$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Эта статья описывает использование чип-платформы (рис. 1) для трехмерного выращивания клеточных линий, а также первичные ячейки. Так как многие клетки выразить органотипической функции только в 3D-среде, мы разработали чип полимера, который обеспечивает эшафот которой клетки могут придерживаться во всех пространственных направлениях, и которые могут быть установлены в биореакторе жилья для контроля потока жидкости , напряжения кислорода и т.д. В зависимости от экспериментального проектирования поверхности полимера могут быть изменены различными методами, например, УФ-облучение, PECVD, γ-прививкой или обычной мокрой химии.
Рисунок 01
1. Де-аэрации и hydrophilisation микросхемы
Перед использованием чип должен быть деаэрированной и hydrophilized. Для этого, алкоголь серии осуществляется. Изопропанол решений, состоящих из 100%, 70%, 50%, 30% изопропанола в ДМФХ-очищенной воды готовятся и чип, смоченной в каждой концентрации, начиная с 100%-ный раствор, на срок до 30 лет. На заключительном этапе серии состоит из чистого Диметил pyrocarbonate (ДМФХ)-очищенной воды. С этой точки зрения, очень важно держать чип влажным.
2. Коллаген я покрытием
После алкоголя серии чипов, как правило, покрыты коллагена I решение от крысиного хвоста. Из решения коллагена запас 2 мг / мл в 0,2% уксусной кислоты аликвоту соответствующий 30 мкг белка коллагена разбавляют ДМФХ обработанных водой до конечного объема 150 мкл. Это приводит к коллагена покрытие поверхности чипа с плотностью 10 мкг коллагена я на см 2 площади поверхности.
3. Прививка клеток гепатоцеллюлярной карциномы
Гепатоцеллюлярной карциномы клетках линии Hep G2 являются трипсином и подсчитаны. Для краткосрочных экспериментов (от 1 до 6 дней) 5 * 10 6 клеток засевают в каждом чипе и соответствующий регулятор 6 см культуре ткани чашки Петри. Для inoculte, чип 5 * 10 6 клеток ресуспендируют в 150 мкл культуральной среде и размещены на верхней части микроструктурированных области чипа (рис. 2). После этого его помещают в инкубатор на 2-3 часа. В течение этого инкубационного периода клетки осадка в микро-контейнеров и придерживаться коллагена I-покрытием эшафот.
Рисунок 2
4. Введение чипа в биореакторе жилья
После инкубационного периода, чип будет удален из инкубатора и монтируется в биореакторе жилья. Для этого, в чистом столе, собранном биореактор удаляется из стерильной упаковки и разобрали до такой степени, что дает возможность вставки чипа. Чип тщательно обрабатываются стерильным пинцетом и помещают в паз, который содержит прокладку которых печатями чипа и в результате чего поколение верхнего и нижнего отсека в биореактор. Затем, биореактор собирается снова и переданы инкубатор, где это связано с насосом, газоснабжения и анализатора кислорода.
5. Заполнение системы
Как только биореактор подключен к среде водохранилища, насосные и газоснабжения замкнутого контура циркуляции заполнена средой. Это делается путем установки 3-полосная-разъемы таким образом, что superfusion, которая определяется как поток среды по верхней части чипа, достигается. Это приводит к сброса воздуха из закрытых биореактор обращение без удаления клеток из леса. После того как система полностью заполнена средой, 3-полосная-разъемы переключаются таким образом, что перфузии, которая определяется как поток снизу чипа через ткань, достигается. В перфузии конфигурации потока с учетом потребностей клетка, которая на гепатоциты обычно составляет от 60-500 мкл / мин.
6. Отбор проб
В ходе эксперимента средний образцы могут быть сделаны. Для этого, шприцы подключены к стерильным порты на вершине среды водоема. После отбора проб, порты стерилизуют при 70% изопропанола.
7. Выделение интактных клеток с чипом для последующих применений
В конце эксперимента, биореакторы отключены от газоснабжения и роликовый насос, переведен в чистом столе и разбираются, как описано выше. С стерильных щипцов чип будет удален из биореактора жилья, размещенныев 3,5 см блюдо Петри и промывали PBS. После этого чипа инкубируют с трипсин / ЭДТА (0,25% / 0,53) в течение 5-15 мин в инкубатор, чтобы отделить клетки от микроструктурированных области. Собранных клеточной суспензии центрифугируют в течение 5 мин при 600 g. Клетки могут затем быть использованы для обычных приложений вниз по течению, например, общей РНК или белка изоляции. Регулярно, мы выделяем общую РНК (ПАРИЖ комплект, Амбион Inc, Остин, штат Техас, США) для микрочипов анализа в режиме реального времени RT-PCR. Белки выражение анализируется после иммуногистохимического окрашивания клетки внутри чипа с лазерного сканирующего микроскопа, но также могут быть проанализированы в противном случае, например, с помощью проточной цитометрии.