Методическая статья

Иммуноокрашивания для модификации ДНК: Вычислительный анализ конфокальный изображений

DOI:

10.3791/56318

⸱

7 сентября 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cancer and Stem Cells, School of Medicine, Centre for Biomolecular Sciences, University of Nottingham, 2School of Life Sciences Imaging (SLIM), School of Life Sciences, University of Nottingham, 3Children's Brain Tumour Research Centre, School of Medicine, QMC, University of Nottingham

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Недавно обнаружил окисленные формы 5-метилцитозин (oxi-mCs), 5-Гидроксиметилцитозин (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) и 5-carboxylcytosine (5caC) может представлять различные модификации ДНК с уникальными функциональными ролями. Здесь описан полуколичественного рабочего процесса для визуализации пространственного распределения oxi-mCs, профилирование интенсивности сигнала и colocalization.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На протяжении нескольких десятилетий 5-метилцитозин (5мс) были считается единственным модификации ДНК с функциональное значение в размером. Открытие ферментативного окисления 5мс 5-Гидроксиметилцитозин (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) и 5-carboxylcytosine (5caC), а также обнаружения N6-methyladenine (6mA) в ДНК многоклеточных организмов представили дополнительные степени сложность эпигеномные исследований. По словам растущее число экспериментальных доказательств эти новые модификации ДНК могут играть конкретные роли в различных процессах клеточного и развития. Важно, как некоторые из этих знаков (е. г. 5hmC, 5 ФК и 5caC) выставка ткани - и развития конкретной стадии возникновения позвоночных иммунохимии представляет собой важный инструмент, позволяющий оценки пространственного распределения изменений ДНК в различных биологических контекстах. Здесь описаны методы вычислительной анализа ДНК модификации визуализированное иммуноокрашивания следуют confocal микроскопии. В частности поколения 2,5 измерения (2.5 D) сигнал интенсивности участки, сигнал, что интенсивность профили, количественная оценка окрашивания интенсивности в несколько ячеек и определение коэффициентов colocalization сигнала отображаются. Вместе эти методы могут быть оперативной оценки уровня и локализации этих изменений ДНК в ядре, способствуют разъяснению их биологической роли в размером.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метилирование ДНК, документально механизм, связанный с регуляцию влечет за собой изменение остатков цитозина в 5'-цитозин фосфат гуанин-3' контексте динуклеотид (CpG) через добавлением метильной группы (-CH3) на 5- атом углерода цитозина пиримидина кольца в форме 5-метилцитозин (5мс)1. В млекопитающих около 70% стандартов клинической практики являются метилированию которых составляет лишь 1% от их геномов, как они истощаются палиндром последовательности благодаря 5мс мутагенных склонность к спонтанно deaminate в тимин2. Присутствие метильных групп последовательностей гена промоутер показывают сильную корреляцию с транскрипционный анализ репрессий в позвоночных3,4,5. Помимо этих метильных групп катализируемой высоко сохраняется ДНК метилтрансфераза (DNMT) ферментов DNMT3a, 3b и 3 L и DNMT1, который соответственно изменить CpG cytosines de novo и обслуживания метилирования контекстах6. DNMT3A/B выражение возводится во время разработки в эмбриональных стволовых клеток и Эпибласт; Однако его уменьшилась выражение наблюдается после плюрипотентных клеток линии приверженность соматических судьбы во время дифференцировки8. Хотя обмен функциональной избыточностью, DNMT3a и 3b отображения образцов ткани конкретных выражений, с 3a, равномерно обнаружены в эмбрионов мыши но 3b, преимущественно локализованы neuroectoderm и хорионического эктодермы тканей8.

Метилирование подписей могут быть унаследованы во время митоза и мейоз10. Техническое обслуживание метилирования включает DNMT1 при содействии модификации остатков цитозина CpG, существующих в hemi метилированную палиндромов двуцепочечной ДНК11. DNMT1 связывается ДНК в репликации вилки11 , и следовательно, геномных метилирования уровнях пик в S-фазе клеточного цикла12. DNMT1 метилирует неизмененном cytosines таким образом отличительный заново синтезированные нити ДНК, поощрение инактивации х и поддержание транскрипционный анализ репрессий профили13. Путем признания hemi метилированную последовательностей ДНК CpG DNMT1 поддерживает установленные шаблоны метилирования хроматического de novo метилирования например репрессии длинные Interspersed ядерный элемент 1 (строка1) Ретротранспозоны промоутеров для ингибирования его потенциально канцерогенных распространения14. Хотя обладая hemi метилированную ДНК преференциальных сродство, DNMT1 может метилируем unmethylated последовательностей CpG остров (CGI) в DNMT3a/b - / - мутант клеток, выполняя роль метилирования чрезвычайных de novo 15 . Таким образом благодаря полу консервативный характер репликации ДНК16, метилирование обслуживания может добросовестно пилки метилирования подписей от родителей дочь клеток17.

Однако гена выражение быть динамически модулированных, репрессивных метилирования модификации должны быть стерты, которое может быть достигнуто путем деметилирования пассивные и активные механизмы18. Десять-одиннадцать белки ацилкарнитин (тет), относящихся к сохраняемой семейству белков dioxygenase способны итеративный окисления метильных групп CpG остатков19. Эти белки Tet, гомологичных белки, связывающие J-Base (JBP) обнаружил в трипанасомных bruceii, признать и привязать изменение ДНК баз например 5мс и кислородом эти остатки 5-Гидроксиметилцитозин (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) и 5 - carboxylcytosine (5caC)20. Тет белков способствует окисления 5мс результатов в ступенчатой конформации переход от бромистого гидроксил, карбонил и карбоксилат конфигураций, однако 5 ФК и 5caC изменения могут быть синтезированы непосредственно из 5мс окисления21, 22 , 23 , 24.

Информативный проявлением активности белка тет в понимании их регулирование изучает распределения и обилие oxi метил цитозин знаков. 5мс значительное присутствие на ВПУ бедных промоутеров обнаруживаемая в отличие от unmethylated CpG богатые регионы, причем характеристика CpG острова25. Через ткани, высокий ткани, конкретных метилирования наблюдается в мозг, яички и крови, хотя слизистой проявляют наибольшую hypomethylation, указав шаблон дифференциального метилирования, происходящих на ткани конкретных промоутеров26.

Путем использования чувствительных анти 5мс и анти 5hmC антител в выборочной метил/гидроксиметил ДНК иммунопреципитации (МЕДИП/hmeDIP) и последующих высокой пропускной способности последовательности, ФИКЗ et al. продемонстрировал высокий 5hmC размещение на промоутеров, экзонов и линия-1 Ретротранспозоны последовательностей, которые связаны с сокращением 5мс уровней в этих местах в мыши эмбриональные стволовые клетки27. Наоборот величайший 5мс обогащения было отмечено в последовательности повторяющихся Спутниковое где 5hmC присутствие было ограничено28. Исследования на ткани человека лобной доли головного мозга показывают весьма значительные 5hmC обогащения, четыре раза выше, чем в мыши эмбриональные стволовые клетки28. В соответствии с предыдущими замечаниями высокая пропускная способность sequencing лобной доли ткани проиллюстрировано большинство 55-59% 5hmC сигнала локализованы на низкой плотности CpG промоутер регионов, 35-38% в органах гена и приблизительно 6% занятости в intergenic регионах. В противоположность этому 5мс обогатилась в intergenic регионах (25-26%) и выше органах гена (52-55%), но снижение (22-24%), на промоутер последовательностей29. Эти исследования показывают обилие 5hmC в эмбриональных стволовых клеток и соматические ткани, особенно мозга, однако исследования на 5 ФК и 5caC распределения ограничены.

Интересно, что недавно обнаружили у эукариот, метилирование аденин остатков на позиции 6 азота (N6) (6mA) дисплей геномной изобилие профиль обратная, 5МС30. Замечания от тандем массовым спектрометрированием жидкостной хроматографии в сочетании выявить 6mA абсолютных уровнях существует в избытке в гиреллы и свинину ранних эмбрионов, по сравнению с спермы с уровнями (0.003% генома adenines) растет на оплодотворение, достигнув морулы стадии развития (33 раза выше, чем сперматозоидов) и достижения устойчивого состояния соматического уровня 0,004% генома adenines31. Иммунопреципитация последовательностей ДНК 6mA обогащенный продемонстрировал преобладающим размещение (около 80% обогащения) этой марки в повторяющийся элемент регионов и transcriptional начало сайтов32. Эти наблюдения контекст и проверить открытие e 6mA деметилазы-значение nullmbryonic стволовые клетки экспонируется накопленные 6mA опосредованной глушителей Ретротранспозоны линия-1 по сравнению с транскрипционно активных элементов в wildtype клетках. Эти данные свидетельствуют о транскрипционный анализ функции регулирования для 6mA33.

Хотя конъюгированных биохимических теги, в сочетании с последующим КУПАНИЕМ анализов указывают на наличие или отсутствие обнаружен окисленных производных (oxi-mCs), они не могут распространять пространственного распределения или количественной информации, эти знаки34, 35. протокол для чувствительных иммунохимических обнаружения 5hmC и 5caC был недавно разработанных36. Этот метод вторичные антитела на основе иммуноокрашивания Флюорофор спрягаются, в сочетании с использованием сканирование лазерная конфокальная микроскопия обладает уникальным преимуществом предоставления визуального локализации этих изменений ДНК в клетках, таким образом, подчеркивая отдельные положительно или отрицательно окрашенных клеток с гетерогенными присутствие этих марок. 5hmC и 5caC сигнал абсолютной интенсивности как усиливается конъюгированных антител включить полуколичественного толкования должны быть предложены о масштабах и позиции этих знаков в ядре, например гетерохроматиновые и эухроматиновых регионов 37 , 38. здесь описана методика для вычислений анализа confocal микроскопии изображений. Поколения 2,5 D пространственного распределения участков для отображения различных 5hmC и проявляется 5caC пики сигнала на пиксел и их расположения в пределах ядер. Гистограмма участков 5hmC и 5caC сигнал интенсивности профили можно проиллюстрировать тенденции в изобилии этих марок как пики и желоба выводятся как отдельные неперекрывающихся каналов. Наконец выполняя функцию colocalization, степень близости одного сигнала на другой может быть определено и в результате этого, могут быть определены их соответствующие геномной координаты.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. поколение конфокальный изображения

  1. в рамках подготовки анализа модифицированных форм цитозин, выполняют иммуногистохимическое окрашивание, как описано в Абакира и др. 34.
  2. осуществлять изображений слайдов, с помощью микроскопа и сохранять файлы в формате LSM.
    Примечание: При сравнении интенсивности профилей между выборками значения, используемые для мощности лазера и выгода для каждого канала должна поддерживаться на протяжении всего изображения принимая процедуры позволяет для прямого сравнения на этапе анализа изображения.

2. Поколение 2.5D интенсивности участков

  1. открытое программное обеспечение (например, Дзэн черного) и выберите ' обработки изображений '.
  2. , Перейдите в меню файл и выберите Открыть. Выберите изображение, которое требует обработки.
  3. Нажмите на ' Показать все ' ниже изображения, чтобы сделать видимыми все графические элементы. В нижней половине экрана расположены три вкладки; ' Размеры ', ' дисплей ' и ' графика ', выберите ' графика ' таб
    1. Выберите ' прямоугольник ' инструмент для выбора ядер/область интереса.
    2. Выберите ' вырезать региона ' чтобы обрезать изображение. Это будет создавать новое изображение для обрезанного региона в отдельную закладку
    3. Перейдите в меню файл и выберите Сохранить как дать файлу имя и сохранить его как файл LSM или РАКОЦИ.
  4. Откройте программное обеспечение (например, Голубое Дзэн) и выберите ' Zen стол '.
  5. Отправить обрезанного изображения от Zen черный синий Дзэн, выбрав файл и в меню файл и выберите Отправить в Дзэн 2012-голубой издание. Обрезанное изображение откроется в соответствующей программе.
    Примечание: Файл изображения передается потому что функцию сюжет интенсивности 2.5D в Дзэн черного 2012 не изображения нескольких каналов одновременно.
  6. На левой стороне изображения выберите вкладку Маркированный ' 2.5D ', это позволяет визуализации изображения в 2.5 D. Нажмите кнопку ' Показать все ' чтобы все графические элементы управления видимыми.
  7. Alter визуализация параметров с помощью четырех серые полосы, расположенный слева и ниже изображения.
    Примечание: левая рука бар, верхней части экрана = масштаб. Левая рука бар, внизу экрана = повернуть изображение на оси. Нижней части экрана, левой рукой бар = вращение изображения. Нижней части экрана, правой руки бар = расширяться и сжиматься масштаба баров.
  8. Убедитесь, что выбран режим визуализации поверхности как это дает лучший способ визуализации отдельных пиков.
  9. Изменить расстояние сетки, изменив процент, тем меньше процент больше определяется каждый индивидуальный пик.
  10. Для сохранения 2.5D изображения, сначала скрыть список файлов на правой стороне и графических инструментов ниже изображения, нажав на серый стрелку ниже 2,5 D участок (рядом с ' Показать все '), это будет скрыть вкладки графический, позволяя для изображения раскрываемого заполнить осыпи n. чтобы сохранить участок 2,5 D, нажмите ' PrtSc ' ключей на клавиатуре. Это будет захватить снимок экрана дисплея. Снимок экрана можно вставить в Microsoft Paint и обрезать изображения перед сохранением.

3. Интенсивность профилирования

  1. открытое программное обеспечение (например, Дзэн черного) и выберите пункт Обработка изображений.
  2. , Перейдите в меню файл и выберите Открыть. Выберите изображение, которое требует обработки.
  3. Как изображение появится на экране, на левой стороне изображения выберите вкладку Маркированный ' профиля '.
  4. В нижней половине экрана выберите (тикание) ' Показать все ' вкладка. Это обеспечит доступ ко всем опциям форматирования.
  5. В нижней половине экрана расположены три вкладки; ' размеры ', ' дисплей ' и ' ProfileƆ выберите ' профиля ' и выберите (тикание) ' Таблица ' поле. Выберите ' стрелка ' кнопку.
  6. На изображении использовать мышь, чтобы выбрать начальную точку и перетащите указатель мыши над непрерывное количество клеток. Отпустите кнопку мыши, производить сюжет интенсивности для ячеек вдоль линии; Кроме того таблицы будет заполняться на данных измерений интенсивности пикселей вдоль линии для каждой длины волны.
    Примечание: Таблица будет обеспечивать расстояние (мкм), в которой пиксель интенсивности читается для красного, зелёного и синего флуоресценции.
  7. Для экспорта данных, щелкните правой кнопкой мыши на таблице, выберите ' сохранить таблицу … ' и сохранить в соответствующее место в txt-файл.
  8. Для сохранения выбранного интенсивность профиля изображения выберите в меню файл и выберите ' экспорта … '. Во всплывающем окне выберите ' тегами изображения файл (формат) ' и ' содержимое окна изображения - в одной панели (данных) ' следуют нажав ' выбрать имя файла и сохранить … ' выберите соответствующее расположение и нажмите кнопку ' сохранить '.
  9. Повторить этот процесс для каждого индивидуального профиля интенсивности в зависимости от поля зрения и количество профилей для анализа.
  10. Интенсивность импорта профилей данных сохраняется (см. 3.7) и анализировать в таблицы следуют статистический анализ.

4. Анализ совместного локализации

  1. откройте программу и выберите ' обработки изображений '.
  2. , Перейдите в меню файл и выберите Открыть. Выберите изображение, которое требует обработки.
  3. Как изображение появится на экране, на левой стороне изображения выберите вкладку Маркированный ' Coloc '.
  4. В нижней половине экрана выберите (тикание) ' Показать все ' вкладка. Это обеспечит доступ ко всем опциям форматирования.
  5. В нижней половине экрана есть четыре вкладки; ' размеры ', ' дисплей ', ' графики ' и ' ColocalizationƆ выберите ' Colocalization ' и поставьте галочку для ' таблицы ' и ' изображение '.
    1. Выберите третий значок вдоль в верхней части этой вкладки (текст будет отображаться при наведении указателя мыши на средство закрыть Безье) Используйте этот инструмент, чтобы окружить одного ядра, значения для данного ядра будут затем появятся в таблице.
      Примечание: Для каждого обведенные ядер точечная производится для красного против зеленой флуоресценцией, которая визуализируется в левой панели на экране. Оси затем переехала, чтобы ворота из клетки в зависимости от порога. Как ядра интерес отбираются вручную в изображениях, регулируя стробирования пороги выше нуля не требуется. Все значения интенсивности пикселей, наблюдается в пределах периметров, ядерной, рассматриваются как позитивный сигнал о.
  6. Повторить этот процесс, выбрав третий значок на вкладке и обводить последующих ядер до завершения набора.
  7. Для экспорта данных, щелкните правой кнопкой мыши на таблице, выберите сохранить таблицу и сохранить в соответствующее место.
  8. Сохранить colocalization изображение, выберите в меню файл и выберите ' экспорта … ' затем выберите; С тегами файлов изображений (формат) и ' содержимое окна изображения – один самолет (данных) ' следуют нажав ' выбрать имя файла и сохранить … ', выберите соответствующее расположение и нажмите кнопку ' сохранить '.
  9. Участок colocalization данных в таблицу, после чего статистический анализ.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы определить пространственное распределение 5hmC и 5caC в дифференциации печеночная прародителями immunostained слайды для этих изменений ДНК были образы с помощью микроскопа.

Первоначальный анализ пространственного распределения этих oxi-mCs была проведена через поколения 2,5 D интенсивности участков (рис. 1A, 1B). Красные и зеленые вершины, как представляется, быть четко определены с ограниченным присутствием оранжевого пиков, указав только небольшое перекрытие сигналов 5caC и 5hmC. По согласованию с эти результаты профили для 5hmC и 5caC интенсивности в соответствующей ячейке сильно не совпадают друг с другом (рис. 1 c). Это показывает, что 5caC и 5hmC exhibit различные виды ядерного распространения в печени прародителями, предполагая, что Тет зависимых окисление 5мс приводит к генерации различных окисленных производных этой модификации ДНК в конкретных хроматина регионах.

Чтобы сравнить уровни 5caC и 5hmC в Daoy медуллобластома и BXD-1425EPN эпендимома клетки, иммуноокрашивания для этих oxi-mCs была проведена на обоих образцах одинаковых экспериментальных условиях. В 20 профилей, созданных через 3-5 клеток, записанная для каждой ячейки строки затем сравнивались интенсивности сигналов 5caC и 5hmC (рис. 2A-2D). Количественная оценка этих результатов показал, что BXD-1425EPN клетки демонстрируют значительно более низкие уровни 5hmC и 5caC иммуноокрашивания, по сравнению с Daoy клеток (Рисунок 2D).

С учетом двух каналов Красный (5hmC) и зеленый (5caC) который можно обозначить как R и G соответственно, коэффициент корреляции Пирсона (PCC) описывает степень пространственного перекрытия и совместного разделения R & G, предполагая обе марки существуют в линейной отношения друг с другом, обозначается R статистика34. Квадратура значение PCC, обозначается R2 позволяет измерить вариации интенсивности зеленого сигнала, который зависит от интенсивности красного сигнала34. Это излишним для нашего анализа совместно локализации 5hmC против 5caC.

Для изучения пространственного распределения 5caC и 5hmC в недифференцированных hiPSCs (Undiff) и печеночная энтодермы 24 часа (HE24) после индукции, был проведен colocalization анализ этих изменений ДНК на те же конфокальный изображения, с значения R для 20 ядер проанализированы для каждой ячейки строки (Рисунок 3А-3 C).

Количественная оценка этих результатов показал, что степень colocalization значительно выше (P < 0,05) в HE24, по сравнению с Undiff (рис. 3 c). Это может быть обусловлено сокращением масштабов присутствия 5caC и, следовательно, интенсивность ее снижение сигнала в Undiff клетках.

figure-results-1
Рисунок 1: иммуногистохимическое окрашивание печеночная энтодермы прародителей на 72 часа пост индукции дифференцировки. (A) совместно окрашивание 5hmC (красный), 5caC (зеленый) и DAPI ядерной счетчика пятно (синий). Белой пунктирной стрелкой «B» обозначает направление профилирования пробы через ядро, иллюстрированные в 1С. Линейки шкалы представляет 5 мкм. красный канал: получить 800, лазерная 1%. Зелёный канал: получить 750, лазерные 2,4%. DAPI канал: получить 750, лазерные 2,6%. (B) 2.5 D интенсивности участок DAPI сигналов, 5caC и 5hmC. Отдельные вершины представляют абсолютное сигнал интенсивности каждого пикселя. Объединенные представления и отдельные каналы отображаются. (C) интенсивность профили DAPI сигналов в печени прародителями на 72 часа пост индукции дифференцировки, 5caC и 5hmC. Пиковых значений силы были записаны вдоль размеры белой пунктирной стрелкой «B» и обозначаются оси профиля интенсивности черной пунктирной стрелкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2: анализ 5hmC и 5caC сигнал света в Daoy медуллобластома и BXD-1425EPN эпендимома клеточных линий. (A) Immunofluorescent окрашивание 5hmC (красный) и 5caC (зеленый) в Daoy и BXD-1425EPN клеток. Изображения были захвачены с 63 x нефть погружения объектива, как на те же параметры. Объединенные представления и отдельные каналы отображаются. Масштаб бары представляют 10 мкм. красный канал: получить 746, лазерная 1%. Зелёный канал: получить 750, лазерные 2,4%. Отдельных Daoy (B) и (C) BXD-1425EPN клетки раскрываются в смежных фигур. Масштаб баров для (B) и (C) представляют 5 мкм. (D) означает флуоресценции интенсивности сигналов 5caC против 5hmC в клетках Daoy и BXD-1425EPN (n = 20, SD). Значимость была оценена с помощью F-тест и двухвыборочный t-Test. звездочками обозначают статистически значимыми p значения ** как p < 0,01 и *** как p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3: анализ Colocalization 5hmC и 5caC абсолютной сигналов в недифференцированных hiPSCs (Undiff) по сравнению с печёночной энтодермы 24 часа после дифференцированной прародитель клетки (HE24). Confocal микроскопии изображений (A) недифференцированные hiPSCs и (B) HE24 клетки, витражи для 5hmC (красный), 5caC (зеленый) и DAPI (синий). Клетки были образы с 63 X нефти погружения объектив на идентичные параметры. 20 обведенные ядер иллюстрируют ячеек, выбранных для colocalization анализа. Масштаб бары представляют 20 мкм. красный канал: получить 800, лазерная 1%. Зелёный канал: получить 750, лазерные 2,4%. DAPI канал: получить 750, лазерные 2,6%. (C) Colocalization анализ присутствия 5caC сигнала в диапазоне близости 5hmC в undiff и HE24 (n = 20, SD). Значимость была оценена с помощью F-тест и двухвыборочный t-Test. звездочками обозначают статистически значимыми p значения * p < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает процесс поэтапного создания визуального представления изменений ДНК в ядрах. Хотя чувствительных и эффектных, эти методы имеют ряд ограничений.

Это необходимо подчеркнуть, что данные, полученные от 2.5D участки, профили интенсивности сигнала и colocalization анализ полу количественный характер. Из-за пункта освещение образца во время захвата изображений на лазерный Сканирующий конфокальный микроскоп записываются сигнал абсолютной интенсивности каждого канала. Однако они не являются абсолютной величины 5hmC и 5caC быть обнаруженными и только представляют признаков присутствия, отсутствие или масштаб этих эпигенетических меток.

Из-за повторяющихся характер амплификаций сигнала ограничения, в соответствии с величиной машин, применяемых для повышения сигнал неизбежно смешал аппроксимации истинной физической геномной размещение этих марок34. Истинный геномной локализации этих марок может быть скрыт эти громоздкие белки, которые физически занимают районы неразрешимых даже в пределах оптимального конфокальный резолюции 200-300 Нм34. Кроме того интенсивность сигнала отдельных каналов для каждого знака нельзя сравнить друг с другом из-за различия в чувствительности антитела и Флюорофор спряжение34. Однако информация, полученная с изображениями проливает свет на пространственной и временной организации геномной знаков.

Для точного количественный сигналов 5hmC и 5caC ядра выделяются и окружили против DAPI изображение, ясно демаркации региона для анализа. Эта процедура обходится с требованием для калибровки стробирования порогов, как фоновый шум игнорируется через процесс ручного выбора ядер1. Автоматизация этого процесса может быть достигнуто в новейшее программное обеспечение, которое позволяет для ядерной сегментации должны быть выполнены. Хотя альтернативное программное обеспечение пакеты, такие, как Фиджи, доступны для colocalization анализа, недостатки, например, требование для преобразования изображений в форматах двоичных 8 бит, Маскирование изображения и ввод для выбора областей данных размер исключения интерес предел пользователь доступность этой программы. Кроме того учитывая, что общий ограниченные уровни 5hmC и 5caC в геноме, в целом в сочетании с их преобладающим местоположение в эухроматиновых регионах и истощение genomic последовательностей CpG, ручной обводить ядер вводит пользователь предвзятости. Таким образом подчеркнув ядер автоматически берет на себя все события, происходящие в регионе демаркация будет положительным и игнорирует любой фон пикселей, которые могут присутствовать. Таким образом анализ изображений, основанный на интенсивности пикселей может быть более значимым. Эти факторы имеют важное значение при рассмотрении вопроса об использовании коэффициента colocalization Mander проанализировать степень пространственного перекрытия между двумя сигналами, независимо от их интенсивности сигнала, как противостоять коэффициент корреляции Пирсона, который предполагает линейная зависимость между сигналами.

В целом методы, описанные здесь несут тема визуальное представление биологических данных в формате интуитивно. Хотя полуколичественного анализа не заменяют мощные методы, такие как масс-спектрометрии с точки зрения чувствительности или единый базовый резолюции генома широкий последовательности, предоставляют дополнительные данные, позволяющие выводы и гипотезы быть зачала от анализа изображений с точностью.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Были раскрыты не потенциальные конфликты интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Работа была поддержана биотехнологии и биологических наук исследовательский совет [BB/N005759/1-а.р.]. NRFH было профинансировано Rosetrees доверия и Stoneygate доверие [A1130 / M546]. Микроскоп Zeiss Elyra PS.1, обработка компьютеры и программное обеспечение были профинансированы на СИББН BB/L013827/1 (многодисциплинарной супер резолюции микроскопии объекта в Ноттингемский университет Грант)

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Zeiss Elyra PS1. Микроскоп сверхвысокого разрешения, оснащенный конфокальной головкой LSM780ZeissNA
Zeiss Zen Black 2012ZeissNA
Zen Blue 2012ZeissNA
Microsoft ExcelMicrosoft NA

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bird, A. P. Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: II. The symmetry of methylated sites supports semi-conservative copying of the methylation pattern. J Mol Biol. 118 (1), 49-60 (1978).
  2. Youssoufian, H., et al. Recurrent mutations in haemophilia A give evidence for CpG mutation hotspots. Nature. 324 (6095), 380-382 (1985).
  3. Holliday, R., Pugh, J. E. DNA modification mechanisms and gene activity during development. Cold Spring Harbor Monograph Series. 32, 639-645 (1996).
  4. Christman, J. K., Price, P., Pedrinan, L., Acs, G. Correlation between hypomethylation of DNA and expression of globin genes in Friend erythroleukemia cells. European J Biochem. 81 (1), 53-61 (1977).
  5. Bird, A. P., Southern, E. M. Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: I. The methylation pattern in ribosomal DNA from Xenopus laevis. J Mol Biol. 118 (1), 27-47 (1978).
  6. Kim, G. D., Ni, J., Kelesoglu, N., Roberts, R. J., Pradhan, S. Co-operation and communication between the human maintenance and de novo DNA (cytosine-5) methyltransferases. EMBO J. 21 (15), 4183-4195 (2002).
  7. Reik, W., Kelsey, G., Walter, J. Dissecting de novo methylation. Nature genetics. 23 (4), 380-382 (1999).
  8. Okano, M., Bell, D. W., Haber, D. A., Li, E. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell. 99 (3), 247-257 (1999).
  9. Eckhardt, F., et al. DNA methylation profiling of human chromosomes 6, 20 and 22. Nat Genet. 38 (12), 1378-1385 (2006).
  10. Lees-Murdock, D. J., Lau, H. -T., Castrillon, D. H., De Felici, M., Walsh, C. P. DNA methyltransferase loading, but not de novo methylation, is an oocyte-autonomous process stimulated by SCF signalling. Dev Biol. 321 (1), 238-250 (2008).
  11. Leonhardt, H., Page, A. W., Weier, H. -U., Bestor, T. H. A targeting sequence directs DNA methyltransferase to sites of DNA replication in mammalian nuclei. Cell. 71 (5), 865-873 (1992).
  12. Jones, P. A., Taylor, S. M. Cellular differentiation, cytidine analogs and DNA methylation. Cell. 20 (1), 85-93 (1980).
  13. DNA methylation: DNA Methylation in Early mammalian Development. Jähner, D., Jaenisch, R. , Springer. 189-219 (1984).
  14. Chalitchagorn, K., et al. Distinctive pattern of LINE-1 methylation level in normal tissues and the association with carcinogenesis. Oncogene. 23 (54), 8841-8846 (2004).
  15. Fatemi, M., Hermann, A., Gowher, H., Jeltsch, A. Dnmt3a and Dnmt1 functionally cooperate during de novo methylation of DNA. Eur J Biochem. 269 (20), 4981-4984 (2002).
  16. Gruenbaum, Y., Cedar, H., Razin, A. Substrate and sequence specificity of a eukaryotic DNA methylase. Nature. 295 (5850), 620-622 (1982).
  17. Dean, W., Santos, F., Reik, W. Epigenetic reprogramming in early mammalian development and following somatic nuclear transfer. Seminars in cell & developmental biology (Elsevier). 14 (1), 93-100 (2003).
  18. Wu, S. C., Zhang, Y. Active DNA demethylation: many roads lead to Rome. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (9), 607-620 (2010).
  19. Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).
  20. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
  21. Bachman, M., et al. 5-Formylcytosine can be a stable DNA modification in mammals. Nat Chem Biol. 11 (8), 555-557 (2015).
  22. Bachman, M., et al. 5-Hydroxymethylcytosine is a predominantly stable DNA modification. Nat Chem. 6 (12), 1049-1055 (2014).
  23. Lurlaro, M., et al. In vivo genome-wide profiling reveals a tissue-specific role for 5-formylcytosine. Genome Biol. 17 (1), 141(2016).
  24. Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. Distributive Processing by the Iron (II)/α-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases. J Am Chem Soc. 138 (30), 9345-9348 (2016).
  25. He, Y. -F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).
  26. Herman, J. G., Graff, J. R., Myöhänen, S., Nelkin, B. D., Baylin, S. B. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci. 93 (18), 9821-9826 (1996).
  27. Nagae, G., et al. Tissue-specific demethylation in CpG-poor promoters during cellular differentiation. Hum Mol Genet. 20 (14), 2710-2721 (2011).
  28. Ficz, G., et al. Dynamic regulation of 5-hydroxymethylcytosine in mouse ES cells and during differentiation. Nature. 473 (7347), 398-402 (2011).
  29. Jin, S. -G., Wu, X., Li, A. X., Pfeifer, G. P. Genomic mapping of 5-hydroxymethylcytosine in the human brain. Nucleic Acids Res. 39 (12), 5015-5024 (2011).
  30. Liu, J., et al. Abundant DNA 6mA methylation during early embryogenesis of zebrafish and pig. Nat Commun. 7, (2016).
  31. Wu, T. P., et al. DNA methylation on N6-adenine in embryonic stem cells. Nature. 532 (7599), 329-333 (2016).
  32. Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324 (5929), 929-930 (2009).
  33. Globisch, D., et al. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PloS one. 5 (12), e15367(2010).
  34. Abakir, A., Wheldon, L. M., Ruzov, A. Epigenetic Methods in Neuroscience Research: Immunohistochemical Detection of Oxidized Forms of 5-Methylcytosine in Embryonic and Adult Brain Tissue. , Springer. 125-137 (2016).
  35. Alioui, A., et al. 5-Carboxylcytosine is localized to euchromatic regions in the nuclei of follicular cells in axolotl ovary. Nucleus. 3 (6), 565-569 (2012).
  36. Chen, Y., Damayanti, N., Irudayaraj, J., Dunn, K., Zhou, F. C. Diversity of two forms of DNA methylation in the brain. Front Genet. 5, 46(2014).
  37. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (4), C723-C742 (2011).
  38. Lachmanovich, E., et al. Co-localization analysis of complex formation among membrane proteins by computerized fluorescence microscopy: application to immunofluorescence co-patching studies. J Microsc. 212 (Pt 2), 122-131 (2003).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

DNA ModificationsImmunostainingConfocal MicroscopyComputational Analysis2 5D Intensity PlotsSignal Intensity ProfilesColocalization AnalysisEpigenetic ResearchNuclear LocalizationImage Processing

Похожие статьи