Методическая статья

Роговицы тканевая инженерия: В пробирке модель стромальные нерва взаимодействий человека роговицы

DOI:

10.3791/56308

⸱

24 января 2018 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Ophthalmology/Dean McGee Eye Institute, University of Oklahoma Health Sciences Center, 3Department of Physiology, Harold Hamm Diabetes Center, University of Oklahoma Health Sciences Center

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает Роман трехмерных в vitro модель, где роговицы стромальные клетки и дифференцированной нейрональные клетки культивировали вместе для оказания помощи в рассмотрении и понимания взаимодействия типов двух клеток.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Тканевая инженерия получила значительное признание из-за высокого спроса на человека роговицы замены с примерно 10 миллионов человек во всем мире, страдающих от роговицы зрение потери1. Для удовлетворения спроса на жизнеспособного человека роговицы, значительный прогресс в трехмерной (3D) ткани инженерных сделал2,3,4. Эти роговицы модели варьируются от простых монослоя систем многослойных моделей, ведущих к 3D полный Толщина роговицы эквиваленты2.

Однако использование 3D инженерии тканей роговицы в контексте в vitro модели заболеванием учился дата отсутствует сходство структуры многослойного 3D ткани роговицы, функции и сетей различных типов клеток (то есть, нерв, эпителий, строма и эндотелием)2,3. Кроме того возрос спрос на в vitro модели ткани роговицы в попытке уменьшить животных испытаний фармацевтической продукции. Таким образом чтобы лучше соответствовать систем для физиологических потребностей человека требуются более сложные модели, и развитие модели, которая является более актуальной для популяции пациентов является абсолютно необходимым. Учитывая, что несколько типов клеток роговицы, пострадавших от заболеваний и дистрофии, как кератоконус, диабетическая Кератопатия и Фукс, эта модель включает в себя 3D Сопредседатель культуры модель первичной роговицы фибробластов (HCFs) от здоровых доноров и нейроны от SH-SY5Y линия клетки. Это позволяет нам в первый раз для изучения взаимодействия между типами две ячейки в пределах человеческой ткани роговицы. Мы считаем, что эта модель может потенциально вскрыть основные механизмы, связанные с взаимодействия стромальные нервных заболеваний роговицы, которые демонстрируют повреждения нерва. Эта 3D модель зеркала основных анатомических и физиологических характер ткани роговицы в естественных условиях и может использоваться в будущем как инструмент для расследования роговицы дефектов, а также проверки эффективности различных агентов до животных тестирования.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В человеческом теле роговицы является наиболее плотно иннервируемые ткани. Нервы отвечают за различные ощущения, как прикосновение, боль, температура, а также играют важную роль в заживление ран, мерцание рефлексов, слезу производства и секреции5,6,7. В роговицы стромы нервных стволов возникают из послабляющие сплетения и радиально введите периферийных стромы роговицы. Стромальные нерв Организации параллельно с ламелями коллагена и они далее филиала в небольших брошюр, как они приступили к поверхностным стромы5,8. Нервных волокон далее проникать эпителиального пласта и таким образом, иннервация широко разбросаны по эпителия роговицы и стромы. Таким образом иннервации имеет важную роль в здоровых и больных состояние роговицы. В этом протоколе мы выявляем улучшения модели Роман 3D в пробирке , который является первым в своем роде для имитации взаимодействия стромальные нерва в естественных условиях . SH-SY5Y линия клетки была использована для этого исследования, как это один из самых известных, хорошо характеризуется линий, используемых для изучения нейрональных роста. SH-SY5Y клеточная линия была описана производить как сторонник субстрата (S-тип) и neuroblastic (N-тип) клетки, которые могут пройти transdifferentiation9. В результате даже несмотря на то, что эта линия клетки является производным от тройной последовательных subclone выбор N-типа клеток, он также содержит небольшое количество S-тип клеток, способных проходят дифференцировку в нейронах с помощью ретиноевой кислоты и мозга, полученных нейротрофических факторов9. Это представляет собой инструмент, который может привести к более глубокому пониманию роговицы осложнений, связанных с диабетической ретинопатии (DM) и других глазных заболеваний. Из-за трудностей, связанных с получением и культивирования нейроны от пациентов с глазной болезни эта модель 3D в vitro обеспечивает существенные последствия в изучении взаимодействия нейронов и сигнализации с стромы роговицы.

Часто больные условия влияют на различных тканях тела в очень больших масштабах, ведущих к угрозу качеству жизни. Глазной дистрофии являются общие осложнения часто ассоциируется с системными заболеваниями и привести к Потеря остроты или даже постоянного видения. Всеобъемлющие исследования часто необходимы для лучшего понимания состояния болезни, а также воздействие на клеточном уровне базальных. Для изучения последствий таких заболеваний, были разработаны различные модели в естественных условиях и в пробирке с помощью ткани, инженерных приложений. Ткани роговицы инженерных приложений имеют получил большой интерес в различных областях науки10,11,12,13,14, но есть еще крупные ограничения во время практического применения, включая роговицы графт отказов, инфекции и рубцов10,11,12,,1314. Есть несколько исследований, которые успешно разработаны и созданы различные в vitro модели3,,1516,17,18, 19,20,21,,2223,24,25,26. Модели 3D в vitro являются наиболее перспективных и большой научный интерес. 3D модели известны лучше зеркало в vivo сотовой и физиологических событий, которые являются критическими во время фиброз и ранение исцеления15,27,,28-29. Эти модели в vitro играют важную роль в поиске новых терапевтических подходов для лечения различных заболеваний включая роговицы осложнений. Несмотря на решающую роль иннервации роговицы функций был достигнут мало усилий для поощрения распространения периферических нервов в течение роговицы ткани инженерных конструкций2,3. Однако предлагаемые 3D в пробирке клеток конструкции имитировать ткани-мишени для достижения желаемого ткани функциональность.

В то время как диабетическая Кератопатия очевидное применение для модели, описанные здесь из-за дефектов нейронов, существует несколько других заболевания роговицы, которые могут принести пользу от человека в vitro модели, включая кератоконуса и Фукс дистрофии. Наши 3D модель выходит из этой перспективы и предлагает развитие представительства в vitro ткани роговицы оценить доставки лекарств и безопасность новой глазной лекарств.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол следует принципам Наблюдательный Совет университета Оклахомы медицинских наук Центр/институциональный (IRB #4509). Все части протокола встретился с принципами Декларации о Хельсинки. Роговицы образцы были получены от национального развития и научно-исследовательских института (НДРИ) и Ай Банк Оклахома львы.

1. изоляция первичных элементов

  1. После получения образцов тканей человека роговицы, передача тканей в 21,5 см2 Петри, содержащий 2 мл стерильного Дульбекко фосфат амортизированное saline (DPBS) (1 x).
  2. Скрип и удалите эпителия роговицы, позиционирование роговицы купол лицом вверх. Чтобы обеспечить полное удаление, соскрести эпителиального пласта, тщательно с использованием лезвие под углом 45°. Далее флип роговицы купол лицом вниз и тщательно соскрести эндотелия из стромы с лезвием бритвы под углом 45°, чтобы обеспечить полное удаление. Вымойте стромальные ткани с DPBS.
  3. Стромальные тканей мелко нарежьте, используя номер 10 хирургическое лезвие, сохраняя стромальные штук, мокрой на все время, с помощью DPBS. Забрать стромальные штук с стерильный пинцет и место в колбе T25 культуры без СМИ (4 или 5 кусков ткани 2 x 2 мм в колбу).
  4. Разрешить эксплантов присоединиться к нижней части колбы при 37 ° C для около 30-40 мин. После того, как соблюдение, медленно добавить минимум основных средних орла (EMEM) содержащий 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1% антибиотик/противогрибковое на колбе не нарушая эксплантов.
  5. Осторожно поместите колбу в инкубаторе при 37 ° C, 5% CO2. Оставьте эксплантов нетронутыми до тех пор, пока клетки начинают изоляции и перенос в колбу. После приблизительно 2-4 недель клетки должны достичь 100% слияния. После 100% слияния проход клетки путем удаления средства массовой информации культуры ткани и вымыть клетки с DPBS.
  6. Добавить трипсина в клетки и инкубировать их в 37° C. После примерно 5 минут Просмотр клетки под световой микроскопии для подтверждения, что они частный, а затем остановить протеолиза, добавляя свежий СМИ.
  7. Перевести суспензию клеток в 15 мл Конические трубки для центрифугирования в 1000 x g. удалить супернатант тщательно не нарушая гранулы и приостановить клетки в свежих EMEM 10% FBS 1% антибиотиков. Подсчитать количество ячеек и семян около 1 х 106 клеток в T75 культуры Фляга для дальнейшего расширения с свежими EMEM 1% FBS 1% антибиотиков.

2. первичное HCFs культуры и 3D конструкций Ассамблеи

  1. Чтобы собрать 3D конструкций из эксплантах ранее выращивают в EMEM 10% FBS 1% антибиотик/противогрибковое, проход и количество HCFs.
  2. Семя примерно 1 х 106 клеток/колодец первичных HCFs на поликарбоната вставки мембраны с порами 0,4 мкм из 3D конструкций, наряду с 1,5 мл свежего EMEM 10% FBS 1% антибиотик/противогрибковое в верхней части конструкции. Добавьте еще 1,5 мл же средства массовой информации в нижней части каждой конструкции.
  3. После 24 ч клеток посева, культура клетки с EMEM 10% FBS 1% антибиотик/противогрибковое, стимулируется с 0,5 мм 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic кислота (витамин С) добавления 1,5 мл на верхней и 1,5 мл в нижней части каждой конструкции.
  4. Поддержания культур в инкубаторе при 37 ° C, 5% CO2 на 3 недели и поставлять свежие средства массовой информации каждый день в течение всего рассматриваемого периода. Необходимо без дальнейшего прохождения.

3. сотовый дифференциации и Сопредседатель культур

  1. После 3 недель, добавить 8 x 103 клеток/хорошо клеток человеческой нейробластомы SH-SY5Y на вершине ранее собранный 3D конструкций содержащего 1,5 мл ЕМЕМ, содержащие 10% FBS, 1% антибиотик/противогрибковое и 0,5 мм 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic кислота (витамин С).
    1. Позволяют клеткам нейробластома SH-SY5Y расти на вершине стромальных клеток роговицы для по крайней мере 24 часа до начала дифференцировки клеток.
  2. Инициировать SH-SY5Y дифференцировки клеток, стимулируя ячейки с ЕМЕМ, содержащей 1% FBS и 1,5 мл 10 мкм ретиноевой кислоты на верхней части конструкции. Добавьте 1,5 мл EMEM 10% FBS 1% антибиотик/противогрибковое 0,5 мм 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic кислоты (витамин C) в нижней части конструкции. Обратите внимание, что шаг ретиноевой кислоты должна быть выполнена в темноте.
    1. Продолжать культуры клетки в этом дифференциация СМИ на 5 дней.
  3. Когда клетки достигают стадии дифференцировки, переключитесь в клетки 1,5 мл сыворотки свободных СМИ, содержащий 2 Нм мозга нейротрофического фактора (BDNF) и 1% антибиотик/противогрибковое добавляется ЕМЕМ, путем добавления к верхней части конструкции. Добавьте 1,5 мл EMEM 10% FBS 1% антибиотик/противогрибковое 0,5 мм 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic кислоты (витамин C) в нижней части конструкции. Обратите внимание, что BDNF шаг должен выполняться в темноте.
  4. Культура клетки для 2 дополнительных дней перед обработкой любого дальнейшего анализа как указано в таблице 1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рисунок 1 — шаг за шагом представитель изображение 3D в vitro рабочей модели. На первом шаге клетки изолированы от человеческого роговицы. Затем они выросли на мембране поликарбоната и стимулировали с витамином С собрать самостоятельно секретируемые 3D-матрицы. Эта 3D конструкции системы индуцирует синтеза многослойных сотовых в естественных условиях-как стромальные матрицы. После этого нейробластома клетки являются семенами на вершине стром...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несколько исследований были сосредоточены на разработке различных животных моделей, которые могут помочь в разработке более глубокого понимания заболевания роговицы, а также обнаружить лечения. Однако важное значение для людей из этих исследований не была проверена. На сегодняшний день, различные в vitro модели разработаны и широко расследование из-за их замечательные клиническое значение. Наша модель ранее установленных 3D в пробирке является роман системы, что значительно способствует достижений медиц...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют не конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы выразить искреннюю признательность д-р Бен Фаулер за его техническую помощь ТЕА экспериментов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Здоровая ткань роговицыNDRIОбразцы от доноров без травмы глаза или системного заболевания
Дульбекко s Фосфатный буферный раствор (1X)Gibco by Life Technologies14190-144
Стерильные щипцыFischer Scientific13-812-42Fisherbrand Рассекающие сверхтонкозаостренные щипцы
Однолезвийные бритвенные лезвияPersonna270100
Стерильные хирургические лезвия скальпеля No10Перьевое хирургическое лезвие2976#10
Eagle' s Минимальная незаменимая средаATCC30-2003
Фетальная сыворотка крупного рогатого скотаAtlanta BiologicalsS1155010% FBS требуется для приготовления среды
Антибиотик-антимикотик (100X)Gibco от Life Technologies15240-0621% Антибиотик-антимикотик требуется для приготовления среды
0,05% Трипсин ЭДТА(1X)Gibco от Life Technologies25300062
Мембранные вставки из поликарбоната с 0,4-&мкм; m порыCorning Costar3412
2-O-α-Dglucopyranosyl-L-аскорбиновая кислота (витамин С)Sigma-AldrichSMB00390-14Для исследования следует использовать концентрацию 0,5 мМ
Восковой блокVWR50-949-027
SH-SY5Y Клетки нейробластомыATCCSHSY5YATCC CRL-2266
Ретиноевая кислотаSigma-AldrichSRP3014-10UGНеобходимо использовать конечную концентрацию 10 мкМ
BDNFSigma-AldrichR2625-100MGНеобходимо использовать конечную концентрацию 2 нМ
Dimethylsulfoxide(DMSO)VWR-Alfa Aesar67-68-5Ultra Pure Grade-Sterile DMSO для использования
Thermo Scientific Nunc Cell Culture Processed EasYFlasks (T25)Fisher Scientific12-565-351
Thermo Scientific Nunc Cell Culture, обработанные EasYFlasks (T75)Fisher Scientific12-565-349

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).
  2. Rönkkö, S., Vellonen, K. -S., Järvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
  3. Ghezzi, C. E., Rnjak-Kovacina, J., Kaplan, D. L. Corneal tissue engineering: recent advances and future perspectives. Tissue Eng Part B Rev. 21 (3), 278-287 (2015).
  4. Shafaie, S., Hutter, V., Cook, M. T., Brown, M. B., Chau, D. Y. S. In Vitro Cell Models for Ophthalmic Drug Development Applications. BioResearch Open Access. 5 (1), 94-108 (2016).
  5. Shaheen, B. S., Bakir, M., Jain, S. Corneal nerves in health and disease. Surv Ophthalmol. 59 (3), 263-285 (2014).
  6. Beuerman, R. W., Schimmelpfennig, B. Sensory denervation of the rabbit cornea affects epithelial properties. Exp Neurol. 69 (1), 196-201 (1980).
  7. Heigle, T. J., Pflugfelder, S. C. Aqueous tear production in patients with neurotrophic keratitis. Cornea. 15 (2), 135-138 (1996).
  8. Wang, S., et al. In vitro 3D corneal tissue model with epithelium, stroma, and innervation. Biomaterials. 112, 1-9 (2017).
  9. Ross, R. A., Spengler, B. A., Biedler, J. L. Coordinate morphological and biochemical interconversion of human neuroblastoma cells. J Natl Cancer Inst. 71 (4), 741-747 (1983).
  10. Griffith, L. G., Naughton, G. Tissue engineering - Current challenges and expanding opportunities. Science. 295 (5557), (2002).
  11. Guo, X., et al. Morphologic characterization of organized extracellular matrix deposition by ascorbic acid-stimulated human corneal fibroblasts. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (9), 4050-4060 (2007).
  12. Karamichos, D. Ocular tissue engineering: current and future directions. J Funct Biomater. 6 (1), 77-80 (2015).
  13. Karamichos, D., Brown, R. A., Mudera, V. Collagen stiffness regulates cellular contraction and matrix remodeling gene expression. J Biomed Mater Res A. 83 (3), 887-894 (2007).
  14. Ruberti, J. W., Zieske, J. D. Prelude to corneal tissue engineering - gaining control of collagen organization. Prog Retin Eye Res. 27 (5), 549-577 (2008).
  15. Karamichos, D., Guo, X. Q., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Human corneal fibrosis: an in vitro model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (3), 1382-1388 (2010).
  16. Chen, F. M., Liu, X. Advancing biomaterials of human origin for tissue engineering. Prog Polym Sci. 53, 86-168 (2016).
  17. Priyadarsini, S., Sarker-Nag, A., Rowsey, T. G., Ma, J. X., Karamichos, D. Establishment of a 3D In Vitro Model to Accelerate the Development of Human Therapies against Corneal Diabetes. PLoS One. 11 (12), e0168845(2016).
  18. Karamichos, D., Hjortdal, J. Keratoconus: tissue engineering and biomaterials. J Funct Biomater. 5 (3), 111-134 (2014).
  19. Wilson, S. L., Yang, Y., El Haj, A. J. Corneal Stromal Cell Plasticity: In Vitro Regulation of Cell Phenotype Through Cell-Cell Interactions in a Three-Dimensional Model. Tissue Engineering Part A. 20 (1-2), 225-238 (2014).
  20. Proulx, S., et al. Reconstruction of a human cornea by the self-assembly approach of tissue engineering using the three native cell types. Molecular Vision. 16 (234-236), 2192-2201 (2010).
  21. Gonzalez-Andrades, M., et al. Establishment of a novel in vitro model of stratified epithelial wound healing with barrier function. Sci Rep. 6, 19395(2016).
  22. Hopkins, A. M., DeSimone, E., Chwalek, K., Kaplan, D. L. 3D in vitro modeling of the central nervous system. Prog Neurobiol. 125, 1-25 (2015).
  23. Schulz, S., et al. Natural Corneal Cell-Based Microenvironment as Prerequisite for Balanced 3D Corneal Epithelial Morphogenesis: A Promising Animal Experiment-Abandoning Tool in Ophthalmology. Tissue Engineering Part C-Methods. 20 (4), 297-307 (2014).
  24. Gao, J., Wang, Y., Zhao, X., Chen, P., Xie, L. MicroRNA-204-5p-Mediated Regulation of SIRT1 Contributes to the Delay of Epithelial Cell Cycle Traversal in Diabetic Corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1493-1504 (2015).
  25. Koulikovska, M., et al. Enhanced regeneration of corneal tissue via a bioengineered collagen construct implanted by a nondisruptive surgical technique. Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 1116-1130 (2015).
  26. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in retinal and eye research. 49, 17-45 (2015).
  27. Zieske, J. D. Extracellular matrix and wound healing. Curr Opin Ophthalmol. 12 (4), 237-241 (2001).
  28. Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model. J Tissue Eng Regen Med. 5 (8), e228-e238 (2011).
  29. Karamichos, D., Lakshman, N., Petroll, W. M. An experimental model for assessing fibroblast migration in 3-D collagen matrices. Cell Motil Cytoskeleton. 66 (1), 1-9 (2009).
  30. Karamichos, D., et al. Novel in Vitro Model for Keratoconus Disease. J Funct Biomater. 3 (4), 760-775 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SH SY5Y3DC

Похожие статьи