Method Article

Количественная оценка Моноцит трансмиграции и образование пены клетки от физических лиц с хронические воспалительные заболевания

DOI:

10.3791/56293

⸱

October 17th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Biomedical Research, Burnet Institute, 2School of Health and Biomedical Sciences, RMIT University, 3Department of Infectious Diseases, Monash University, 4University of California, Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем протокол измерения трансмиграции, моноциты через человека эндотелиальной монослои и их последующее созревания в пены клетки. Это предоставляет универсальный метод для оценки свойства атерогенные моноцитов, изолирован от людей с различными заболеваниями и для оценки факторов в крови, которые могут усилить эту склонность.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ишемическая болезнь сердца (ИБС) является основной причиной заболеваемости и смертности во всем мире. Атеросклероз, ведущей причиной CAD, инициируется трансмиграции врожденной иммунной моноциты воспалительных сайты хранение липидов, называемые жирные полосы, которые присутствуют в артериальной стен средних до крупных артерий. Ключевой особенностью патогенных поражений на этой ранней стадии атеросклероза является созревания моноцитов, которые мигрируют в артерии образуют пены клетки или липидов Ладена макрофагов. Значительные доказательства подтверждают гипотезу о том, что риск атеросклероза увеличивается на хронических воспалительных заболеваний, сопутствующих заболеваний, таких как ревматоидный артрит и ВИЧ, а также общего старения, и что этот риск предсказано Моноцит активации. В то время как мыши модели обеспечивают хорошую платформу для изучения роли моноцитов в атерогенеза в естественных условиях, они требуют генетического изменения метаболизма природных холестерина и радикальные изменения диеты нормальные мыши и имеют ограниченную пригодность для изучение атерогенные влияния человека коморбидных заболеваний. Это побудило нас разработать модель человека в пробирке для измерения атерогенный потенциал моноцитов, изолирован от людей с определенными заболеваниями. В настоящее время человека в vitro модели ограничения в том, что они оценивают Моноцит трансмиграции и пены клетки формирования в изоляции. Здесь мы описываем протокол, в котором моноцитов, изолированных от крови пациента высыпками через эндотелиальные клетки человека в матрицу коллаген типа 1, и их склонность к перерастет пены клетки в наличие или отсутствие экзогенных липидов измеряется. Протокол был утвержден для использования человеческого моноцитов, очищенного от лиц с ВИЧ-инфекцией и пожилых ВИЧ неинфицированных лиц. Эта модель универсальна и позволяет Моноцит трансмиграции и пены клетки формирования должны оцениваться с помощью либо микроскопии или проточной цитометрии, а также позволяет Оценка атерогенных факторов в сыворотке или плазме.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Моноцит переселение представляет собой решающий шаг в развитии атеросклеротических бляшек, что может привести к тромбоз, инсульта и инфаркта миокарда. Атеросклеротические бляшки развиваются из жирных разводов, обычно присутствующих на участках низкой колебательной кровотока в среде крупных артерий, где осаждаются липидов способствует активации эндотелиальной и локализованные воспаление1. Моноциты набираются на эндотелиальных клеток в жирных полосы через Моноцит эозинофилов белков (например, CCL2) и высыпками интимы2. После переселения Моноциты образуют атерогенные, липидов Ладена макрофагов, называемые пены клетки вследствие поглощения липидов, синтез липидов, вниз регулирование измеряем холестерина или сочетание вышеуказанных факторов. Моноциты может также накапливают липиды в циркуляции и имеют «пенистый» фенотип, возможно предрасполагающие клетки для пены клетки формирования3,4. Пена клетки являются характерной чертой жирных разводов и ранней стадии атеросклеротических бляшек и их формирования находится под влиянием липидов и воспалительных медиаторов5. Кроме того, моноциты имеют возможность обратить вспять высыпками из артерии в кровоток6, тем самым удаляя липидов из интима и Исполняющий обязанности для поддержания здоровья артерии.

Определение склонности моноцитов к высыпками через артериальной эндотелия и формы пены клеток интимы, или вспять высыпками и нести липидов из доски, является ключевым требованием для понимания роли Моноцит активации в повышении атеросклеротические риска. В выяснения реального времени в естественных условиях информацию о жирных полоска/атеросклеротической бляшки развития важны мыши модели САПР как атеросклероз. Однако эти модели требуют генетического изменения природных холестерина, обработки способности этих животных, обычно в сочетании с радикальные изменения в диете (например, модель диета ароЕ / Западной типа)7,8, тем самым, склонение-физиологические накопления оборотных липидов уровней развития зубного налета диск. Эти модели могут быть лишь ограниченные отношение к хронической человека воспалительных например ВИЧ-инфекции, не связанные с увеличение циркулирующих холестерина и липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) уровнях. Кроме того, различия в биологии Моноцит людей и мышей сделать тестирование иммунологического вопросы относительно актуальности субпопуляций моноцитов (таких как промежуточные моноцитов (CD14++окрашенных CD16 ++))9 трудно. Это имеет важное значение при изучении механизмов вождения сердечно-сосудистых заболеваний, как промежуточные Моноцит рассчитывает самостоятельно прогнозировать сердечно-сосудистых событий10,11. Хотя анализов существуют последовательно измерить либо формирование клеток Моноцит переселения или пены в изоляции, не в vitro пробирного протестирована для количественной оценки обоих аспектов раннего атерогенеза, используя те же клетки от клинических когорты. Transwell модели используют модифицированную систему двухпалатного Бойден которой клетки загружаются в верхней камере и высыпками через пористые Пластиковый барьер или монослоя клеток в нижней палате, которая обычно содержит носитель с хемотаксического12 , 13. Хотя широко используется для анализа лейкоцита трансмиграции, эти модели обычно не включают слой, представляющий интима, что приводит к переселенных клетки мигрируют в раствор и не позволяют для измерения ячейки пены формирование или обратного переселения тех же ячейках. И наоборот модели формирования клеток пены не учитывают transmigratory индуцированных изменений моноциты или эффекты эндотелиальной активации, который известен вносить пены клетки формирования14. Кроме того, эти системы вызывают пены формирования клеток от макрофагов придерживаться пластины культуры клеток путем добавления насыщения концентраций экзогенного окисленного липопротеинов низкой плотности (oxLDL)15,16, ключевых индуктор формирования клеток пены. ЛПНП, используемые в этих моделях часто окисляется, не физиологически соответствующих процессов, таких как CuSO4 лечения17, таким образом, допрос Физиологическая важность исследований с использованием этих моделей.

Здесь мы описываем assay который измеряет Моноцит трансмиграции и образование пены клетки же клеток, которая не требуют добавления внешних oxLDL, таким образом лучше моделирования роли моноцитов в формировании клеток пены. Эта модель была первоначально разработана профессор Уильям Muller (Северо-Западный университет, Чикаго)18и уточнены в нашей лаборатории для оценки ex vivo атерогенности моноцитов, изолированные под не Активация условия от лица с базовой воспалительных заболеваний, сопутствующих заболеваний, таких как ВИЧ инфекции19 , а также старения20, которые связаны с повышенным риском развития атеросклероза. Эта модель также предоставляет платформу для ответа на основные биологические вопросы относительно склонность различных Моноцит подмножеств формы пены клетки20, влияние эндотелиальной активации цитокинов, таких как ФНО на образование пены клетки14 и мигрирующих свойств моноцитов, такие как глубина и скорость переселения в гели19. Кроме того Моноцит трансмиграции и пены клетки формирования могут быть количественно с помощью стандартных микроскопии, живут клеток, поток цитометрии и изображений проточной цитометрии, таким образом, предоставляя универсальный метод для оценки роли моноцитов в атерогенеза.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: все эксперименты с использованием человеческого биологические образцы были выполнены с одобрения этики от человека Комитет этики Альфред больницы, Мельбурн. Все эксперименты были проведены в шкафы биологической безопасности II класса, если не указано. " Prewarmed " относится к реагентов, разогретую до 37 ° C в капилляре.

1. Подготовка типа I волокнистый коллаген гели: 1 день

  1. подготовить полимеризуется коллагеновые гели, последовательно добавляя и смешивания 35,7 мм NaOH, 0,71 x M199, 4.58 мм уксусной кислоты и 1.71 мг/мл тип I волокнистый коллаген в 5 мл полистирола трубка согласно таблице 1.
    Примечание: Убедитесь, что коллаген перемешанных, нежно закупорить вверх и вниз 5 раз для того чтобы остановить формирование коллагена ' карманы ' в смеси геля. Подготовка 4-6 гели на условие теста для микроскопии или 15 гели на условие теста для проточной цитометрии.
  2. Раз хорошо смешанных, аликвота 50 мкл смесь гель коллагена в каждой скважине стерильные плоскодонной культуры ткани 96-луночных плиты. Не используйте вне строк и столбцов, но заполнить их с 200 мкл 1 x Dubecco ' s фосфат буфер солевой раствор (PBS) для защиты Гели от высыхания. Инкубировать пластины на 37 °C/5% CO 2 2 h разрешить коллагена для полимеризации.
    Примечание: Поместите пластины прямо на чистые металлические стеллажи в инкубаторе обеспечить равномерное распределение тепла.
  3. После инкубации, наложение гели с 150 мкл 1 x дополнениями M199 (см. Таблицу материалы) и инкубировать в течение 5 дней до использования и.

2. Расширение хранимые HUVEC: 1 день

  1. метку и пальто диаметром 10 см Петри с 1 мл 50 мкг/мл фибронектин разводят в 1 x PBS и инкубации при комнатной температуре на 10 мин
  2. Оттепель аликвоты криоконсервированных первичного человека пупочной вены эндотелиальных клеток (1,0 x 10 6 клеток HUVEC) в 10 мл M20.
    Примечание: HUVEC должны подготавливаться как описано ранее 21 и используется ряд низкий проход (< проход 4). HUVEC могут быть заменены эндотелиальных клеток человека коронарной артерии здесь.
  3. Ресуспензируйте HUVEC в 10 мл M20 и добавить фибронектин покрытием блюдо, аспирационных избыток фибронектина до того клетки, и культуры до слияния (примерно 5 дней), заменив СМИ на день 3.

3. Культивирование HUVEC монослоя на коллагеновые гели: день 5

  1. на 5 день, отсоединить HUVEC аспирационных культуры супернатанта от Петри и вымывание сыворотки содержащих СМИ с 10 мл сыворотки бесплатно M199.
  2. Добавить 5 мл 0,05% трипсина/0.53 ЭДТА в M199 HUVEC и инкубировать для 1-2 мин при комнатной температуре, пожимая мягко, пока клетки и.
  3. После отсоединения, быстро промойте Петри с 5 мл M20 и передачи средств массовой информации, содержащие клетки тюбик 10 мл.
  4. Образцы центрифуги на 300 g x 5 мин при комнатной температуре, аспирационная супернатанта, Ресуспензируйте клетки в 200 мкл M20 и подсчитать ячейки с помощью Горяева.
  5. Ресуспензируйте клетки 2.0 x 10 5 клеток/мл в M20, аспирационная M199 на гелях от 96-луночных пластины (шаг 1.3) и 100 мкл ресуспензированы HUVEC (2,0 х 10 4 клетки) для каждого гель коллагена, подготовленный выше (шаг 1.2). Культура пластины еще 3 дней на 37 °C/5% CO 2.
    Примечание: Целостность HUVEC монослоя может быть подтвержден после 3 дней нитрата серебра, окрашивание 22 или иммуногистохимия для жесткой перехода белки 23 на данном этапе. Дополнительные гели должны быть готовы для этой цели.

4. Активация HUVEC монослоя и изоляции/активации моноцитов для переселения: день 8

  1. на 8 день, активировать каждый HUVEC монослоя перед добавлением моноцитов, аспирационных M20 СМИ наложение гели и добавлением 100 мкл 10 нг/мл человека TNFα в M20 в гель. Инкубируйте на 37 °C/5% CO 2 для 4 х.
    Примечание: Неактивированные HUVEC условия также могут быть включены при необходимости как элементы управления.
    2. Моноциты
  2. в течение 4 ч HUVEC активации шаг, изолировать от получения с помощью магнитных бисерные техники негативно выбрать для ячеек в соответствии с производителем ' s инструкции. Минимум 6,5 x 10 6 получения должны быть использованы на этот шаг для того, чтобы надежно восстановить 3.0 x 10 5 моноцитов, необходимых для одного состояния, как моноциты обычно приходится примерно 10-15% репликацию.
    Примечание: Для оценки эффекта Моноцит активации до формирования Моноцит трансмиграции и пены клетки, моноциты может активироваться на данном этапе. Моноциты могут быть изолированы от талой репликацию при необходимости (например, хранимой пациентов образцов). Моноцит подмножеств изолируются СУИМ сортировки может быть подготовлен для того, чтобы гели (рис. 1).

5. Переселение первичных человеческих моноциты: день 8

  1. для измерения Моноцит трансмиграции, удалить СМИ TNFα-содержащих и мыть гели дважды с 100 мкл M199 путем добавления и удаления средства массовой информации. После стирки, добавить 2.0 x 10 5 свежезаваренным изолированных или разморозить и промывают криоконсервированных репликацию или 5.0 x 10 моноциты 4 свежезаваренным изолированных или очищенного Моноцит подмножества для HUVEC монослои в 100 мкл M20. Инкубируйте 1 час при 37 ° C и 5% CO 2 разрешить вперед трансмиграции моноцитов в гель. Лучше всего позволить 6 скважин для каждого экспериментальные условия изучены.
    Примечание: Оценить эффект аутологичной сыворотки на формирование клеток трансмиграции и пены, инкубации клеток с M20, содержащих желаемой концентрации тепла инактивированная доноров сыворотки и сравнить условия с элементом управления человеческой сыворотки. На этой стадии могут быть добавлены лейкоциты помимо моноцитов. Если исследования воздействия конкретных липидов/липидов видов (например, ЛПВП, oxHDL), выполнять все следующие шаги с сыворотка свободных СМИ, содержащие 20-50 мкг/мл липиды.
  2. После 1 h вперед переселения, собрать-переселено клетки путем промывания гели дважды с 100 мкл подогретую 1 мм EGTA в однократном ПБС и один раз с 100 мкл M199 (же центрифуга условия), объединение supernatants от каждой скважины одного и того же экспериментальный состояние (обычно 6 скважин) в 1,5 мл microcentrifuge трубку на льду. Центрифуга-переселено клетки на 4 ° C, 300 x g 5 мин и Ресуспензируйте в 30 мкл ПБС.
  3. Количество клеток, собранных в надосадке определить количество вперед переселенных клеток.
  4. Процент вперед переселенных ячеек определяется следующим:
    figure-protocol-1 figure-protocol-2 figure-protocol-3
  5. покрытия мытый Гели, содержащие переселенных клетки с 100 мкл M20 и инкубировать еще 48 ч.
  6. После 48 ч, собирать супернатант и мыть-переселено клетки дважды с 100 мкл подогретую 1 мм EGTA/PBS, сбор и объединение супернатант от каждого состояния как шаг 5.2.
    Примечание: Фенотип обратный переселенных клеток может быть проверена на эти клетки following Стандартный проточной цитометрии пятная протоколы.
  7. Центрифуга клетки на 4 ° C, 300 x g 5 мин и Ресуспензируйте клетки в 30 мкл ПБС. Подсчитать ячейки и определить жизнеспособность через Трипановый синий пятнать.
  8. Определить процент обратный переселенных клеток, используя следующее уравнение:
    figure-protocol-4
    Примечание: учет общее количество переселенных вперед клеток дает более точным показателем обратного переселения, как это вряд ли вперед трансмиграции будет 100%.
  9. Для анализа в микроскопии, исправить гели, добавив 100 мкл 2% формальдегида (конечная концентрация) для каждой скважины, накладки в алюминиевой фольги и хранить при 4 ° C до анализа. Для проточной цитометрии не исправить клетки на данном этапе. Смотреть ниже протоколы для микроскопии (раздел 6) или анализа потока цитометрии (раздел 7).
    Предупреждение: Формальдегид, токсичные и коррозионные; использование средств индивидуальной защиты (СИЗ). Следует соблюдать осторожность при добавлении формальдегида, однако, этот шаг не должны выполняться в вытяжной шкаф из-за низкой концентрации.

6. Количественный пены клетки и макрофаги по микроскопии (масло-красный O пятно)

  1. Удалить формальдегида и мыть гели с 100 мкл 50% (v/v) метанола на 5 мин и затем 100 мкл 78% (v/v) метанола на 15 мин
    Примечание: Окрашивание шаги могут быть выполнены на лабораторном столе, а не в шкаф класса II Biohazard.
  2. Пятно для липидного капель путем добавления 100 мкл свежеприготовленные 0,2% (w/v) масло-красный O (см. Таблицу материалов для деталей) за 1 ч при комнатной температуре.
  3. Удалить излишки пятно, стиральные гели 4 раза с 100 мкл 78% (v/v) метанола, аспирационных и отменяя надосадке после каждого Вашингтон
  4. Изображение за 15 мин при комнатной температуре с 100 мкл Гимзы, разбавляют в дистиллированной воде 1:10.
  5. Аспирационная Гимзе и мыть гели раз с водой.
  6. Для отсоединения Гели от плиты, ОПРАВА скважин с помощью иглой 21 G с скоса наружу, по краям геля.
  7. Для монтирования гели на микроскопа, удар два отверстия (диаметр 6,35 мм) в полосе 2,54 см x 1,5 см двухсторонний скотч. Исправьте ленты в сторону стандартной микроскопа и удалить защитное покрытие из верхней.
    1. Добавить каплю воды в отверстия в ленты с помощью пипетки передачи. С помощью пинцета, нежно передачи гели с отверстиями в ленте и крышка с coverslip 1.5 стекла размер. Слегка нажмите на coverslip придерживаться ленты.
  8. Изучать с дифференциальной помехи контраст ярких поля микроскопии с использованием 40 X цель на инвертированным микроскопом.
    1. Принесите HUVEC монослоя в фокус на 40 X увеличение и прокрутки ' в ' гель, подсчет клеток макрофагами пены на протяжении всей глубины геля. Повторите для трех различных полей зрения расположен на аналогичные расстояния от края геля для того, чтобы свести к минимуму возможные эффекты краев. Это обеспечит гель глубина согласуется между подсчета регионов.
      Примечание: Оценка клетки в геле как пена клетки (определяется как клетки, содержащие > 1/3 из их цитоплазме как нефть-красный O окрашенных липидного капель) или макрофаги в течение 2 ч монтажа на слайдах ( рис. 2). Образование пены клетки выражается как процент клеток пены относительно общего числа перенесенных клеток и выражается как отсчеты средний 3 поля зрения рассмотрены для 6 гели в состоянии, поэтому средний 18 измерений в состоянии. В таблице 2 приведен пример из сырья клеток от типичного эксперимент.
      Примечание: Классификации ячейки как макрофагов против клеток пены при микроскопии субъективна и следовательно могут зависеть от следователя. В клинических исследованиях, где эксперименты выполняются в течение длительного времени, важно для подсчета всех выполняемых ослепленный одного следователя. На рисунке 2 приводятся примеры пены клетки и макрофаги в гелях.

7. Анализ переселено клеток, поток цитометрии

  1. фенотипически характеризуют пены клетки и макрофаги, после трансэндотелиальной миграции, дайджест гели, добавив 100 мкл 37 ° C подогретую 1 мг/мл коллагеназы D разводят в M199 для Каждый хорошо и проинкубируйте втечение 20 мин на 37 °C/5% CO 2.
    Примечание: Поместите пластины для 96-луночных прямо на чистые металлические стеллажи в инкубаторе обеспечить равномерное распределение тепла.
  2. После инкубации, Размачиваем гели, с помощью кончика пипетки 200 мкл и инкубировать еще 20 минут, 37 °C/5% CO 2.
  3. Один раз полностью усваивается организмом, фильтр и бассейн переваривается реплицировать гели через 35 мкм нейлон сетки ограничен СУИМ трубки помещены на льду и мыть раз с СУИМ мыть (см. таблицу материалов) при 4 ° C, 300 x g. Ресуспензируйте клетки в 100 мкл СУИМ Вашингтон
  4. Результате клетки с Флюорофор конъюгированных антител специфических Инкубируйте CD45, маркер жить/мертвых клеток и поверхности/внутриклеточных маркеров фенотипические или функциональных интерес, используя стандартный поток цитометрии протоколы.
    Примечание: Подготовьте управления трубы для компенсации, используя соответствующие флуорофоров и Ig компенсации бусины. Извлеченные клетки также могут быть собраны на стеклянных вставках для микроскопии иммунофлуоресценции, cytospinning. Кроме того, мы успешно собрали клетки, используя этот протокол для оценки через изображений проточной цитометрии.
  5. Приобрести клетки с помощью проточный цитометр и выполнять компенсации необходимости.
    Примечание: Как пена клетки/макрофаги могут не образуют отдельных групп населения, с помощью свойства рассеяние света и могут значительно отличаться по размеру и форме, установите либеральной вперед точечной (FSC) и стороны точечной (SSC) ворота для того, чтобы захватить все перенесенные клетки, как показано в < сильный класс = «xfig» > рисунок 3A.
  6. После приобретения, выполнять анализ данных, с помощью потока цитометрии программного обеспечения. Чтобы идентифицировать перенесенные клетки, сначала выделите ячейки как негативные для маркера жить/мертвые, как показано на рисунке 3B. Далее, выполняют одну ячейку дискриминации путем создания жесткой ворота вокруг клетки, показано на участке против SSC-высота SSC-площадь.
  7. Выберите CD45 + клеток и ворота основных населения перенесенных клетки присутствуют в участке FSC/SSC, как эти являются клетки, макрофаги пены.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Количественная оценка трансмиграции Моноцит

Моноциты добавляются к модели, как описано на рисунке 1, и шесть гели составляются для каждого условия. Моноциты 6 гели на доноров (т.е., 5.0 x 10 моноциты4 за гелей гель 6 = 3,0 x 105 моноцитов в доноров) высокомобильна окончательный объем 600 мкл M199 носителя, содержащего необходимые сыворотка/изолированны...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол, описанные здесь предлагает универсальный и физиологически соответствующие метод оценки атерогенности моноциты из человеческих клинических когорт, объединив Моноцит трансмиграции и образование пены клетки. Эта модель предлагает преимущества над альтернативные методы формирования клеток пены, как он принимает во внимание эффект Моноцит переселения на образование пены клетки и позволяет измерения обратного переселения6 помимо присущих склонность моноциты перерастет пены клетки в наличие или...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы с благодарностью отметить работу профессор Уильям Мюллер и д-р Клэр Westhorpe за их ключевую роль в развитии более ранних итераций этой модели. Авторы также хотел бы поблагодарить AMREP потока цитометрии ядро для сортировки Моноцит подмножеств и Альфред больницы инфекционные заболевания группы клинических исследований медсестер для найма ВИЧ + людей для некоторых исследований. Авторы с благодарностью признать вклад в эту работу Виктория оперативной инфраструктуры программы поддержки полученных институтом Burnet. TAA поддерживается КМТИ университета вице-канцлера докторантура стипендий. Эта работа была поддержана NHMRC Грант проекта 1108792 присуждена AJ и AH. TK поддерживается NIH предоставляет низ K08AI08272, гранта NIH/NCATS # UL1TR000124.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<сильно>Гелевый препарат реагенты
NaOHSigma-Aldrich221465-500G0,1 M NaOH разведенный в H20
10x M199Sigma-AldrichM0650
AcCOOHSigma-Aldrich695092-100ML20 мМ Уксусная кислота разведенная в H20
Cultrex Bovine Collagen ЯR& D Systems3442-050-01Тип I Волокнистый коллаген
Название<strong>CompanyНомер в каталогеКомментарии
Клеточная культура
M199Life Technologies11150-059Среда M199, содержащая соли Эрла, L-глутамин и 2,2 г/л бикарбоната натрия.
Среда с добавлением 100 &; г/мл L-глютамина  и 100 ЕД/мл пенициллина/стрептомицина 
M20Добавка M199, содержащая 20% термоинактивированной объединенной или донорской сыворотки.
Отдельные виды липидов, такие как ЛПНП, могут быть добавлены к M199.
HUVECПервичные эндотелиальные клетки пуповины человека (HUVEC) могут быть выделены из пуповины, пожертвованной с информированного согласия и этического одобрения. Изолированный HUVEC также может быть приобретен на коммерческой основе.
коронарных артерий человекаПервичные эндотелиальные клетки коронарных артерий человека могут быть выделены из артерий, пожертвованных с информированного согласия и этического одобрения. Изолированные клетки также могут быть приобретены на коммерческой основе.
EDTABDH Merck10093.5VЭтилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) - 0,5 М, pH 8,0
EGTASigma-AldrichE3889-500GЭтиленгликоль-бис(&бета;-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N'-тетрауксусная кислота (EGTA) - 1 мМ, pH 8,0
0,05% трипсин EDTAGibco25300-0540,05% трипсин/0,53 ЭДТА (1X)
L-глутаминGibco25030-081L-глютамин (200 мМ)
Пенициллин/стрептомицин Gibco15140-122Пенициллин/стрептомицин (10 000 единиц/мл пенициллина и 10 000 &; г/мл стрептомицина)
Сыворотка для новорожденных телятGibco16010-142Сыворотка для новорожденных телят: новозеландское происхождение
ФибронектинSigma-AldrichF1056-1MGФибронектин - 50 &микро; г/мл аликвот приготовленный и хранящийся
PBS (1x)Gibco14200-075Фосфатный буферный физиологический раствор Дульбекко (10x): Разбавить до 1x стерильным H20
0,1% TNFGibcoPHC3015рекомбинантный человеческий TNF - восстановлен в H20 и хранится в 10 &микро; г/мл аликвоты
Липопротеины низкой плотностиMerck MilliporeLP2-2MGЛипопротеины низкой плотности (ЛПНП)
НазваниеCompanyНомер в каталогеКомментарии
Microscopy
1 или 2% формальдегидаPolysciences40181 или 2% формальдегид разбавленный стерильным H20
50% и 78% метаноломAjax Finechem318-2,5L GL50% или 78% v/v метанолом, разбавленным H20
Oil Red O красительSigma-AldrichO0625-25GРазведенный до 2 мг/мл в 22% 1М NaOH и 78% (v/v) метанол
предметные стеклаMikro-GlassS41104AMKДвойные матовые предметные стекла для микроскопа с углом наклона 45 градусов (25 X 76 мм)
Защитные стеклаMenzel-Glä serMENCS224015GP22 x 40 мм #1.5 размер стеклянных защитных накладок
Двусторонняя лента3M Scotch4011Сверхпрочная наружная монтажная лента (25,4 мм x 1,51 м)
Морилка GiemsaMerck Millipore1.09204.0500Раствор метиленового синего azur эозина Gimsa (разбавленный запас 1:10 в H20)
ДыроколРучной дырокол с одинарным отверстием (перфоратор 6,35 мм)
Name<strong>CompanyКаталожный номер>Комментарии
Проточная цитометрия
Collagenase DRoche Diagnostics11088858001Коллагеназа D, разведенная в среде M199 до 1 мг/мл 
35 & микро; m нейлоновая сетка с крышкой из полистирола FACS трубкиBD Biosciences35223535 &микро; m нейлоновая сетка с крышкой из полистирола FACS трубки
Живой/Мертвый Исправляемый Желтый Мертвый ПятноLife TechnologiesL34959Живое/Мертвое Исправляемое Желтое Мертвое Пятно
FACS СтиркаFACS Готовьтесь путем смешивания 1 x PBS-, 2 mM EDTA и 1% сыворотки для новорожденных телят
NameCompany<strong>Номер в каталоге Comments
Plasticware
96 луночная пластинаNunclon167008Delta поверхность плоскодонная 96 луночная пластина
10 см Чашка ПетриTPP93100Стерильная 10 см Чашка Петри 1,5
мл Eppendorf tubesEppendorf0030 125.150Eppendorf tubes
Transfer пипеткаSamco Scientific222-20SСтерильная трансферная пипетка (1 мл, большая колба)
Эндотелиальные клетки

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Napoli, C., et al. Fatty streak formation occurs in human fetal aortas and is greatly enhanced by maternal hypercholesterolemia. Intimal accumulation of low density lipoprotein and its oxidation precede monocyte recruitment into early atherosclerotic lesions. J Clin Invest. 100 (11), 2680-2690 (1997).
  2. Woollard, K. J., Geissmann, F. Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions. Nat Rev Cardiol. 7 (2), 77-86 (2010).
  3. Xu, L., et al. Foamy Monocytes Form Early and Contribute to Nascent Atherosclerosis in Mice With Hypercholesterolemia. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (8), 1787-1797 (2015).
  4. Jackson, W. D., Weinrich, T. W., Woollard, K. J. Very-low and low-density lipoproteins induce neutral lipid accumulation and impair migration in monocyte subsets. Scientific Reports. 6, 20038(2016).
  5. Angelovich, T. A., Hearps, A. C., Jaworowski, A. Inflammation-induced foam cell formation in chronic inflammatory disease. Immunol. Cell. Biol. 93 (8), 683-693 (2015).
  6. Llodrá, J., et al. Emigration of monocyte-derived cells from atherosclerotic lesions characterizes regressive, but not progressive, plaques. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (32), 11779-11784 (2004).
  7. Getz, G. S., Reardon, C. A. Animal Models of Atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 32 (5), 1104-1115 (2012).
  8. Meir, K. S., Leitersdorf, E. Atherosclerosis in the Apolipoprotein E-Deficient Mouse. A Decade of Progress. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24 (6), 1006-1014 (2004).
  9. Hilgendorf, I., Swirski, F. K. Making a difference: Monocyte Heterogeneity in Cardiovascular Disease. Curr. Atheroscler. Rep. 14 (5), 450-459 (2012).
  10. Rogacev, K. S., et al. Lower Apo A-I and Lower HDL-C Levels Are Associated With Higher Intermediate CD14++CD16+ Monocyte Counts That Predict Cardiovascular Events in Chronic Kidney Disease. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 34 (9), 2120-2127 (2014).
  11. Rogacev, K. S., et al. CD14++CD16+ Monocytes Independently Predict Cardiovascular Events: A Cohort Study of 951 Patients Referred for Elective Coronary Angiography. J. Am. Coll. Cardiol. 60 (16), 1512-1520 (2012).
  12. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro Cell Migration and Invasion Assays. J. Vis. Exp. (88), e51046(2014).
  13. Boyden, S. The Chemotactic Effect Of Mixtures Of Antibody And Antigen On Polymorphonuclear Leucocytes. J. Exp. Med. 115 (3), 453-466 (1962).
  14. Westhorpe, C. L. V., et al. Endothelial cell activation promotes foam cell formation by monocytes following transendothelial migration in an in vitro model. Exp. Mol. Pathol. 93, 220-226 (2012).
  15. Quinn, M. T., Parthasarathy, S., Fong, L. G., Steinberg, D. Oxidatively modified low density lipoproteins: a potential role in recruitment and retention of monocyte/macrophages during atherogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. 84 (9), 2995-2998 (1987).
  16. Henriksen, T., Mahoney, E. M., Steinberg, D. Enhanced macrophage degradation of biologically modified low density lipoprotein. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 3 (2), 149-159 (1983).
  17. Parthasarathy, S., Raghavamenon, A., Garelnabi, M. O., Santanam, N. Oxidized Low-Density Lipoprotein. Methods Mol. Biol. 610, 403-417 (2010).
  18. Muller, W. A., Weigl, S. A. Monocyte-selective transendothelial migration: dissection of the binding and transmigration phases by an in vitro assay. J. Exp. Med. 176 (3), 819-828 (1992).
  19. Maisa, A., et al. Monocytes from HIV-infected individuals show impaired cholesterol efflux and increased foam cell formation after transendothelial migration. AIDS. 29 (12), 1445-1457 (2015).
  20. Angelovich, T. A., et al. Ex vivo foam cell formation is enhanced in monocytes from older individuals by both extrinsic and intrinsic mechanisms. Exp. Gerontol. 80, 17-26 (2016).
  21. Westhorpe, C. L. V., et al. Effects of HIV-1 infection in vitro on transendothelial migration by monocytes and monocyte-derived macrophages. J. Leukoc. Biol. 85 (6), 1027-1035 (2009).
  22. Furie, M. B., Cramer, E. B., Naprstek, B. L., Silverstein, S. C. Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current. J. Cell Biol. 98 (3), 1033-1041 (1984).
  23. Müller, A. M., et al. Expression of the Endothelial Markers PECAM-1, vWf, and CD34 in Vivo and in Vitro. Exp. Mol. Pathol. 72 (3), 221-229 (2002).
  24. Kelesidis, T., et al. Predictors of impaired HDL function in HIV-1 infected compared to uninfected individuals. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. , (2017).
  25. Rogacev, K. S., et al. Monocyte heterogeneity in obesity and subclinical atherosclerosis. European Heart Journal. 31 (3), 369-376 (2010).
  26. Gacka, M., et al. Proinflammatory and atherogenic activity of monocytes in Type 2 diabetes. J. Diabetes Complications. 24 (1), 1-8 (2010).
  27. Rogacev, K. S., et al. CD14++CD16+ monocytes and cardiovascular outcome in patients with chronic kidney disease. Eur. Heart J. 32 (1), 84-92 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Monocyte TransmigrationFoam Cell FormationHuman Endothelial CellsCollagen MatrixFlow CytometryMicroscopy AnalysisOxidized LDLPatient Blood SamplesAtherogenic PotentialCollagen Gel Preparation

Related Articles