Протокол для применения нейропротекторной низкодозированные атмосферное давление плазменной обработки на глюкозу лишение индуцированной SH-SY5Y травмы.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Новое применение плазменной струи атмосферное давление как нейро защитные агент против глюкозы лишение индуцированного повреждения ш SY5Y клеток
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Струи плазмы атмосферного давления (APPJ) привлекла внимание многих исследователей из нескольких дисциплин в последние годы, потому что его выбросы включают несколько видов химически активные разновидности азота (RNS) и реактивнооксигенных видов (ров). Наши предыдущие исследования показали цитопротективный эффект APPJ против Оксидативный стресс индуцированного повреждения. Целью настоящего исследования является предоставить подробный в vitro протокол лечения относительно применения нейропротекторной гелия APPJs на лишение индуцированной травмы глюкозы в клетках SH-SY5Y. SH-SY5Y человеческой нейробластомы производные клеточная линия была сохранена в RPMI 1640 среднего дополнены 15% плода телячьей сыворотки. Культура средних затем было изменено на RPMI 1640 без глюкозы до лечения APPJ. После инкубации 1 ч в инкубаторе клетки жизнеспособность клеток определяли с использованием клеток подсчета Kit 8. Результаты показали, что, по сравнению с группой лишение глюкозы, клетках, обработанных с APPJ выставлены жизнеспособность клеток значительно возросли в зависимости от дозы, с 8 s/также отмечаться как оптимальную дозу. Тем временем поток гелия был не влияет на обесценение лишение индуцированной клетки глюкозы. Наши результаты показали, что APPJ могут потенциально использоваться как метод лечения заболеваний центральной нервной системы, связанных с лишением глюкозы. Этот протокол также может использоваться как цитопротективного приложение для других ячеек с различными нарушениями, но клеточной культуры и условий лечения APPJ следует скорректировать и лечения доза должна быть относительно низкой.
Введение
Взрослый мозг почти исключительно использует глюкозу как субстрат для метаболизма энергии при нормальных физиологических условиях. Человеческий мозг составляет только 2% от веса тела, но потребляет около 25% всего глюкозы в пределах тела1. Это хорошо документирована что дисфункция метаболизма глюкозы является одним из основных патологических изменений при ишемическом инсульте и различных нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера (AD), болезни Гентингтона (HD) и болезнь Паркинсона (PD) 2,3. Недостаток глюкозы и зрением глюкозы или Оксидативное фосфорилирование можно непосредственно воздействие производства АТФ и далее побуждать смерти нейронные клетки, который может увеличить риск нейрональных дисфункции, предполагая, что поддержание жизнеспособности клеток или Откладывание клетки травмы после того, как лишение глюкоза может быть разумный подход для лечения этих заболеваний. Исследование эффектов нейропротекторной через глюкозы модуляции, упором на противовоспалительные агенты, ионного канала модуляторы, поглотители свободных радикалов, нейротрофических факторов, и т.д. был интерес. Однако перевод этих подходов нейропротекторной от скамьи в клинической практике не был успешным4.
Атмосферного давления плазмы струй (APPJs) являются новый вид атмосферных низкой температуры газового разряда технологии, которая привлекает внимание многих исследователей из нескольких дисциплин в последние годы. APPJs были использованы на протяжении десятилетий в различных биомедицинских приложений, таких как рак клеток лечение, бактериальных инактивации, свертываемость крови, заживление ран, устным медицины, и т.д.5,6, из-за своих выбросов нескольких типов химически активные разновидности азота (RNS) и реактивнооксигенных видов (ров) (рис. 1)7. Предыдущих приложений био медицины плазмы главным образом на окислительного и nitrative нагрузку на8бактерий, клеток и тканей. Однако APPJ также может быть «обоюдоострый меч», так как RNS и ROS важных внутриклеточных сигнальных молекул, относящиеся к многие физиологические и патофизиологических процессов9. Оксид азота (NO) управляет широкий спектр биологических процессов и играет двойную роль в человеческом теле, особенно в центральной нервной системе (ЦНС). Низкий уровень не показали их нейропротекторной деятельности как в пробирке и в естественных условиях через несколько путей сигнал10. Наши предыдущие исследования впервые сообщили, что гелий APPJ-индуцированной не участвовал в нейропротекторной эффект APPJ против Оксидативный стресс индуцированного повреждения11. Однако воздействие APPJs на других повреждений не сообщалось. Таким образом цель настоящего исследования-обеспечить в vitro лечения протокола относительно применения нейропротекторной гелия APPJ на лишение индуцированной травмы глюкозы в клетках SH-SY5Y. Отличается от предыдущих исследований, наши протокол используется низкодозированные плазменной обработки для применения нейропротекторной без последствий чрезмерной плазмы индуцированной травм, указав, что лечение APPJ может использоваться потенциально как Роман «нет наркотиков доноров «для будущих исследований и даже для клинических перевода. Этот протокол было также предложено, чтобы использоваться как цитопротективного приложение для других типов клетки с различными нарушениями, но условия лечения APPJ следует повторно скорректированные и лечения доза должна быть относительно низкой.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка устройства APPJ
ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Проконсультируйтесь все соответствующие листы данных безопасности материалов (MSDS) перед использованием. Пожалуйста, используйте практики безопасности при выполнении всех экспериментов, в том числе использование вытяжного шкафа и средства индивидуальной защиты (защитные очки, защитные перчатки, лабораторный халат и т.д.). Протокол требует от стандартной ячейки обработки методов (стерилизации, восстановление клеток, клеток пассированый, замораживание клеток, окрашивание клеток, и т.д.).
- Выбрать кварцевая трубка с внутренним диаметром 1 мм и наружным диаметром 3 мм. гладкие разрезов на обоих концах с помощью полировки фольги.
- Использовать никелированные иглы из нержавеющей стали диаметром 1,0 мм как электрод высокого напряжения. Растереть его кончик с радиусом кривизны 0,05 мм. Насадка
- обернуть алюминиевой фольги (2 мм в ширину) вокруг кварцевая трубка на 1 см от кварцевая трубка. Зафиксировать точку иглы из нержавеющей стали на 1 см от конца алюминиевой фольги. Использование алюминиевой фольги кольцо как низкого напряжения электрода.
2. Приобретение самолетов
- для обеспечения сигнала переменного тока, Подключите усилитель мощности высокого напряжения к функции сигнала генератора, который служит в качестве источника питания. Для записи сигналов приложенное напряжение на электроде высокого напряжения, подключите один конец зонда высокого напряжения к цифровой осциллограф и подключите другой конец к источнику питания. Для защиты схемы, используйте 2 k Ω резистор как резистора защитного. Соедените цепь по схеме, как показано на рис. 2.
Предостережение: Не прикасайтесь высоковольтных линий. - Постоянно проходят гелия (объёмная, 99,999%) над кварцевая трубка и контролировать скорость потока газа при стабильной Стандартный 1,4 литра в минуту (ОДС).
Примечание: Мы не используем фильтр перед обработкой клеточных культур. Объемная доля гелия, используемых в эксперименте — 99,999%, и большинство микроорганизмов не может жить в этих условиях. - Включите питание осциллограф, генератор сигнала и усилитель мощности высокого напряжения. Поверните ручку регулировки частоты до 5 кГц. Постепенно увеличивайте напряжения к значению пик пик, 6 кв.
Примечание: Струи достаточно долго (около 3 см) когда пик пик напряжения в иглу значение около 6 кв.
3. Подготовка клетки SH-SY5Y
- растут SH-SY5Y человеческой нейробластомы производные клеточная линия в колбе 2 25 см в RPMI 1640 среднего дополнены 15% плода телячьей сыворотки (ФБС). Сохранить клетки в увлажненные инкубатора, содержащих 5% CO 2 и 95% воздуха при 37 ° с.
- Когда клетки достичь слияния 85%, тщательно аспирационная культуры средств массовой информации и добавить трипсин 0.25% 1 мл + 0.1% ЭДТА в ячейки.
- После 15 s инкубации при комнатной температуре, тщательно аспирационная трипсина и добавить 2 мл RPMI 1640, содержащий 15% FBS нейтрализовать.
- Нежно Пипетка вверх и вниз, мытье в нижней части скважины, до тех пор, пока полностью отсоединяется монослоя SH-SY5Y.
- Подсчитать количество ячеек с помощью Горяева и регулировка концентрации клеток до 2 x 10 5 клеток/мл, добавив RPMI 1640 средний + 15% FBS, а затем передачи 100 мкл суспензии клеток в каждой скважине плиту 96-луночных.
- Позволяют клеткам прикрепить за 12 ч в инкубаторе ячейки перед началом лечения APPJ.
4. APPJ лечение SH-SY5Y
- отрегулируйте расстояние между сопла кварца метро и платформы, где будут размещаться пластину 96-луночных до 3 см. Убедитесь, что луч может коснуться поверхности питательной среды.
Примечание: Не расстояние измеряется от нижней части пластины. Сначала она корректируется до 3 см между сопла кварцевая трубка и платформой, используемой для размещения 96-луночных пластина. - Перед началом лечения APPJ, изменить питательной среды в каждой скважины, за исключением контроля скважин RPMI 1640 без глюкозы среднего.
- Место пластину под APPJ насадку и убедитесь, что струи может стрелять вертикально в каждой скважине.
- Клетки лечения в отдельных скважинах с APPJ 0 s, 1 сек, 2 s, 4 s, 8 s и 12 s.
Примечание: APPJ генерируется ионизирующего гелия ( рис. 1). Клетки, ранены лишением глюкозы рассматриваются 4 s и 8 s поток гелия для устранения последствий гелия на клетки. Все процедуры должны выполняться в трех экземплярах.
5. Жизнеспособность Assay клетки
Примечание: не изменяйте среднего в этом шаге.
- После APPJ лечения, инкубации клеток на 1 ч в инкубаторе ячейки.
- Добавить 10 мкл раствора клеток подсчета Kit-8 (CCK-8) в каждой скважине.
- Инкубации клеток при 37 ° C для 4 х.
Примечание: SH-SY5Y линия клетки чувствителен к глюкозы лишение условий 12. Жизнеспособность клеток уменьшается почти на 50% после лишения глюкозы 1 h, что является условием жизнеспособности оптимальное ячейки для исследования фармакодинамики. CCK-8 имеет не цитотоксичности клетки и клетки инкубируют с реактивом CCK-8 для другой 4 ч в условиях лишений глюкозы после APPJ лечения для проверки жизнеспособности клеток. После 8 h лишение глюкозы и APPJ лечения защитный эффект APPJ была значительно уменьшена, поскольку Лонг продолжительность лишения глюкозы привела к серьезному повреждению клеток SH-SY5Y. Нет никаких свидетельств живых клеток после 24 ч глюкозы лишение 11. - Измерения оптической плотности на 450 нм с Считыватель микропланшетов.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Данные выражаются как среднее ± SD по меньшей мере три независимых экспериментов. Группы результаты были проанализированы для дисперсии с использованием дисперсионного анализа. Все анализы были проведены с использованием программного обеспечения для статистического анализа Призма и p < 0,05 был порог для статистической значимости.
Жизнеспособность клеток была измерена после 4 ч инкубации CCK-8. Как показано на рисунке 3, лишение глюкозы снижение жизнеспособност...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
SH-SY5Y клетки линии клеток человека нейробластомы производные и широко используются как модель соответствующую ячейку в vitro исследования нейротоксичности или нейропротекции12. SH-SY5Y линия клетки был чувствителен к глюкозы лишение условий. Жизнеспособность клеток снизился почти на 50% после лишения глюкозы 1 h, который является условием жизнеспособности оптимальное ячейки для исследования фармакодинамики. Кроме того CCK-8 реагент не цитотоксичности клетки и клетки инкубировали с реакт...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Отсутствие конфликта интересов были объявлены по отношению к этой бумаги.
Благодарности
Эта работа была поддержана в инновационный фонд Пекин нейрохирургический институт (2014-11), Национальный фонд естественных наук Китая (№ 11475019 и 81271286) и Пекине естественных наук фонда (№ 7152027).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| SH-SY5Y клеточная линия | Китай Центр типовых культур Коллекция | 3111C0001CCC000026 | |
| RPMI 1640 среда | Thermo Scientific | 21875091 | хранить при температуре 4 ° C |
| RPMI 1640 среда без глюкозы | Thermo Scientific | 11879020 | хранить при температуре 4 °°; C |
| фетальная телячья сыворотка | Thermo Scientific | 16000044 | хранить при температуре -20°С; C |
| трипсин-ЭДТА раствор | Solarbio | T1300 | хранится при 4°°; C |
| 96 лунок планшет | corning | 3599 | |
| Набор для подсчета клеток-8 (CCK-8) | Dojindo Laboratories | CK04 | хранится при 4 ° C |
| считыватель микропланшетов | Tecan | M200 Pro | для измерения поглощения при длине волны 450 нм |
| Усилитель мощности | Trek | PD06087 | для усиления мощности |
| Функциональный генератор сигналов | MaZe Electronics Science& Технология | AT30120 | для обеспечения специфического сигнала |
| High – Пробник | напряжения Tektronix | P6015A | для детектирования высоковольтного |
| цифрового осциллографа | Tektronix | DPO4104B | для отображения сигнала |
Ссылки
- Yang, S. H., et al. Alternative mitochondrial electron transfer for the treatment of neurodegenerative diseases and cancers: Methylene blue connects the dots. Prog. Neurobiol. , (2015).
- Bhat, A. H., et al. Oxidative stress, mitochondrial dysfunction and neurodegenerative diseases; a mechanistic insight. Biomed. Pharmacother. 74, 101-110 (2015).
- Bullon, P., Newman, H. N., Battino, M. Obesity, diabetes mellitus, atherosclerosis and chronic periodontitis: a shared pathology via oxidative stress and mitochondrial dysfunction? Periodontol. 2000. 64 (1), 139-153 (2014).
- Sutherland, B. A., et al. Neuroprotection for ischaemic stroke: translation from the bench to the bedside. International Journal of Stroke. 7 (5), 407-418 (2012).
- Yan, D., et al. Principles of using Cold Atmospheric Plasma Stimulated Media for Cancer Treatment. Scientific Reports. 5 (5), 18339(2015).
- Lu, X., Laroussi, M., Puech, V. On atmospheric-pressure non-equilibrium plasma jets and plasma bullets. Plasma Sources Science & Technology. 21 (3), 034005(2012).
- Lu, X., et al. Reactive species in non-equilibrium atmospheric-pressure plasmas: Generation, transport, and biological effects. Phys. Rep. 630, 1-84 (2016).
- Lu, X., Naidis, G. V., Laroussi, M., Ostrikov, K. Guided ionization waves: Theory and experiments. Phys. Rep. 540 (3), 123-166 (2014).
- Di, M. S., Reed, T. T., Venditti, P., Victor, V. M. Role of ROS and RNS Sources in Physiological and Pathological Conditions. Oxid. Med. Cell Longev. 2016 (22), 1245049(2016).
- Contestabile, A., Ciani, E. Role of nitric oxide in the regulation of neuronal proliferation, survival and differentiation. Neurochemistry International. 45 (6), 903-914 (2004).
- Yan, X., et al. Protective effect of atmospheric pressure plasma on oxidative stress-induced neuronal injuries: an in vitro study. J. Phys. D: Appl. Phys. 50 (9), 095401(2017).
- Xie, H. R., Hu, L. S., Li, G. Y. SH-SY5Y human neuroblastoma cell line: in vitro cell model of dopaminergic neurons in Parkinson's disease. Chin. Med. J. 123 (8), 1086-1092 (2010).
- Tsutsui, C., et al. Treatment of cardiac disease by inhalation of atmospheric pressure plasma. Japanese Journal of Applied Physics. 53 (6), 060309(2014).
- Graves, D. B. Low temperature plasma biomedicine: A tutorial review. Physics of Plasmas. 21 (8), 104-117 (2014).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
