взрослый яички могут быть расчленены и исправлена в один день опытными лицами.
    4. Передачи расчлененный тканей с 200 мкл пипетки (с наконечником, отрезать для создания открытия диаметром 2 мм) в 1,5 мл трубки и магазин на льду. Заполните каждый раунд рассечение в течение 10-15 мин до прогрессирует к следующему шагу.
      Примечание: Продолжить дополнительные раунды (в течение 2 ч время окна), насколько это необходимо для создания достаточного материала.
    5. Исправление тканей с 800 мкл Fix-я решение для 30 мин на скамейке Топ смесителя. Ограничить полоскания тканей с 800 мкл 1 X PBTT и держать трубы на льду для максимум 2,5 ч. из-за 30 мин., это должно выполняться экстракторах пока не собрано достаточно ткани.
    6. Бассейн все расчлененных и фиксированных тканей в одной 15 мл пластиковая трубка, содержащая сетки в крышке (смотрите Рисунок 4 дизайн трубки). Аспирационная лишнюю жидкость через сетку в крышку трубки. Вымойте 3 X 5 мин каждый с 10 мл 1 X PBTT. Дважды промыть 10 мл 1 X PBS для удаления моющего средства. Это предотвращает избыточное пузыри на следующем шаге.
      Примечание: Если расчлененных тканей опускаться на дно трубки, шаги могут выполняться регулярные микротитровальных пластин или 0,5-1,5 мл microcentrifuge трубы (300-800 мкл объем в трубку).
    7. Утолить эндогенного активность ПХ с 5 мл 0,3% H 2 O 2 в PBS для 15 мин на RT. повторить еще раз. Не закрывайте крышку во время этого шага без перемешивания. Полоскать дважды с использованием 10 мл 1 X PBTT. Мыть дважды за 5 минут с 10 мл 1 X PBTT.
    8. Разрушения тканей с 10 мл ацетона 80% (-20 ° C, предварительно охлажденный) при-20 ° C на 10 мин инвертировать трубки дважды во время инкубационного периода. Мыть дважды за 10 мин с 10 мл 1 X PBTT увлажняет тканях.
    9. Полоскание с 10 мл смеси гибридизации PBTT плюс 5 мл 5 мл раствора (1:1). отменить микс и заменить с 10 мл раствора гибридизации. Образцы можно хранить при-20 ° C до тех пор, пока требуется. Для достижения наилучших результатов, не следует хранить образцы для более чем на неделю.
компонентисправить я (10 мл)исправить II (10 мл)
40% акций PFA1 мл1 мл
PBTT8.99 мл9 мл
раствора пикриновой кислоты10 мкл–
< p класс = «jove_conte NT» fo:keep-together.within-страницы = «1» > Таблица 8: Исправление решения для тканей.

4. гибридизации in situ

Примечание: Эта часть протокола требует минимум 2 дня, с образец подготовки, предварительно гибридизации и гибридизации принимая место на день 1 и датчик обнаружения 2-й день. Если количество выборок является относительно высоким, если не знакомы с протоколом, или полный рабочий день не возможен, протокол должны выполняться в течение 3 дней с действия датчика обнаружения и сигнала Усилители, разделен на 2 дня. Большое количество эмбрионов или образцы Иссеченную ткань может также потребовать дополнительных дней для обработки. Для образцов Иссеченную ткань замените 1 X PBT 1 X PBTT во всех шагах, если не указано иное. Дополнительных моющих средств требуется для проникновения многих личинок и взрослых тканей, таких как мозг и яички. Хотя не проверял, 1 X PBTT может также использоваться для эмбрионов. Используйте 100 мкл на хорошо для 96-луночных пластин и 800 мкл для 1.5 мл пробирок.

  1. Предварительно гибридизации и гибридизации
    Примечание: шаги 4.1.1-4.1.6.2 предназначены для эмбриона в situ гибридизация. Для личинок и взрослых ткани в месте гибридизациях пропустите эти шаги.
    1. Удалить 2 мл фиксированной эмбрионов (хранится в метаноле при-20 ° C) для новой трубки 15 мл. Вымойте эмбрионов дважды за 7 мин с 10 мл метанола в каждой стирки. WASH эмбрионов за 7 мин с 10 мл смеси метанола и 1 X PBTT (1:1). Вымойте эмбрионов дважды за 7 мин с 10 мл 1 X PBTT увлажняет.
    2. Для permeabilization эмбриона, подготовить промежуточный протеиназы K решения (40 мкл/мл) путем разбавления 1: 500 с Стоковый раствор (20 мг/мл). Хранить при -20 ° C. Make рабочего раствора протеиназы K путем разбавления промежуточных протеиназы K решения 1/15 в 1 X PBTT для окончательной рабочей концентрации 2.667 мкг/мл.
    3. Permeabilize эмбрионов с 10 мл рабочего раствора протеиназы K (используйте меньшее за меньшее количество эмбрионов). Инкубируйте трубки на RT для 13 мин осторожно перевернуть трубку 4 раза во время инкубации. Инкубировать без перемешивания образцов в растворе протеиназы K на льду за 1 ч.
      Примечание: Этот относительно длительный инкубационный с разбавленной протеиназы K обеспечивает можно воспроизвести равномерное permeabilization и последующего окрашивания.
    4. Хотя эмбрионов разрушения, сделать 2 мг/мл раствора глицина из 10 X запасов (20 мг/мл) в 1 X PBTT для общего объема 30 мл.
      5. Решение
    5. Удалить протеиназы K, промойте с 10 мл раствора глицина (2 мг/мл) и мыть дважды за 2 мин. Промойте три раза с 10 мл 1 X PBTT для удаления глицин.
    6. После фиксации эмбрионов.
      1. Подготовить 10 мл 4% PFA (1 мл 40% ПФА в 9 мл PBTT, фильтруют через 0.45 мкм фильтром).
      2. Проинкубируйте образцы в 4% PFA для 20 минут Вымойте 3 X 2 мин с PBTT.
      3. Для приготовления раствора денатурированного гибридизации, варить гибридизации решение для 5 мин. Для полного 96-луночных плиты используйте три трубки 12 мл. Прохладный на льду сразу на 5 мин
      4. Промыть эмбрионов один раз с 10 мл 1 X PBTT: гибридизации раствор (1:1). Промойте дважды с 5 мл раствора гибридизации. Аликвота ~ 20 мкл в колодец поселились эмбрионов (30-40 эмбрионов) или фиксированной тканей в плиту 96-луночных ПЦР на льду. Удаление гибридизации решение из тканей или эмбрионов, с помощью 8-канальный коллектор пипетки ( рис. 1 / видео).
        Примечание: Коллектор дозатор имеет ‘ остановить ’, что предотвращает советы от собирается в нижней части скважины и удалению образца. Для экспериментов с использованием тканей, которые плавают, удалите жидкость тщательно с 100 мкл пипетки с.
    7. Добавить 100 мкл денатурированного гибридизации решения каждой скважины. Предварительно гибридизируйте эмбрионов для минимум 2,5-3 часа на 56 ° C с использованием сухой ванны теплового агрегата, содержащих металлические бусины (см. материалы и рис. 1).
      8. Зонд
    8. денатурировать 100 мкл приготовленные в 96-луночных ПЦР пластине с помощью Термоциклер 5 мин на 80 ° C. немедленно прохладно на льду на 5 мин. Удаление предварительно гибридизации решения из эмбрионов или тканей. Добавить денатурированного зонды ген специфического для каждого образца, крышка с лентой и гибридизировать в 56 ° C для 16-18 h O/N, под металлические бусины в сухой ванна, Отопление исполнимых

5. Датчик обнаружения

  1. предварительно теплой решения в таблице 9 в 56 ° C теплового агрегата. Вынуть пластину зонды.
    Примечание: Зонды могут быть повторно использованы между 2 - 3 раза при температуре-80 ° C (никогда не магазин, любой РНК образцы в-20 ° C). После гибридизации, двойной мель РНК является более стабильным, чем одиночной стренги РНК и меньше подвержены деградации, вызванной загрязнением РНКазы.
    Если используется система вакуумной фильтрации мульти хорошо пластины для тканей, коллекции плита должна быть включена в пластину фильтр для сбора зонды (см. видео для сведения Ассамблеи). Гибридизированные ткани нужно будет передаваться от регулярных микротитровальных 96-луночных пластины для гибридизации в один с 1,2 мкм поры размер PVDF мембраны в нижней части каждой скважины.
< t r >
шагпредварительно нагревают раствор (56 ° C)время Объем в хорошо
1Гибридизации решение: PBTT (3:1)15 мин100 мкл
2Гибридизации решение: PBTT (3:1)15 мин100 мкл
3Гибридизация решение: PBTT (1:1)15 мин100 мкл
4Гибридизации решение: PBTT (1:3)15 мин100 мкл
5PBTT 3 моет5 мин100 мкл

в таблице 9: мытье зонды после гибридизации.

  1. при использовании обычных плиты, мыть образцы согласно таблице 9 в нагревательный элемент в 56 ° C. Если с использованием вакуумного коллектора системы, использовать подогревом решения с вакуумной системой на скамейке и удалять решения непосредственно от ниже, пылесосом. После 3-мыть с 1 X PBTT, нормальной пластины могут быть удалены от нагрева исполнимых
  2. Подготовка антител.
    1. Подготовить 11 мл раствора первичного антитела (2,5 мкг/мл) со склада (1 мг/мл) путем разбавления конъюгированных биотина мыши моноклональные антитела анти КОПАТЬ (см. список материалов) в PBTTB (1: 400). Если обработка меньшее количество образцов, соответствующим образом скорректировать объемы.
    2. Подготовить 11 мл решения стрептавидина ПХ (1 мкг/мл) со склада (1 мг/мл) путем разбавления 1: 1000 стрептавидина ПХ конъюгата (см. список материалов) в PBTTB. Если используется меньшее количество образцов, соответствующим образом скорректировать объемы.
  3. Блок эмбрионов или тканей с PBTTB (1% обезжиренное молоко в 1 X PBTT) для 20 мин на скамейке Топ смеситель на RT.
    Примечание: Фильтр PBTTB с помощью фильтр-бумаги (класс 3, 6 мкм) перед его использованием на 96-луночных фильтр пластины, чтобы избежать засорения фильтров. Вместо PBTB, PBTTB (PBTB с дополнительные 0,3% Тритон X-100) используется для всех тканей во время протокол.
  4. Инкубировать эмбрионов или тканей в раствор антител (100 мкл/хорошо) для 2 h на микшер-стендовые образца. Промойте дважды с 1 x PBTTB. Вымойте 3 X 5 мин и 5 X 10 мин с PBTTB. Инкубируйте эмбрионов или тканей с решением стрептавидина ПХ (100 мкл/хорошо) для 1,5 ч, используя миксер-стендовые образца. Мыть 2 X 5 минут с PBTTB. Хранить пробы в темноте с этого момента.
    Примечание: во всех антитела моет, если ткань теряется из-за непрозрачности, производства молока, попробуйте стирки без молока (PBTT вместо PBTTB).
  5. Приготовляют раствор DAPI путем разбавления 100 X DAPI в PBTTB (1: 100).
  6. Инкубировать эмбрионов или тканей с DAPI решение (100 мкл/хорошо) для 15 мин на микшер-стендовые образца. Вымойте 4 X 10 мин с PBTT. Хранить 96-луночных пластины с образцами O/N на 4 ° C или перейти к следующему шагу.
    Примечание: Процедура может быть приостановлена здесь.

6. Обнаружение антител с использованием tyramide (см. Рисунок 5)

Примечание: здесь было использовано домашнее цианиновые 3-конъюгированных tyramide, который был подготовлен согласно протоколу, описанных в 12 . Если выполнение многих экспериментов или тестирования многие образцы, это экономит значительное количество денег и эффективной по сравнению с коммерческим реагентов (из опыта). Меньшее количество экспериментов и примеры, коммерчески доступных цианиновые 3-tyramide может использоваться (см. материалы).

  1. Плиты, мыть образец 3 X 5 минут с 1 X PBTT.
  2. Подготовка tyramide активации буферу (активации) содержащий 0,006% H 2 O 2 в PBTT (разбавить 30% (w/w) H 2 O 2 штока 1: 5000).
    3. < lя > промойте пластины с буфером активации.
  3. Подготовка цианиновые 3-tyramide решение путем разбавления его в буфере активации в 15 мл.
    1. Для эмбрионов, используйте 1:80 разрежения (137 мкл цианиновые 3-tyramide в 11 мл активации буфера). Для личинок тканей используйте разбавления 1: 150 (73 мкл цианиновые 3-tyramide в 11 мл активации буфера). Для взрослых яичек используйте разбавления 1: 200 (55 мкл цианиновые 3-tyramide в 11 мл активации буфера). Для взрослых яичников, используйте разбавления 1: 300 (36 мкл цианиновые 3-tyramide в 11 мл активации буфера).
  4. Проинкубируйте образцы с цианиновые 3-tyramide решение для 2 h на микшер-стендовые образца. Промойте четыре раза с PBTT. Вымойте 6 X 10 мин с PBTT. Вымойте 3 X 5 мин с PBS для удаления моющего средства.
  5. Добавить 150 мкл/хорошо анти исчезают монтажа СМИ. Храните пробы O/N на 4 ° C, чтобы позволить тканей или эмбрионов опускаться до нижней части трубки. Маунт образцы на скольжениях микроскопа (под рассекает область для ткани) и крышка с coverslip. Уплотнение края coverslip с прозрачным лаком.
  6. Изображение с помощью флуоресцентным микроскопом.
    Примечание: анализ отрицательный контроль первым, чтобы получить представление о ‘ неспецифические ’ фон.

Результаты

Рисунок 6 показывает примеры результатов, полученных с помощью этой процедуры. Топ 3 панели показывают примеры раннего дрозофилы эмбрионов (рис. 6, группы A-C), следующие 3 панели показывают примеры позднего дрозофилы эмбрионов с сигналами в разных тканях (amnioserosa, мышц и центральной нервной системы, соответственно (рис. 6, панели D-F). Далее приведены примеры из 3-го возраста личиночной ткани (рис. 6, панели G-J). Панели, K и L показывают представитель изображения из взрослых гонады (яичников и яичек, соответственно). Сотни изображений были загружены и аннотированный в нашей поисковой «флуоресцентные в situ плодовой мушки база данных» (FlyFISH (http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca)).

figure-results-1
Рисунок 1. Наброски флуоресцентные в situ гибридизация (рыба) протокол ключ оборудования и. (A) PCR амплификация cDNA. (B) в vitro транскрипция для создания ген специфического антисмысловых DIG - помечены зонды RNA в 96-луночных пластине (Фото пластины, показано в b). (C) и (D): взрослых (женщины: мужской соотношение 2:1. 300-400 мух/бутылка) мух разрешено mate для 3-4 дней. Эмбрионы из коллекции ночь на стандартных кукурузной муки продовольствия при 25 ° C передаются хорошо проветриваемом пластиковой коробке (1 Л кукурузной муки пищи в контейнере размера: 8 "X 8" X 3" LWH) или новые бутылки, сохраняя надлежащий личиночной плотности. Для коллекции тканей активные дрожжи порошок следует посыпать поверх питание на 24, 48 ч после откладки яиц (AEL). (E-H): Флуоресцентные в situ гибридизация эксперименты более 3 дней подряд. Для эмбрионов или тканей, которые не плавают используйте плиту 96-луночных PCR, как показано в фотографию b с 8-канальный аспиратор (фотография c). Для тканей, которые плавают, как большинство личиночной тканей используйте фильтр дном пластину (фотография в d) и удаления жидкости из нижней с коллектора Аспиратор с использованием низкого давления (фотография в e). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2. Определение выхода зонд РНК. Недавно синтезированных зондов antisense РНК, наблюдается на гель агарозы 1% (5 мкл/пер.). Выход можно классифицировать (основанный на интенсивность группы) как «низкая доходность» в майнах 3 и 10, «типичный выход» в строках 1, 4, 5, 6 и 8 или «высокодоходных» в майнах 2, 7, 9, 11 и 12. Для образцов с «типичный урожайности» используйте 10-15 мкл зонда, разбавляют в 100 мкл раствора гибридизации для каждого эксперимента в situ . Развести образцы с «высокие урожаи» зонда с дополнительной гибридизации решения по интенсивности группы относительно интенсивности «типичный зонда». Цель иметь примерно равна окончательной зонд концентрации в каждой скважине. Стрелка указывает на одну из «зонды RNA,» выше группа на каждой полосе является исходный шаблон ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3. Основные шаги для сбора крупных эмбриона и фиксация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4. Домашнее трубка для удаления жидкости из личинок или плавающей тканей. Некоторые личинок и взрослых тканях плавать в растворе при фиксации. Это простой инструмент состоит из нейлона сетки, занимаемых 200 мкл, отрезать кончик, затем кончик 1 мл как адаптер для подключения к Аспиратор. Жидкости могут быть безопасно удалены без потери каких-либо тканей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-5
Рисунок 5. Усиления сигнала Tyramide. (1) DIG-меченых Антисмысловые РНК зонд скрещивается с эндогенного смысле РНК. (2) иммуно близость привязку между основное антитело проспряганное биотина и DIG-UTP. (3) HRP конъюгированных стрептавидина связывает биотин. (4) HRP катализирует цианиновые 3-tyramide и перекиси водорода реакция сформировать недолго цианиновые 3-tyramide радикалов. (5) цианиновые 3-tyramide радикалы связать остатков тирозина на близлежащие белков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-6
Рисунок 6. Представитель в situ гибридизация изображений. Каждая группа показывает пример различных РНК (показано в голубой) и ядер, окрашенных с DAPI (показано красным цветом). (A-C) Примеры ранних эмбрионов дрозофилы . (D, F) Примеры конце дрозофилы эмбрионов. (G-J) Примеры 3 Инстар дрозофилы личиночной тканей (malphigian трубочки, средняя, слюнные железы и мышцы соответственно). (K) взрослых завязи. (L) взрослых яичка. Каждая панель отображает имя гена, что зонд гибридизировать к. Масштаб баров = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Описывается протокол обеспечивает воспроизводимость, чувствительной и экономичный метод для выявления большинства РНК в фиксированных дрозофилы эмбрионов или тканей. Хотя немного более сложным, чем более традиционно используется щелочной фосфатазы метод обнаружения датчика, резолюции, полученные рыбы гораздо больше и чувствительность является сопоставимым или более 7,8. Используя полное или частичное микротитровальных пластины, протоколы может использоваться для крупномасштабных или ограниченный анализ генов интерес. Следует отметить, что созданные зондов может обнаружить все или несколько Стенограмма сращивания формы если зонды более специально (то есть, единый экзонов). Хотя мы проверили зонды, как малые, как 200 нуклеотидов с разумной успеха, меньшие датчики имеют тенденцию быть менее эффективными и могут быть менее конкретным. Очевидно этот протокол не подходит для обнаружения небольших интронов, экзонов, или обрабатываются микроРНК.

Хотя этот подход использует ферментативные шаг, чтобы увеличить силу сигналов, интенсивности сигнала, как представляется, быть пропорциональны целевой экспрессии генов в относительно линейной и широкий спектр выражение уровня. На увеличение, сигнал считается puncta или крапинками внутри клеток и тканей. Для относительно редко стенограммы видны только несколько крошечных puncta. Как Стенограмма залегания увеличивается, они растут в количество и размер. Как с одной молекулы рыбы (smFISH), один небольшой puncta может также соответствуют одной РНК и должен также быть легко количественно с помощью программного обеспечения визуализации и информатики. Сравнение опубликованных изображений, полученных с помощью smFISH с изображениями, которые мы куратор для целей же предположить, что общее, чувствительность и разрешение этих двух методов относительно аналогичных, хотя это должна быть проверена более строгих сравнений. Учитывая гораздо выше за счет smFISH, метод здесь должны дать аналогичные результаты на долю от стоимости. Однако если цель состоит в том, чтобы обнаружить небольшие стенограммы, или отдельных частей стенограммы, рекомендуется smFISH.

Из-за меньшего размера некоторых рыб зондов этот метод также может быть лучше в проникающего тканей, которые являются большими или имеют значительные барьеры. Однако использование более высоких уровней стиральный порошок и фиксации и permeabilization настроек ткани, по-видимому, решили эту проблему. Наконец хотя был разработан для дрозофилы тканей, высокая стиральный порошок буферов, описанные здесь расчлененных тканей также должен работать для дрозофилы эмбрионы, а также большинство других организмов и тканей.

Раскрытие информации

Авторы имеют без финансовых интересов.

Благодарности

Финансовую поддержку для этого проекта была оказана Грант HMK канадской институтов здравоохранения исследований (Грант MOP 133473).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
15 мл Полипропиленовая коническая центрифужная пробиркаFrogga BioTB15-500Сертифицированная ДНКаза и РНКаза 2x
ПЦР Мастер Микс с красителем (Ambiogene)Biomart (Канада)141106-1KСертифицированная ДНКаза и РНКаза 50
мл Полипропиленовая коническая центрифугаFrogga BioTB50-500Сертифицированная ДНКаза и РНКаза
96-луночная фильтрующая пластина (1,2 мкм, гидрофильный PVDF мембранаEMD MILLIPOREMSBVS1210Используется для удаления жижида со дна пластины с флотирующими тканями
96-луночного ПЦР-планшета (200&мкм; l)DenvilleC18096-10
Шприцевой фильтр Acrodisc (0,2 ед)PALLPN4612
Шприцевой фильтр Acrodisc (0,45 ед)PALLPN4614
AgaroseBioshopAGA002.500
AXYGEN 96-луночные пластины для хранения анализовUltiDent Scientific24-P96-450V-CДля хранения бактериальных запасов глицерина
AXYGEN Алюминий Пластинчатые пломбыUltiDent Scientific24-PCR-AS-200Для герметизации пластин
AXYGEN Широкие наконечники (200 мкл)UltiDent Scientific24-T205-WB-CДля переноса образцов
Biotin-SP (длинный спейсер) IgG Фракция Моноклональный мышиный антидигоксинImmunoResearch Lab200062156Первичное антитело для in situ (исходное конс. 1 мг/мл, рабочее конс. 2,5 мкм; г/мл или 1/400 разведения.
BRAND 8-канальный коллектор (автоклавируемый)BrandTech Scientific Inc.704526Для удаления жидкостей с верхней части 96-луночных ПЦР-планшетов
ХлорамфениколСигма-альдричC1919Исходная концентрация 34 мг/мл растворенная и 0,2&мкм; m отфильтрован в 100 % EtOH (использовать как 1/1000)
Cyanine 3 Tyramide (Cy3-TSA)Домашнее производствоМожно заказать у Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA
DABCO (1,4-Диазабицикло[2.2.2]октан)Sigma-aldrichD2522Реагент Antifade в монтажных средах
Digoxigenin-11-uridine-5'-трифосфатRoche11-209-256-910
Клетка для сбора эмбрионовГлавная сделаноН/ДРазмер: 75 см X 75 см X 75 см изготовлено из полиметилметакрилата
Eppendorf Центрифуга 5804EppendorfModel 5804Центрифуга для 96-луночных планшетов на роторе A-Z-DWP
FormamideBioshopFOR001.500
GlycerolBioshopGLY002.4
GlycineBioshopGLN001.500
ГепаринSigma-AldrichH4784-250MGЗапас: 50 мг/мл. Рабочая концентрация 1 мг/мл в растворе для гибридизации
Lab Armor BeadsDiaMed LAA42370-001Заполнение нагревательного элемента
Labnet Gyro M Mini Nutating MixerFisherScientific 50-998-347Смешивание образцов
Mesh - 100 miconsFlyStuff57-103Для сбора эмбрионов
Mesh - 800 мкмSEFAR - Nytex06-780/53Для улавливания рыхлых тканей / может использоваться для специальной трубки на рисунке 4.
Микрозащитные стеклаVWR48366-067Размер: 22 X 22 мм
Микрослайды, frstdVWR48312-003Размер: 25 x 75 мм
Многолуночная пластина Вакуумный коллекторPall CorporationP/N 5017Удалите жидкость со дна 96-луночной фильтрующей пластины
Параформальдегид (PFA)BioshopPAR070.500Фиксация
ПЦР-машиныBio-RadМодель: DNA Engine PTC-20096-луночный планшет ПЦР и зонд денатурирует
Раствор пикриновой кислотыSigma-aldrich80456Для фиксации тканей I раствор
хлорида калия (KCL)BioshopPOC308
PP крышка для 96-луночных планшетов, 100/кейсUltiDent Scientific24-P-LID-PPКрышка для хранения планшетов Progene
одноразовые Резервуары для реагентов (50 мл, стерильные)UltiDent Scientific825-1-50-5SЖидкость для работы с
прогеном Прогильдируемая алюминиевая фольгаUltiDent Scientific87-CFILM-ALSeal 96-луночный планшет, ДНКазы и РНКазы свободная
протеиназа KSigma-aldrichP2308- 5MGПермеабилизация эмбриона
RiboLock Ингибитор рибонуклеазы ThermoScientificEO038140 ЕД/мкл
Набор трибонуклеозидтрифосфата (NTP)Roche11277057001РНК-зонд синтез
РНКазная вода без РНКазыGIBCO10977015-500млРНК-зонд синтез
РНКазаZapAmbionAM9780Удалить РНКазное загрязнение
Одноцепочечная ДНК из яичек лососяSigma-aldrichD9156Для гибридизационного раствора
Обезжиренное молоко (обезжиренное питание)BioshopSKI400.500Рабочая концентрация составляет 1 % в 1 X PBT или PBTT в качестве блокирующего реагента
Ацетат натрия (NaOAc) 3 M, pH=5,2 (без РНКазы)BioshopSAA333Рабочая концентрация составляет 10 % (v/v) для осаждения ДНК или РНК
SP6 RNA PolymeraseThermo ScientificEP013120 шт/мкл
Дробь из нержавеющей стали для песочной ванныVWR13259-274.Для наполнения нагревательного узла
Стереомикроскоп и источник света на гусиной шееLeicaМодель: MZ6Диссекция тканей и установка
стрептавидина, конъюгата пероксидазы хрена (HRP)Молекулярные зондыS911Запас вторичных антител: 1 мг/мл, использовать 1/1000 разведения (1 μ г/мл) для in situ.
T3 РНК-полимеразаThermo ScientificEP010120 ЕД/мкл
Т7 РНК-полимеразаThermoScientific EP011120 ед/мкл
Станция наконечника (10 мкл)AxygenT-300-STK-SСертифицированная ДНКаза и РНКаза без ДНКазы и РНКазы Концевая
станция (200 мкл)Sorbio27770TСертифицированные ДНКазы и РНКазы
(1 мл)Сертифицированы Sorbio10200 Свободная ДНКаза и РНКаза
TRITON X-100BioshopTRX506Рабочая концентрация составляет 0,3% в 1 X PBT для ткани in situ
Tween 20BioshopTWN510Рабочая концентрация составляет 0,1% в 1 X PBT для эмбриона in situ
качественная фильтровальная бумага Whatman, класс 3Sigma-aldrichWHA1003917
NameCompany Каталожный номер<strong>Комментарии
SolutionsPreparation
DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) глицерин для защиты от выцветания монтажных средDABCO (1,25 г), глицерин (35 мл или v/v 70 %) и 1 x PBS (15 мл, или v/v 30 %). Держите в темноте и скалах в холодном помещении. хранить при -20 °DG; C
1 X PBT (1L)1 X PBS с 1 мл Tween 20 (0.1 %)
1 X PBTT (1L)1 X PBS с 1 мл Tween 20 (0.1 %) и 3 мл Triton-X-100 (0.3 %)
1 X PBTB (1L)1 % обезжиренного молока в 1 x
PBT 1 x PBTTB (1 л)1 % обезжиренного молока в 1 x PBTT
Jackson

Ссылки

  1. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Rev Genet. 10, 57-63 (2009).
  2. Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98, 81-85 (1989).
  3. Hughes, S. C., Krause, H. M. Double labeling with fluorescence in situ hybridization in Drosophila whole-mount embryos. Biotechniques. 24, 530-532 (1998).
  4. Lecuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
  5. Kosman, D., et al. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846-846 (2004).
  6. Raap, A. K., et al. Ultra-sensitive FISH using peroxidase-mediated deposition of biotin- or fluorochrome tyramides. Human Mol Genet. 4, 529-534 (1995).
  7. Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues. Methods Mol Biol. 420, 289-302 (2008).
  8. Wilk, R., Murthy, S. U. M., Yan, H., Krause, H. M. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , Wiley Online Library. Vol. 9.3.1-9.3.24 1-9 (2010).
  9. Holt, C. E., Bullock, S. L. Subcellular mRNA Localization in Animal Cells and Why It Matters. Science. 326, 1212-1216 (2009).
  10. Martin, K. C., Ephrussi, A. mRNA Localization: Gene Expression in the Spatial Dimension. Cell. , 719-730 (2009).
  11. Wilk, R., Hu, J., Blotsky, D., Krause, H. M. Diverse and pervasive subcellular distributions for both coding and long noncoding RNAs. Genes Dev. 30, 594-609 (2016).
  12. Zhou, X. L., Vize, P. D. Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric kidney tubules. Dev Biol. 271, 322-338 (2004).

Перепечатки и разрешения

Теги

96DIGHRP
Высокое разрешение флуоресцентные в Situ гибридизация дрозофилы эмбрионов и тканей с помощью усиления сигнала Tyramide
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.