Поколение моделей клеток рака простаты сопротивления против митотическая агент доцетаксел

Увеличение скорость распространения, вызванные потерей контроля клеточного цикла является отличительной чертой рака¹. Это функциональное свойство оказывает раковые клетки однозначно зависит от точности ключевых процессов клеточного цикла во время S - и М-фазы, которая привела к развитию различных клеточного цикла нарушается препаратов, которые вызывают повреждение ДНК или митотическая дефектов. Хотя многочисленные анти митотическая агентов, например ингибиторов митотическая киназы или моторов белков, в настоящее время разрабатываются и испытываются в клинических испытаниях, наследие микротрубочек таргетинга агентов (MTA) по-прежнему быть единственный клинически утвержденных подход для ориентация митоз в рак^2,3,4. MTA либо дестабилизировать (винбластин, винкристин, винорелбин) или стабилизировать микротрубочек (taxane производные агентов паклитаксел, доцетаксел или Cabazitaxel) и тем самым предотвратить формирование функционирования митотического шпинделя^5,6. Эти агенты вызвать шпинделя Ассамблеи контрольно-пропускной пункт^7,8, что приводит к длительной митотическая арест и возможного клеточной гибели в культивируемых клеток^9,10 и митотического дефекты в опухоли^{11 ,12} и поэтому полезны для лечения рака простаты¹³большое разнообразие видов рака, среди них.

Наиболее часто диагностируется рак простаты рак и ведущей причиной рака смертей мужчин¹⁴. Antimitotic агенты, такие как Доцетаксел улучшить выживаемость рака простаты пациента и являются опорой в лечении этой болезни по^15,16,17. К сожалению несмотря на первоначальные опухоли усадка, опухолевые клетки часто развиваются лекарственной устойчивости во время лечения. Несколько клеточных механизмов были причастны причиной развития chemoresistance, включая дерегулирование apoptotic и воспалительных пути, или активации/гиперэкспрессия наркотиков измеряем насосов как АТФ привязки кассеты транспортер Р-гликопротеина (P-gp/ABCB1), последний из которых в результате экспорта химиотерапевтических агентов из клетки^18,19. Устойчивость к таксаны также были связаны с другими причинами, такими, как изменения в выражении тубулин изотипов или тубулин мутации, которые препятствуют взаимодействию между наркотиками и его цели ^20,21. Кроме того сопротивление была связана с накоплением нестабильности генома и опухоли неоднородность^22,23. Однако механизмов, способствующих taxane сопротивления являются полностью не поняты, что является очевидным отсутствием терапевтические стратегии, которые препятствуют его внешний вид. Таким образом существует настоятельная необходимость для создания экспериментальных моделей, которые помогают в рассечение этих механизмов и определить новые терапевтические подходы, которые предотвращать развитие резистентности к этим препаратам.

В этой статье мы опишем метод, который позволяет генерировать Доцетаксел стойкие (DR) раковые клетки простаты. Далее мы опишем способы проверки сопротивления статус этих клеток с помощью анализов формирования колонии и количественного RT-PCR. Клетки, производимых этим методом имеют преимущество, изложив многие молекулярные функции в публично доступных человека опухоли образцов баз данных с дополнительным преимуществом, обеспечивая гибкость для выполнения широкого ряда экспериментальных анализов более длительные периоды времени, чем разрешено в образцах опухоли. Эти модели рака терапии сопротивления может быть расширен для многих недель в культуре ткани и среди других подходов, можно генетически манипулировать, визуализируется методами микроскопии и проанализированы для экспрессии генов. Кроме того они могут быть xenotrasplanted в мышах для дальнейшего анализа эффектов для формирования и роста опухоли в естественных условиях. В настоящее время основной альтернативный метод для изучения лекарственной устойчивости в контексте рака простаты является прямой анализ образцов опухоли. Хотя эти примеры представляют очень мощные системы для сбора информации о экспрессии генов и мутационного статуса данной опухоли, доступ к ним может быть весьма ограниченным и они трудно сохранить для дальнейших манипуляций и экспериментального анализа, который легко может быть сделано с клеточных линий, созданных с этот протокол^24,25. Важно отметить, что в будущем, альтернативные подходы, такие, как поколения человека organoids производные непосредственно от пациентов будет очень мощным инструментом и альтернативой нынешней метод^26,27. Поскольку они будут пилки в 3D контексте, что опухоль была в его исходном среде, organoids будет идеальной моделью между клеточных линий и человека опухоли. Тем не менее экспериментальные ячейки модели, описанные в настоящем Протоколе, еще более доступным для поддержания и подходит для более быстрый анализ. Результаты, полученные путем изучения этих клеточных линий можно экстраполировать и подтверждены в образцах и 3D культур. Таким образом этот протокол может представлять интерес для исследователей, стремящихся ячейки модели для изучения механизмов chemoresistance в любой линии клетки, так как наш протокол может быть адаптирована к изучению других наркотиков и типов рака. Методы, описанные здесь легко применять в любой лаборатории, доступным и позволить предварительные исследования молекулярных и клеточных механизмов лекарственной устойчивости.

1. Определение концентрации Доцетаксел вызывает 50% уменьшение в колонии формирования способности (IC50)

Примечание: В настоящем Протоколе, доцетаксел IC50 концентрация проводилась с помощью формирования колонии способность. Могут использоваться альтернативные методы, используемые для оценки жизнеспособности клеток (т.е., МТС анализов), основанный на следователей ' предпочтения.

1. Растут DU145 или 22Rv1 клетки в колбе ² 75 см и подготовить достаточно запас 10 мм Доцетаксел разводят в ДМСО, которые будут использоваться в будущих экспериментах.
2. Плита клетки для определения IC50 доцетаксел, извлеките из колбы, тщательно вымыть клетки с 5 мл PBS и проинкубируйте с 2 мл 0,05% трипсина-ЭДТА для 3-5 минут при 37 ° C для отсоединения клетки с поверхности колбы.
3. Промыть trypsinized клеток из колбы, используя 5 мл свежего СМИ и собирать суспензию клеток в 15 мл. Пелле клетки центрифугированием (300 x g, 3 мин, комнатной температуры (RT)).
4. Удалить супернатант, Ресуспензируйте Пелле клеток в 5 мл свежего СМИ и подсчитать количество ячеек. Разбавления суспензии клеток до 2-2,5 x 10 ⁵ клеток/мл для DU145 и 4-4.5 x 10 ⁵ клеток/мл для 22Rv1, смешайте хорошо закупорить вверх и вниз и семян 2 мл суспензии в каждой скважине двух пластин 6-а.
5. После 24 ч, при впадении в 70-80%, когда клетки добавить эскалации дозы Доцетаксел концентрации 1 Нм, 2,5 Нм, 5 Нм, 10 Нм, 25 Нм, 50 Нм, 100 Нм, 250 Нм, 500 Нм и 1000 Нм для каждой скважины. Лечить управления хорошо с ДМСО на наибольший объем, используемый для Доцетаксел ( рис. 2A).
6. После 72 ч, аспирационная препарат, содержащий средства массовой информации и добавить 2 мл свежего средств массовой информации. В течение примерно 4-5 дней, пластины будет готова для пятнать.
7. Пятно колоний, мыть их мягко с 2-3 мл PBS и инкубировать их с 2-3 мл раствора Фиолетовый Кристалл (0,1% w/v в формалина 10%) для 20 мин внутри культура ткани капот или зонт.
8. Удалить окрашивание раствора и мыть тарелки с мл 2-3 H ₂ O, удалить H ₂ O и просушите пластин.
9. Анализировать результаты визуализации скважинах для определения, какой из них имеет Доцетаксел концентрации, уменьшается жизнеспособность клеток на 50% (IC50). Вручную подсчета колоний с помощью маркер ручка (чтобы избежать подсчета же колонии дважды) и представляют собой процент жизнеспособность клеток в графике ( рис. 2A). Наконец, принимать цифровые изображения пластин для представительства рис (как показано на рисунке 3A).

2. Поколение Доцетаксел устойчивостью клеток рака простаты

Примечание: выполняют клетки лечения, используя тот же запас решение Docetaxel используется для определения концентрации наркотиков IC50 (подготовить достаточно складе заранее для экспериментальных использование). Всегда держите небольшой флакон клеток из предыдущего шага, в случае, если что-то не работает хорошо. Родительские клетки должны вырос параллельно в небольшой флакон на протяжении всей процедуры и подвергается транспортное средство (ДМСО) в соответствующие тома, подражая сумм, используемых в колбах Доцетаксел лечить.

1. DU145 плита или 22Rv1 клеток в колбах ² 150 см, содержащие 20 мл средства массовой информации (3,5 х 10 ⁶ клеток за флакон для DU145 и 6,5 * 10 ⁶ клеток за флакон для 22Rv1). Иметь достаточное количество клеток в конце протокола рекомендуется использовать 10-20 Колб клеток.
2. После 24 часов, когда клетки находятся около 70-80% слияния ( Рисунок 2Б, перед Доцетаксел), добавить Доцетаксел IC50 концентрация, определенный на шаге 1 протокола (5 Нм для клетки, указанных в настоящем протоколе).
3. После 72 ч, аспирационная препарат, содержащий средства массовой информации и добавить свежие, доцетаксел свободных средств массовой информации ( Рисунок 2Б, 72 ч после Доцетаксел). Измените СМИ каждые 3-4 дня. В течение примерно 1-2 недели, устойчивостью клоны будут отображаться очевидным под микроскопом ( Рисунок 2Б, 7 и 14 дней после Доцетаксел).
4. Аспирационная СМИ, тщательно вымыть клетки с 15 мл PBS и проинкубируйте с 4 мл 0,05% трипсина-ЭДТА для 3-5 минут при 37 ° C для отсоединения клетки с поверхности колбы.
5. Ресуспензируйте trypsinized клеток из колбы с использованием 8 мл свежего СМИ. Бассейн клетки от всех обработанных колбы. Пелле клетки центрифугированием (300 x g, 3 мин, RT).
6. Удалить супернатант, Ресуспензируйте Пелле клеток в 20 мл свежего СМИ и тарелка клеток в колбах ² 150 см (3,5 х 10 ⁶ клеток за флакон для DU145 и 6,5 * 10 ⁶ клеток за флакон для 22Rv1).
7. После 24 часов, когда клетки находятся около 70-80% слияния, добавить 5 Нм Доцетаксел (первоначальный IC50 концентрация) снова.
8. Повторите шаги 2,3-2,6 в день 3.
9. После 24 часов, когда клетки находятся около 70-80% слияния, лечить клетки с 2 X Доцетаксел IC50 концентрация (10 Нм для клетки, указанных в настоящем протоколе).
10. Повторить шаги 2.3 до 2,8, дозы эскалации Доцетаксел концентраций (25 Нм, 50 Нм, 100 Нм и 250 Нм), для создания стабильного населения растет в вашем колбах под окончательный высокая концентрация клеток. В более высокой концентрации, дозы эскалации протокол может быть реализован на срок до 6 месяцев до 1000 Нм концентрация достигается ( рис. 1A).

3. Функциональная характеристика приобрела Доцетаксел сопротивление в путем формирования Assay колонии

Примечание: В настоящем Протоколе, chemoresistance проводилась с помощью анализов формирования колонии. Могут использоваться альтернативные методы, используемые для оценки жизнеспособности клеток (т.е., МТС анализов), основанный на следователей ' предпочтения.

1. Пластины 2000 клеток (DU145 или 22Rv1, как родителей, так и Доцетаксел устойчивостью) за хорошо в 6-ну пластины, используя 2 мл СМИ за хорошо.
2. После 24 ч, добавить увеличение концентрации Доцетаксел (родительской клетки: 0.25, 0.5, 1, 2.5 и 5 Нм; Д-р клетки: 50, 125, 250, 500 и 1000 Нм). Для DU145 и 22Rv1 клеточных линий. Добавить ДМСО только одно также как элемент управления на том же томе, используемых для высокой дозы Доцетаксел.
3. После 72 ч, аспирационная препарат, содержащий средства массовой информации и добавить свежие Доцетаксел свободных СМИ.
4. Инкубировать пластины для 1-2 недели до колоний видны под микроскопом.
5. Пятно колоний, мыть их мягко с 2-3 мл PBS и инкубировать их с 2-3 мл раствора Фиолетовый Кристалл (0,1% w/v в формалина 10%) для 20 мин внутри культура ткани капот или зонт.
6. Удалить окрашивание раствора и мыть тарелки с мл 2-3 H ₂ O, удалить H ₂ O и просушите пластин.
7. Проанализировать результат визуализации скважин и вручную подсчета колоний с помощью маркер ручка (чтобы избежать подсчета же колонии дважды) и представляют собой процент жизнеспособность клеток в графе. Цифровые изображения пластин для представительства рисунок ( рис. 3A).

4. Фенотипические характеристики из Доцетаксел сопротивления приобрел фенотип через qRT ПЦР анализа

Примечание: Доцетаксел стойкие (DR) клетки демонстрируют различные выражения профиль, по сравнению с их родителей клеточных линий ^{28 , 29}. Таким образом, успех выделения могут быть проверены qRT ПЦР с праймерами для конкретных маркеры (для последовательностей праймера, обратитесь в раздел материалы; для деталей, обратитесь к разделу результаты). Это должно быть сделано после каждого раунда отбора, начиная после третьего раунда. Кроме того, также возможна оценка Доцетаксел устойчивостью фенотипа, Западный blotting.

1. Извлечь РНК от родителей и Доцетаксел устойчивостью клеток с помощью РНК добыча комплект и после производитель ' s инструкции (см. Таблицу материалы и реагенты для подробной информации). Рекомендуется использовать как минимум 1-2 х 10 ⁶ клеток.
2. Quantify РНК на 260 Нм поглощения, используя спектрофотометр. Для лучших чистоты, 260 Нм/280 Нм поглощения соотношения должен быть близок к 2.0.
3. PerfoRM обратный транскрипции для получения комплементарной ДНК — (cDNA кДНК) с помощью комплекта обратной транскрипции и после производитель ' s инструкции (см. Таблицу материалы и реагенты для подробной информации), используя 1 мкг РНК в 20 мкл реакция смеси (если требуется большее количество cDNA, масштабы реакции микс, соответственно).
4. Подготовить ПЦР-реакции в трех экземплярах для каждого гена интереса следующим:
   - 2 мкл 10 мкм вперед грунтовка
   - 2 мкл 10 мкм обратный грунтовка
   - 10 мкл SYBR зеленый ПЦР Мастер микс
   - 5 мкл H ₂ O
   -1 мкл недавно подготовленный cDNA от шаг 4.3.
   Примечание: Смотрите Таблицу материалы для последовательностей грунты, используемые в настоящем Протоколе.
5. Установите программу PCR следующим:
   - 95 ° C в течение 15 мин
   - 94 ° C за 30 s |
   -56 ° C 40 s | 40 раз
   - 72 ° C для 30 s |
6. Для анализа результатов ПЦР и определить изменения в экспрессии генов между родительской и доктор образцы, значения порога (Ct) цикла для каждого гена интереса определяются в трех экземплярах и среднем нормированы контроль погрузки (актина тройные среднее ) для DR (Ct DR) и родительской клетки (Ct родителей). Значения для родительской клетки нормализуются к 1. ΔCt (Ct DR - Ct родителей) определяется для получения окончательного мРНК раз изменения и представлены на графике. Увеличение > 2 или снижение < 0,5 считаются значительным и хорошие проверки создания Доцетаксел приобрела устойчивость к фенотипу ( рис. 3B).

Этот протокол будет приводить к генерации Доцетаксел стойкие (DR) клеток рака простаты. Сроки для завершения может варьироваться от 4 до 7 месяцев приводится в схематическое представление протокола шаги в рисунке 1A и 1B рисунок. Времени инвестиции могут отличаться в зависимости от линии клетки выбора и диапазон концентраций наркотиков, как описано в протоколе. Важно отметить, что определение Docetaxel IC50 концентрации для каждой ячейки строки позволяет дизайн эскалации диапазон концентраций препарата для использования в протоколе для клеток выбора (рис. 2A). После запуска протокола, первоначальный Доцетаксел воздействие на DU145 и 22Rv1 клетки могут наблюдаться в разное время точках под микроскопом, чтобы контролировать Если протокол работает должным образом. Предложил моменты времени для наблюдения за процессом лечения Доцетаксел являются: прежде чем воздействия (базовый), доцетаксел после воздействия Доцетаксел за 72 часа, 7 дней и 14 дней. Обратите внимание, что лишь меньшинство опухолевых клеток выжить Доцетаксел экспозиции и создавать клоны, которые можно наблюдать под микроскопом (Рисунок 2Б).

Представитель колонии формирования анализов и количественной оценки графиков родительских и созданный Доцетаксел стойкие (DR) клетки показаны на рисунке 3A. Обратите внимание, что созданный Доцетаксел устойчивостью клеток может выжить концентрации наркотиков до Гарибова выше, чем родительский клетки.

Наконец Доцетаксел устойчивостью фенотип может быть проверен qRT ПЦР (рис. 3B). Обратите внимание, что Доцетаксел устойчивостью клеток, по сравнению с родительской клетки, отображения характерных вверх регулирование ABCB1 и GATA2 и вниз регулирование CK19 и CDH1. Эти гены были отобраны для проверки, потому что мы уже экспериментально показали в нашем ранее опубликованной работе GATA2 upregulation и Даунрегуляция CK19 вместе с CDH1 в обоих DR ячейки модели28,29. Ген ABCB1 также был выбран в качестве основных генов, проявленная другими быть последовательно upregulated в лекарственной устойчивостью клеток18,19. Однако важно отметить, что другие гены могут быть выбраны согласно литературе и в зависимости от модели клетки и наркотиков, выбрали для генерации устойчивостью клеток на исследователя.

Рисунок 1: временная шкала для поколения Доцетаксел устойчивых моделей клеток рака простаты. (A) представитель диаграмма временной шкалы протокол для генерации Доцетаксел устойчивостью клеток моделей. Иллюстрация изображает Доцетаксел лечения, проверочные шаги и время, необходимое для каждой части. (B) схематическое представление шагов проверки протокола, включая анализы формирования функциональных колонии родителей и Доцетаксел устойчивостью клеток, относились с указанной концентрации Доцетаксел за 72 ч (в красном), представитель граф процент колонии и qRT ПЦР для фенотипические проверки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: поколение Доцетаксел устойчивостью клеток рака простаты модели систем. (A) диаграмма, изображающая Определение Docetaxel IC50 в родительский простаты рак клеточных линий, DU145 и 22Rv1 (шаг 1 из протокола). Ожидаемый процент жизнеспособность клеток и доцетаксел, дозы эскалации концентрации требуется включены в стоимость номера. Представитель DU145 и 22Rv1 клетки жизнеспособности графики, указывающее 5 Нм как IC50 после 72 ч Доцетаксел воздействия включены. Эксперименты triplicates и данные представляют собой среднее ± SD. (B) представитель светлые области изображения микроскопия DU145 и 22Rv1 клеток на указано время поколения Доцетаксел сопротивления (шаг 2 из протокола). Красные стрелки показывают Доцетаксел устойчивый клон после завершения протокола. Масштаб баров = 50 Нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: функциональные и фенотипические характеристики Доцетаксел устойчивостью клеток моделей. (A) представитель колонии анализов формирования родительских и Доцетаксел устойчивостью клеток, относились с указанной концентрации Доцетаксел за 72 ч. процент колоний для каждого лечения концентрация представлена в графе включены. Эксперименты, triplicates и данные представляют собой среднее ± SD. масштаба бары = 5 mm. (B) DR/родительского относительный раза мРНК увеличение количественно qRT-ПЦР ABCB1, GATA2, CK19 и CDH1 отображаются. Все ПЦР необработанные данные нормируется актина (см. протокол для подробной информации). Эксперименты triplicates и данные представляют среднее ± SD. * p < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.