Assay для Транспозаза-доступные Chromatin, в сочетании с высокой пропускной способностью последовательности (ATAC-seq) является геном общесистемной методом для выявления доступных хроматина. Это шаг за шагом протокол ATAC-seq, от молекулярных окончательного вычислительной анализу, оптимизированный для лимфоцитов человека (Th1/Th2). Этот протокол может быть принят исследователи без предварительного опыта в методах секвенирование нового поколения.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Картирование генома всей доступной хроматина в основной человеческий Т-лимфоцитов, ATAC-Seq
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Assay для Транспозаза-доступны Chromatin с высокой пропускной способностью последовательности (ATAC-seq) — это метод, используемый для идентификации открытых (доступный) регионов хроматина. Эти регионы представляют регуляторных элементов ДНК (например, промоутеров, усилители, локус контроля регионов, изоляторы), в котором транскрипции факторов привязки. Отображение доступных хроматина пейзаж является мощный подход для выявления активных нормативных элементов по всему геному. Эта информация служит беспристрастный подход для обнаружения сети соответствующих транскрипционных факторов и механизмов структуры хроматина, которые управляют программами выражения гена. ATAC-seq является надежной и чувствительных альтернативой DNase I Гиперчувствительность анализ в сочетании с следующего поколения последовательности (DNase-seq) и при содействии формальдегида изоляции регуляторных элементов (Фэр seq) для анализа генома общесистемной хроматина доступность и последовательность Микрококковая Нуклеаза чувствительных участков (MNase-seq) для определения позиционирования нуклеосома. Мы представляем подробную ATAC-seq протокол, оптимизированный для человека первичной иммунной клетки т.е. CD4 + лимфоцитов (Т-хелперами 1 (Th1) и Th2 клетки). Этот всеобъемлющий протокол начинается с клетки урожая, а затем описывает молекулярное процедура tagmentation хроматина, пробоподготовка для виртуализации нового поколения и также включает методы и соображения для вычислений анализа используется для интерпретировать полученные результаты. Кроме того чтобы сэкономить время и деньги, мы ввели меры контроля качества для оценки ATAC-seq библиотеки до последовательности. Важно отметить, что принципы, изложенные в настоящем Протоколе позволяют его адаптации в другие клетки человека иммунной и неиммунизированных начальных и клеточных линий. Эти руководящие принципы также будут полезны для лабораторий, которые не владеют методами секвенирование нового поколения.
Введение
ATAC-seq1,2 — надежный метод, который позволяет идентифицировать регулирования3 открытых хроматина регионов и позиционирования нуклеосома. Эта информация применяется для определения местоположения, личность и активности транскрипционных факторов. Чувствительность метода для измерения количественных различий в структуре хроматина позволяет изучение деятельности хроматина факторов, включая хроматина ремонтом и модификаторов, а также транскрипционный анализ деятельности РНК полимеразой II1. Таким образом ATAC-seq обеспечивает мощный и непредвзятого подхода для расшифровки механизмов, которые регулируют регуляцию в любой тип клеток интереса. Мы описываем адаптации ATAC-seq для первичного Th1 и Th2 клетки человека.
В ATAC-seq гиперактивный Tn5 Транспозаза загружен с переходниками для следующего поколения последовательности (НГС) пары фрагментацию ДНК с разметкой ДНК с адаптеров (т.е., процесс «tagmentation»)1. После амплификации PCR в результате библиотеки ДНК готовы для следующего поколения последовательности (рис. 1). Льготные tagmentation доступных хроматина обнаруживается анализ местного обогащения ATAC-seq последовательность читает.
Короткие экспериментальной процедуры и требования для меньше исходного материала, относительно других методов для измерения доступности хроматина и nucleosomal позиционирования DNase-seq4, Фэр seq5и6MNase-seq имеет поощрять использование ATAC-seq в нескольких биологических систем, включая человеческие клетки первичной1,7 и8клинических образцов, а также одноклеточные организмы9,10растений, плодовых мух11 и различных млекопитающих12.
Личность транскрипции, факторы, которые связаны с доступными локусов можно обнаружили анализ обогащения их мотивы последовательности привязки или сочетаются ATAC-seq chromatin иммунопреципитации (чип) следуют высок объём (секвенирование ДНК ChIP-seq). Этот подход позволил идентификации линии специфических транскрипционных факторов важно для кроветворения в мыши13. Беспристрастной и глобальный характер ATAC-seq позволяет изучение гена регулирование в организмов, для которых реагенты, такие как антитела для анализа чипа не доступны. Например, эволюционные изменения в СНГ-регулирования регионах были определены путем изучения черепной нейронные крест клетки человека и шимпанзе14, развития изменения в регуляторных элементов во время ранних мыши Эмбриогенез15, изменения в нормативно-правовой ландшафт во время жизненного цикла одноклеточными C. owzarzaki9и эволюция промоутеров и усилители через 20 млекопитающих видов12.
ATAC-seq также играет важную роль для измерения доступности хроматина в одиночных клетках, таким образом показывая изменчивость в клеточных популяций, который обычно избегает генома общесистемного исследования7,16. Кроме того ATAC-seq может использоваться для изучения изменений, которые происходят в ДНК нормативных областях в условиях заболевания, в которых образцы редки. К примеру, ATAC-seq может использоваться для изучения изменений в нормативно-правовой ландшафт во время наступления острый миелоидный лейкоз (ОМЛ)17 или рас-driven онкогенеза11.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
все процедуры были одобрены Советом институциональный обзор Бар-Иланского университета и протокол руководящим комитетом, утверждении экспериментов.
1. очищение от наивного CD4 + клеток человека и поляризации T вспомогательный 1 (Th1) и Th2 клетки
Примечание: здесь мы описываем процедуры, начиная от замороженных периферической крови человека мононуклеарных клеток (получения). Первый шаг состоит из изоляции CD4 + клеток, используя микрошарики и столбцы, обычно дают нам больше, чем 95% CD4 + клеток. Однако этот шаг может варьироваться в зависимости от предпочтительного протокола в каждой лаборатории. Протокол для активации Т-клеток и поляризации был изменен от Дженнера и др. (2009) 18. изоляции CD4 + клеток от 10 миллионов получения дает подняться до 4-6 млн CD4 + клеток. Они разделены на две фляги и вырос под Th1 и Th2 поляризационный условия урожайность 3-5 миллионов Th1 и Th2 клетки в течение всего за неделю.
Примечание: остыть центрифуге до 4 ° C перед началом.
- Размораживание 1 мл человека репликацию (10 7 клеток) в Тюбик 50 мл, содержащие 10 мл среды RPMI, дополненная 1% пенициллина и стрептомицина, 2 мм L-глютамина и 10% тепло инактивированная плода бычьим сывороточным. Центрифуга на 500 g x 5 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки с пипеткой стерильные 25 мл 15 мл дополнениями RPMI среды. Передать колбу T75 культуры клетки (с 25 мл стерильной пипеткой).
- Оставить клетки на ночь в увлажненные инкубатора (37 ° C, 5% CO 2).
- Плавающий клетки с 25 мл стерильной пипеткой передать Тюбик 50 мл. Определение количества клеток и жизнеспособности путем исключения Трипановый синий.
- Изолировать CD4 + клеток от 10 миллионов живут не сторонник получения положительных выбор с помощью CD4 + микрошарики и столбцов в зависимости от производителя ' s рекомендации (см. Таблицу материалов/оборудования) со следующим модификации: 10 7 получения помечены с 30 мкл CD4 микрошарики в 120 мкл 0,5% BSA в PBS.
- Активировать CD4 + Т-клеток для 72 h rhIL-2 (10 нг/мл), плита прыгните анти CD3 (5 мкг/мл) и водорастворимые анти CD28 (2 мкг/мл). Th1 поляризации добавьте rhIL-12 (20 нг/мл) и анти Ил-4 (10 мкг/мл). Для Th2 поляризации, добавить rhIL-4 (40 нг/мл) и анти IFN-γ (10 мкг/мл).
- Культура клетки для дополнительные 7 дней при наличии rhIL-2 (10 нг/мл) и же поляризационный цитокинов (rhIL-12 для Th1 и rhIL-4 для Th2).
2. Изоляции ядра
Примечание: ATAC-seq выполняется с нетронутыми ядрами. Содержащий буфера lysis 0,05% nonylphenyl полиэтилен гликоль (см. Таблицу материалы/оборудование) был откалиброван для изоляции ядра от первичного Th1 и Th2 клетки человека. Мы рекомендуем, калибровка этот шаг с лабораторных реагентов и клетки. Избыток нетронутым клеток от недостаточной моющих средств снижает эффективность реакции переноса. Лизис клеток эффективность определяется количество ядер (Трипановый синий позитивные клетки) относительно общего числа клеток.
Примечание: Подготовьте литического буфера (10 мм трис-HCl, pH 7.5, 10 мм NaCl, 3 мм MgCl 2). Остыть центрифуга с ротором свинг ведро до 4 ° C. грануляции клетки в центрифугу свинг ведро вместо центрифуги фиксированный угол уменьшает потери клеток/ядер. Чтобы избежать ядрах или клетки потери, накапайте тщательно когда отбрасывая супернатант.
- Добавить свежие nonylphenyl Полиэтиленгликоль (до конечной концентрации 0,05%) и 100 x ингибиторы протеазы (до конечной концентрации 1 x) для холодной литического буфера непосредственно перед использованием. Сохранить буфер на льду
- Количество Т-клетки для определения их количества и жизнеспособности, с помощью метода Трипановый синий. Жизнеспособность, что меньше, чем 90% результатов в более высоких неспецифических пищеварение.
- Передачи 0,5 x 10 6 T клетки (Th1 или Th2) для 1.5 мл пробирок. Спин вниз на 500 g x 5 мин на 4 ° C.
- Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл холодного фосфат амортизированное (PBS) физраствора. Спин вниз на 500 g x 5 мин на 4 ° C.
- Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл холодного литического буфера (содержащие nonylphenyl полиэтиленгликоль и ингибиторы протеазы). Держите трубку на льду. Пипетка осторожно, чтобы избежать нарушения ядер.
- Быстро принять 10 мкл и подсчитать количество ячеек с автоматизированной клеток счетчиком пока Микропробирка с лизированных клетках на льду. Этот шаг не должна превышать пяти минут, чтобы избежать повреждения ядра. По крайней мере 80% клеток должен быть лизированы.
- Продолжить сразу с транспозицией реакции. Держите подготовлен ядер на МКО.
3. Реакции переноса
Примечание: В этот шаг, изолированные ядер инкубируют с эукариотами Tn5 Транспозаза (ТДЕ1) загружен с адаптерами для секвенирования NGS. Гиперактивный Tn5 одновременно фрагменты ДНК и ligates адаптеры в доступных районах генома (процесс tagmentation). Соотношение между ядрами и Tn5 Транспозаза имеет решающее значение для преференциального расщепление на доступных хроматина. Этот протокол откалиброван для 100 000 ядер в 100 мкл реакции тома. Однако, реакция может быть уменьшен.
- Значение температуры в шейкере тепловой до 37 ° C.
- Передачи 100000 ядер до 1,5 мл микропробирок.
- Центрифуг в 500 x g 10 мин при температуре 4 ° C и аккуратно удалить супернатант.
- Добавить компоненты реакции переноса ядер как указано в таблице 1.
- Ресуспензируйте, нежный закупорить.
- Инкубировать транспонирования реакции в шейкере тепловой при 37 ° C за 30 мин с нежно тряска (500 об/мин).
Примечание: Твердофазный реверсивные иммобилизации бисер 19 производится очистка ДНК (см. Таблицу материалы/оборудование) или ПЦР очистки столбцы. В конце очистки элюировать ДНК фрагментов в 20 мкл 10 мм трис-HCl, рН 8. Избегайте ЭДТА в Элюирующий буфер.
4. ПЦР обогащения ATAC-seq библиотек
Примечание: этот шаг призван усилить ATAC-seq библиотеки т.е. фрагментов ДНК с вставленной адаптеры. Чтобы разрешить смешивания нескольких библиотек ATAC-seq в той же последовательности следующего поколения полосы (" мультиплексирования ") неиндексированные использование праймера 1 (Ad1_noMx) 1 для всех образцов, и различные индексированные (со) 2 праймера (Ad 2.1-2.24) 1 для каждого образца. В дополнить Таблицу материалов/оборудования предоставляются последовательностей праймера.
- Амплификации PCR первоначальный
Примечание: Рабочая концентрация праймера 1 (Ad1_noMx) и 2 праймера – 25 мкм. Все праймеры разводят из оригинального запас 100 мкм до 25 мкм. Во всех реакциях PCR использование праймера 1 (Ad1_noMx) и только один из индексированного 2 праймера.- Добавить компоненты реакции PCR как указано в таблице 2 в стерильную ПЦР-пробирку.
- Место ПЦР трубки в тепловая велосипедист и выполнять амплификации PCR используя Велоспорт условий, подробно изложены в таблице 3.
- Оценки числа циклов дополнительного усиления
Примечание: количество дополнительных циклов PCR должна принести достаточное количество библиотеки фрагментов fили успешной виртуализации следующего поколения работать, в то время как свести к минимуму, чтобы избежать GC и размер смещения 20. Определение числа циклов PCR (N), необходимых для оптимального библиотека фрагмент амплификации делается путем количественного PCR (ПЦР).- Развести 1 грунтовки (Ad1_noMx) и 2 (используется для усиления первоначальной библиотеки) от 25 мкм до 6,25 мкм.
- Добавить компоненты оптические трубы ПЦР или тарелку, как указано в таблице 4.
- Место в инструмент ПЦР и цикл как указано в таблице 5.
- Оценить требуемое количество дополнительного усиления циклов (N), участок номер цикла на оси x и относительной флуоресцирования (РФС) на оси y.
- Количество дополнительного усиления циклов (N)-1/3 от числа циклов, в которых реакции ПЦР достигли плато. на рисунке 2 приведены примеры для трех ATAC-seq библиотек, которые достигли плато на ~ 2350 единиц относительной флуоресценции, РФС (густой зеленой линии). Число циклов PCR, в которых усиливается одну треть от суммы максимальной (783 РФС, отмеченные на оси y) соответствует 8 циклов для двух библиотек (красный и синий амплификации кривых) и 9 циклов PCR для третьего библиотеки (розовый).
- Окончательный ПЦР-амплификации
- усиливают оставшиеся 45 мкл реакции PCR. Место ПЦР-пробирки, содержащие усиление реакции от шага 4.1.2 в тепловая велосипедист. Запустите программу PCR, описанные в таблице 6. Используйте ранее определенных (шаг 4.2.5) количество циклов амплификации (N).
5. Размер выбор ATAC-Seq библиотек
Примечание: наш опыт показывает, выбор размера усиливается ATAC-seq библиотек улучшает результаты секвенирование нового поколения, потому что он устраняет высокомолекулярного библиотеки фрагментов из Окончательный библиотека ATAC-seq.
Примечание: Разрешить магнитные шарики в теплой комнатной температуре 30 мин перед использованием.
Подготовьте свежие 70% этанола в свободной от нуклеиназы воды.
- Ресуспензируйте магнитные бусы, смешивая.
- Добавить нуклеиназы свободной воды на ATAC-seq библиотеки (полученные на шаге 4.3.1.) и довести до 100 мкл.
- Добавьте 50 мкл (0.5 x) ресуспензированы ДНК связывающих магнитные шарики до 100 мкл усиливается библиотек. Смешайте закупорить вверх и вниз по крайней мере 10 раз. Проинкубируйте образцы для 5 мин при комнатной температуре. При необходимости, быстро вращаться вниз микропробирок.
- Место трубки на соответствующие магнитного стенд за 2 мин отделить магнитные шарики от супернатант. Через 2 мин, супернатанта передать новый Микропробирка.
- Измерить объем супернатанта, закупорить и добавить 0.7 x магнитных шариков. Микс, закупорить вверх и вниз по крайней мере 10 раз.
- Инкубировать 5 мин при комнатной температуре. Место на магнитного стенд на 2 мин
- После 2 минут инкубации, удалить супернатант. Добавить 200 мкл свежеприготовленные 70% этанол мыть бисер, пока трубы на магнитную подставку.
- Держите Микропробирка на магните для 30 s и затем отмены этанола. Повторите шаг 5.7.for два окончательный этанола смывки.
- Полностью удалить оставшиеся этанола и пусть бусы воздушно-сухой для 5 минут пока трубку на магните. При необходимости, кратко спина микропробирок. Удаление следов этанола с кончиком пипетки p10.
- Удаление Микропробирка из магнита и 22 мкл 10 мм трис-HCl, рН 8. Не элюировать ATAC-seq библиотек в буфер, содержащий ЭДТА.
- Инкубировать трубки для 2 мин при комнатной температуре, а затем поместить на магнитную подставку.
- Когда решение ясно, передать новым стерильным Микропробирка 20 мкл eluted библиотек.
- Магазин размер выбранных ATAC-seq библиотек в -20 ° с.
6. Анализ качества ATAC-Seq библиотек
- проверки качества ATAC-seq библиотек в реальном масштабе времени PCR
Примечание: важно оценить соотношение сигнал-шум ATAC-seq библиотек до следующего поколения последовательности. Это делается путем определения относительного количества фрагментов ДНК из доступных и недоступных локусов, с использованием количественного PCR (ПЦР). Недоступных локусов (отрицательный контроль, chr1:48, 137, 860-48,137,934 и chr1:193, 093, 748-193,093,827) усиливается пары праймера 1 и 2. Доступных локусов (положительный контроль, chr19:30, 336, 166-30,336,253 и chr19:11546154-11546237) усиливается грунтовка пар 3 и 4. Позитивные и негативные локусов были определены от хроматина доступности (DHS-seq) профили CD4 + клеток человека (ENCODE присоединения ENCSR000EQE и ENCSR000EQG). Отрицательный грунтовка 1 расположен в большой гетерохроматиновые intergenic регионе (230 kb из TRADB2 и 88 КБ от FOXD2). Отрицательный контроль регион 2 находится в в первый Интрон гена CDC73. Положительное, что грунт пара 3 находится в пределах региона открытым хроматина течению циклин E (CCNE1) гена при положительных грунтовка пара 4 располагается в промоутер протеин киназы C субстрата 80 K-H (PRKCSH). Важно отметить, что эти управления локусов показывают аналогичная картина доступности в других типах клеток человека от проекта ENCODE 3, предполагая, что они могут применяться для мониторинга ATAC-seq библиотек от широкого спектра типов клеток человека. Грунтовка эффективность и специфику всех пар грунт был подтверждена ПЦР на серийный разрежения геномной ДНК (от клеток человека Th) и плавления кривой анализ получаемой продукции усиливается.- Изолировать геномной ДНК, использование коммерчески доступных комплект (см. Таблицу материалов/оборудования).
- Развести усиливается ATAC-seq библиотеки 1:10 (1 мкл библиотека + 9 мкл нуклеиназы свободной воды) и ~ 5 нг/мкл геномной ДНК.
- Подготовить реакционную смесь (Таблица 7) для каждой пары праймера положительной и отрицательной контроля, принимая во внимание, что реакции выполняются в трех экземплярах.
- Инкубировать в ПЦР тепловая велосипедист согласно протоколу, рекомендованный поставщик мастер смесь ПЦР.
- Анализ результатов ПЦР инструмент ' s программного обеспечения (см. Таблицу материалов/оборудования). Выберите геномной ДНК как образец элемента управления. Полученные значения представляют собой обогащение доступных областей (усиленный, положительный контроль грунты). Пример приведен в таблице 8.
Примечание: Оценки среднего библиотека размера и концентрации: распределение размера фрагментов ДНК из библиотек ATAC-seq определяется автоматизированной электрофореза высок чувствительности систем согласно данным производителя ' s инструкции. Это целесообразно для измерения концентрации образца на флюорометр с помощью комплекта dsDNA высок чувствительности и по крайней мере 2 мкл каждого образца ДНК.
Примечание: Секвенирование нового поколения - до мультиплексирования библиотек, рассчитать Молярность каждой ATAC-seq библиотеки с использованием формулы: (6 нг/мкл x 10) / (660 x средняя библиотека фрагмент длиной). Цель для > 30 миллионов читает каждой библиотеки ATAC-seq для оценки открытых хроматину регионами образцах. Если вы хотите определить, если библиотека является достаточно хорошим для секвенирования NGS, первоначально цель чтений (5% от последовательности Лейн на инструменте секвенирования ДНК в режиме быстрого выполнения) ~ 10 млн. Имейте в виду, что для выведения нуклеосома позиционирования, в паре конец последовательности необходимых 1.
7. Анализ полученных результатов секвенирования следующего поколения
- вывести качество чтения последовательности, проверяя файлы FastQC, отдельно для каждой библиотеки.
- Выравнивание читает генома человека ссылка (сборка hg19) с помощью Боути 21 программного обеспечения в среде Unix/Linux. Команда ' Боути -m 1 - q -S генома каталог reads.fastq output_aligned.sam '. Геном каталог стоит для папки, где хранятся индексы генома Bowtie. Параметр -m 1 предназначен для не позволяя выравнивание читает для более чем одного локуса в геноме, - q для входного файла, который должен быть в формате fastq, -S для вывода в формате SAM.
- Удалить дубликаты считывает параметр SAMtools 22 rmdup в среде Unix/Linux. Команды являются ' samtools посмотреть -S output_aligned.sam -b | SAMtools сортировка -o-output_aligned > output_aligned.bam ',
samtools rmdup -s output_aligned.bam output_aligned _rmdup.bam '. Первая команда, вид, изменяет формат Сэм в БАМЕ формат, который затем сортируется. Параметр rmdup применяется на файле отсортированных BAM. При необходимости можно регулировать читает для вставки сайт transposon, как описано в оригинальной ATAC-seq документ 1. Это делается с помощью BEDtools команды 23 в среде Unix/Linux. Команды являются ' bamToBed -i output_aligned _rmdup.bam > output_aligned _rmdup.bed ', ' shiftBed -i геном 4 - м-5 - g -p _rmdup.bed output_aligned > output_aligned _rmdup_adjusted.bed '. Первая команда, bamTobed, изменяет формат BAM в постели формат, который может затем использоваться для команды shiftBed. Геном файл является файлом с разделителями табуляции, содержащий длину каждой хромосомы в геноме. Обычно добавляется файл в папке BEDtools. - Выполнять пик вызова с помощью анализа на основе модели чип seq (MACS2) 24 программного обеспечения в среде Unix/Linux на сдвинутые кровати файл со следующими параметрами:--nomodel--extsize 75--сдвиг -30. Эти параметры используются для настройки операций чтения, таким образом, чтобы вставки сайт transposon в середине каждой последовательности чтения.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Окончательный результат этого протокола является библиотека ATAC-seq обычно 3-20 нг/мкл. При запуске в системе для анализа целостности ДНК (см. Таблицу материалов/оборудования), они показывают внешний вид лестницы как2 (рис. 3A). Средний размер фрагментов ДНК обычно составляет ~ 450-530 bp.
Надлежащий контроль качества ATAC-seq библиотек до выполнения следующ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
ATAC-seq протокол, описанный здесь успешно применяются для анализа доступных хроматина в Главные ячейки (человека Th1, Th2 клетки и клетки B) а также искусственный клеточных линий (MCF10A молочной железы человека раковые клетки и клетки U261 глиобластома). Применение ATAC-seq в другие типы клеток, может потребовать некоторых оптимизации протокола, особенно в лизис шаг. При слишком высокой концентрации неионогенных моющего средства, возможно, более высокий процент загрязнения митохондриальной ДНК. Это может быть сокращен ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Эта работа поддерживается Фондом науки Израиля (Грант 748/14), Мари Кюри интеграции Грант (CIG) - FP7-люди-20013-сиг-618763 и -CORE программа планирования и составления бюджета Комитет и фонд науки Израиль Грант № 41/11.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Пробирки на 50 мл | Lumitron | LUM-CFT011500-P | можно от других производителей. |
| Микротрубки | Axygen Inc | MCT-175-C | могут быть от других поставщиков. |
| Серологические пипетки на 25 мл | Corning Costar | 4489 | Можно от других поставщиков. |
| Колба для культуры тканей | Lumitron | LUM-TCF-012-250-P | может быть от других поставщиков. |
| Countes Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| NucleoSpin Tissue | MACHEREY-NAGEL | 740952.5 | |
| Мононуклеарные клетки периферической крови ( PBMC) | ATCC | PCS 800&semb; 011 | Может быть от других поставщиков. |
| RPMI 1640 Medium | Biological Industries | 01-103-1A | Может быть от других поставщиков. |
| Раствор L-глютамина (200 мМ) | Биологическая промышленность | 03-020-1B | Можно от других поставщиков. |
| Пенициллин-стрептомицин | Biological Industries | 03-031-1B | Может быть от других поставщиков. |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS), Инактивированный при нагревании, европейский класс | Biological Industries | 04-127-1 | Может быть от других поставщиков. |
| Микрогранулы MACS CD4, человеческий | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| Колонки MACS MS | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Античеловеческий CD4 FITC | Biogems | 06121-50 | |
| Мышиный контроль изотипа IgG1 FITC | Biogems | 44212-50 | |
| Античеловеческий CD3 (OKT3) | Tonbo biosciences | 40-0037 | |
| Античеловеческий CD28 SAFIRE Purified | Biogems | 10311-25 | |
| Рекомбинантный человеческий IL2 | Peprotech | 200-02 | |
| Рекомбинантный человеческий IL4 | Peprotech | 200-04 | |
| Рекомбинантный человеческий IL12 p70 | Peprotech | 200-12 | |
| In vivo готовый античеловеческий IL-4 (MP4-25D2) | Tonbo | 40-7048 | |
| LEAF Очищенный античеловеческий ИФН-&гамма; | BioLegend | 506513 | |
| NaCl, аналитический класс | Carlo Erba | 479687 | Может быть от других поставщиков. |
| Хлорид магния, гексагидрат, молекулярная биология класса | Calbiochem | 442611 | может быть от других поставщиков. |
| EDTA | MP Biomedicals | 800682 | может быть от других поставщиков. |
| Tris, ультрачистый, 99,9% чистый | MP Biomedicals | 819620 | Может быть от других поставщиков. |
| Альтернатива NP-40 (Нонилфенилполиэтиленгликоль) | Calbiochem | 492016 | может быть от других поставщиков. |
| Ингибиторы протеазы | Sigma | P2714 | этот ингибитор протеазы коктейль представляет собой порошок. Для приготовления 100 х раствор развести в 1 мл воды молекулярно-биологического класса. |
| Магнитные твердофазные бусины обратной иммобилизации: бусины AMPure XP | Beckman | 63881 | |
| Набор для очистки ПЦР | HyLabs | EX-GP200 | могут быть других производителей. |
| Набор для подготовки библиотеки ДНК Nextera (транспозаза TDE1 и буфер TD) | Illumina | FC-121-1030 | |
| NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | |
| NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix | New England BioLabs | M0543 | |
| SYBR Green I | Инвитроген | S7585 | |
| CFX Connect Real-Time PCR Обнаружение Система | Bio-rad | 185-5200 | может быть от других поставщиков. |
| Программное обеспечение CFX Manager | Bio-rad | 1845000 | |
| master mix для qPCR: iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5124 | Может быть от других поставщиков. |
| Флюориметр Qubit 2.0 | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| Магнит для пробирок eppendorf | Invitrogen | 12321D | Может быть от других поставщиков. |
| Качающаяся центрифуга охлаждения с ведрами для пробирок сокола объемом 15 мл и пробирок Eppendorf | Thermo Scientific | 75004527 | может быть от других поставщиков. Важно, чтобы в нем были ведра для трубок Эппендорфа. |
| Термошейкер | MRC | может быть от других поставщиков. | |
| Высокочувствительная лента D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| Высокочувствительная реагенты D1000 | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| 4200 Система TapeStation | Agilent Technologies | G2991AA | Ленточная платформа для электрофорез |
| Высокочувствительный набор ДНК | Agilent Technologies | 5067-4626 | Реагент для высокочувствительный анализ |
| Праймер Название и последовательность | Компания | ||
| Ad1_noMX: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACTCGTCGGCAGCGTC AGATGTG-3'IDT | Ad1-noMx: 5'-P5 sequence-transposase sequence-3'Ad2.1_TAAGGCGA | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGAGGGCATACGAG AT[TCGCCTTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.1_expected индексная последовательность читается: 5'-P7 sequence-[индексная последовательность]-транспозаза последовательность-3'Ad2.2_CGTACTAG | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGGGCATACGAG AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.2_expected индексная последовательность читается: 5'-P7 sequence-[индексная последовательность]-транспозаза последовательность-3' | ||
| Ad2.3_AGGCAGAA: 5'-CAAGCAGAAGAGGGCATACGA GAT[TTCTGCCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.3_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'Ad2.4_TCCTGAGC | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGAGGGCATACGAG AT[GCTCAGGA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.4_expected индексная последовательность читается: 5'-P7 sequence-[индексная последовательность]-транспозазная последовательность-3'Ad2.5_GGACTCCT | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGAGGGCATACGA GAT[AGGAGTCC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.5_expected индексная последовательность читается: 5'-P7 sequence-[индексная последовательность]-транспозаза последовательность-3'Ad2.6_TAGGCATG | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGGGCATACGA GAT[CATGCCTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.6_expected индексная последовательность читается: 5'-P7 sequence-[индексная последовательность]-транспозаза последовательность-3'Ad2.7_CTCTCTAC | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GTAGAGAG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.7_expected индексная последовательность читается: 5'-P7 sequence-[индексная последовательность]-транспозазная последовательность-3' | ||
| Ad2.8_CAGAGAGG: 5'-CAAGCAGAAGAGGGCATACGA GAT[CCTCTCTG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.8_expected индексная последовательность читается: 5'-P7 sequence-[индексная последовательность]-транспозаза последовательность-3'Ad2.9_GCTACGCT | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGGGCATACGA GAT[AGCGTAGC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.9_expected индексная последовательность читается: 5'-P7 sequence-[индексная последовательность]-транспозазная последовательность-3'Ad2.10_CGAGGCTG | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGGGCATACG AGAT[CAGCCTCG]GTCTCGTGG GCTCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.10_expected индексная последовательность читается: 5'-P7 sequence-[индексная последовательность]-транспозаза последовательность-3'Ad2.11_AAGAGGCA | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGAGGGCATACG AGAT[TGCCTCTT]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.11_expected индексная последовательность читается: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'Ad2.12_GTAGAGGA | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TCCTCTAC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.12_expected index sequence читается: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | ||
| Ad2.13_GTCGTGAT: 5'-CAAGCAGAAGAGGGCATACGA GAT[ATCACGAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.13_expected индексная последовательность читается: 5'-P7 sequence-[индексная последовательность]-транспозаза последовательность-3'Ad2.14_ACCACTGT | ||
| : 5'- CAAGCAGAAGGGCATACGA GAT[ACAGTGGT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.14_expected индексная последовательность читается: 5'-P7 sequence-[индексная последовательность]-транспозаза последовательность-3'Ad2.15_TGGATCTG | ||
| : 5'- CAAGCAGAAGAGGGCATACGA GAT[CAGATCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.15_expected индексная последовательность читается: 5'-P7 sequence-[индексная последовательность]-транспозазная последовательность-3'Ad2.16_CCGTTTGT | ||
| : 5'- CAAGCAGAAGGGCATACGA GAT[ACAAACGG]GTCTCGTGGGC< br/> TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.16_expected индексная последовательность читается: 5'-P7 sequence-[индексная последовательность]-транспозазная последовательность-3' | ||
| Ad2.17_TGCTGGGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACCCAGCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.17_expected индексная последовательность читается: 5'-P7 sequence-[индексная последовательность]-транспозазная последовательность-3' | ||
| Ad2.18_GAGGGGTT: 5'-CAAGCAGAAGAGGGCATACGA GAT[AACCCCTC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.18_expected индексная последовательность читается: 5'-P7 sequence-[индексная последовательность]-транспозаза последовательность-3'Ad2.19_AGGTTGGG | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGGGCATACGA GAT[CCCAACCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.19_expected индексная последовательность читается: 5'-P7 sequence-[индексная последовательность]-транспозаза последовательность-3' | ||
| Ad2.20_GTGTGGTG: 5'-CAAGCAGAAGAGGGCATACGA GAT[CACCAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.20_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | ||
| Ad2.21_TGGGTTTC: 5'-CAAGCAGAAGAGGGCATACGA GAT[GAAACCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.21_expected индексная последовательность читается: 5'-P7 sequence-[индексная последовательность]-транспозаза последовательность-3'Ad2.22_TGGTCACA | ||
| : 5'- CAAGCAGAAGGGCATACGA GAT[TGTGACCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.22_expected индексная последовательность читается: 5'-P7 sequence-[индексная последовательность]-транспозаза последовательность-3'Ad2.23_TTGACCCT | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGAGGGCATACGA GAT[AGGGTCAA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.23_expected индексная последовательность читается: 5'-P7 sequence-[индексная последовательность]-транспозазная последовательность-3'Ad2.24_CCACTCCT | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGGGCATACGA GAT[AGGAGTGG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.24_expected индексная последовательность чтения: 5'-P7 sequence-[индексная последовательность]-транспозаза последовательность-3'F1 | ||
| : 5'-CCTTTTTATTTGCCCATACACTC-3'IDT | |||
| R1: 5'-CCCAGATAGAAAGTTGGAGAGG-3'IDT | |||
| F2: 5'-TTGAGGGATGCCATAACAGTC-3'IDT | |||
| R2: 5'-CTGCTGAACAACATCCTTCAC-3'IDT | |||
| F3: 5'-GGTTTTTGCAGGTTGCGTG-3'IDT | |||
| R3: 5'-AGAGGAATCTGGGAGTGACG-3'IDT | |||
| F4: 5'-TGCTCATTCCGTTTCCCTAC-3'IDT | |||
| R4: 5'-AGCCGGAAAGAAAGGTTCCTG-3'IDT |
Ссылки
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Curr Protoc Mol Biol. , 21.29.1-21.29.9 (2015).
- Thurman, R. E., Rynes, E., et al. The accessible chromatin landscape of the human genome. Nature. 489 (7414), 75-82 (2012).
- Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harb Protoc. (2), (2010).
- Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).
- Cui, K., Zhao, K. Genome-Wide Approaches to Determining Nucleosome Occupancy in Metazoans Using MNase-Seq. Methods Mol Biol. 833, 413-419 (2012).
- Qu, K., et al. Individuality and Variation of Personal Regulomes in Primary Human T Cells. Cell Syst. 1 (1), 51-61 (2015).
- Scharer, C. D., et al. ATAC-seq on biobanked specimens defines a unique chromatin accessibility structure in naïve SLE B cells. Sci Rep. 6, 27030(2016).
- Sebé-Pedrós, A., et al. The Dynamic Regulatory Genome of Capsaspora and the Origin of Animal Multicellularity. Cell. 165 (5), 1224-1237 (2016).
- Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes. Nucleic Acids Res. 45 (6), e41(2016).
- Davie, K., et al. Discovery of Transcription Factors and Regulatory Regions Driving In Vivo Tumor Development by ATAC-seq and FAIRE-seq Open Chromatin Profiling. PLOS Genet. 11 (2), (2015).
- Villar, D., et al. Enhancer Evolution across 20 Mammalian Species. Cell. 160 (3), 554-566 (2015).
- Lara-Astiaso, D., et al. Chromatin state dynamics during blood formation. Science. 345 (6199), 943-949 (2014).
- Prescott, S. L., et al. Enhancer Divergence and cis-Regulatory Evolution in the Human and Chimp Neural Crest. Cell. 163 (1), 68-83 (2015).
- Wu, J., et al. The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos. Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
- Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nat Genet. 48 (10), 1193-1203 (2016).
- Jenner, R. G., et al. The transcription factors T-bet and GATA-3 control alternative pathways of T-cell differentiation through a shared set of target genes. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (42), 17876-17881 (2009).
- DeAngelis, M. M., Wang, D. G., Hawkins, T. L. Solid-phase reversible immobilization for the isolation of PCR products. Nucleic Acids Res. 23 (22), 4742-4743 (1995).
- Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome Biol. 12 (2), R18(2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25(2009).
- Li, H., Handsaker, B., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137(2008).
- Meyer, C. A., Shirley Liu, X. Identifying and mitigating bias in next-generation sequencing methods for chromatin biology. Nat Rev Genet. 15 (11), 709-721 (2014).
- He, H. H., et al. Refined DNase-seq protocol and data analysis reveals intrinsic bias in transcription factor footprint identification. Nat Methods. 11 (1), 73-78 (2013).
- Madrigal, P. On Accounting for Sequence-Specific Bias in Genome-Wide Chromatin Accessibility Experiments: Recent Advances and Contradictions. Front Bioeng Biotechnol. 3, 1-4 (2015).
- Qin, Q., et al. ChiLin: a comprehensive ChIP-seq and DNase-seq quality control and analysis pipeline. BMC Bioinformatics. 17 (1), (2016).
- Bao, X., et al. A novel ATAC-seq approach reveals lineage-specific reinforcement of the open chromatin landscape via cooperation between BAF and p63. Genome Biol. 16 (1), 284(2015).
- Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
