Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выражение Экзогенные антигены в вакцины БЦЖ Mycobacterium bovis через Non генетические поверхности украшения с системой авидин биотин

8.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56421

⸱

31 января 2018 г.

 ,  ,  ,  , 
1Division of Infectious Diseases, Department of Medicine and Vancouver Costal Health Research Institute, University of British Columbia, 2Institute of Biomedical Technology, University of Tampere

В этой статье

Краткое содержание

Представлен Роман технику для быстрого антигена отображения на бактериальных поверхности, которая включает поверхности biotinylation последующим воздействием протеинов интереса в fusion с мономерных авидин. Загрузка БЦЖ с выбранной антигены успешно улучшает его иммуногенность, предполагая, что поверхности украшения может заменить традиционные генетические подходы.

Аннотация

Туберкулез (ТБ) является серьезных инфекционных заболеваний и доступны только вакцина M. bovis бациллы Кальметта-Герена (БЦЖ) является безопасным и эффективным для защиты от детей с тяжелой Туберкулезный менингит и некоторых форм распространения туберкулеза, но не может защитить против туберкулеза легких, которая является наиболее распространенной формой заболевания. Перспективные стратегии по улучшению БЦЖ в настоящее время опираются либо на ее преобразование с гены, кодирующие immunodominant микобактерий туберкулеза (Mtb)-специфических антигенов и/или дополнения с гены, кодирующие сопутствующие факторы, стимулирующие антигена Представляя клеток. Основные ограничения на эти подходы включают низкая эффективность, низкая стабильность и неопределенность уровня безопасности векторов выражения. В этом исследовании мы представляем альтернативный подход к улучшению вакцина, которая состоит из БЦЖ взаимодополняемости с экзогенной протеинов интереса на поверхности бактерий, вместо преобразования с плазмид кодирования соответствующих генов. Во-первых, протеинов интереса выражаются в fusion с мономерных авидин в стандартных E. coli системы выражения и затем используется для украшения поверхности биотинилированным БЦЖ. Эксперименты на животных с использованием поверхности БЦЖ, украшенные суррогатной овальбумина антигена продемонстрировать, что измененные бактерии полностью иммуногенность и способны индуцировать Т-клеток конкретных ответов. В целом данные, представленные здесь сильно поддержка Роман и эффективный метод меняет текущий вакцины БЦЖ, который заменяет трудоемкий подход обычных взаимодополняемости с экзогенной нуклеиновых кислот.

Введение

Чтобы заменить текущий туберкулеза вакцины БЦЖ, включая белка адъювантной систем, вирусный векторной технологии, аттенуированные штаммы живой M.tb и генетически модифицированных штаммов БЦЖ, либо ввести гены были предложены различные стратегии чрезмерно выражая БЦЖ антигены, которые не выразили достаточно во время инфекции1 или Mtb-специфических антигенов не представляют в БЦЖ2. Генная инженерия, однако, сталкивается множество барьеров, включая неопределенность уровень безопасности, трудоемкий процесс и низкая эффективность выражения векторов4,5. Что касается улучшения БЦЖ, альтернативный подход необходима для повышения иммуногенности без необходимости неопределенной генетических изменений.

В этом исследовании мы представляем новую стратегию для отображения рекомбинантных протеинов интереса на поверхности клеток БЦЖ, которая основана на известной высокоспецифичные авидин взаимодействие с биотин. Этот подход позволяет быстрое и воспроизводимые вложение рекомбинантных авидин синтез белков на поверхности биотинилированным БЦЖ, который способствует широкий манипуляции БЦЖ для достижения максимального улучшения его эффективность при сохранении его отличную безопасность Запишите, что наблюдавшееся в течение десятилетий использования.

Авидин сродство для биотина чрезвычайно высока (Kd = 10−15 М) и после того, как сформирована, биотин авидин комплекс очень стабильна и может быть нарушена только под денатурации условия6. Однако для этого типа взаимодействия в качестве альтернативного метода передачи гена, требуется долгосрочный но обратимые отображения рекомбинантных белков. Таким образом, мы представили здесь низкого сродства мономерных авидин (Kd = 10−7 М) приводит к обратимым выпуска белка от поверхности украшены БЦЖ раз попадает внутрь антиген представляющих клеток. Для того, чтобы предоставить доказательство концепции, мы протестировали этот метод с помощью мономерных авидин химерных белка, соответствующий суррогат антигена, производный от овальбумина (OVA)7,8. Результаты показали, что БЦЖ клеточной поверхности могут быть легко и быстро украшены мономерных авидин синтез белков и что эта привязка к поверхности БЦЖ является стабильным и воспроизводимые без обнаружить изменения в бактериальных роста и выживания. Кроме того, мы обнаружили, что БЦЖ, украшенные мономерных авидин сливается с OVA (AviOVA) может вызвать иммунный ответ аналогичен индуцированных БЦЖ генетически выражая же антигена в пробирке и в естественных условиях. Эта технология реверсивные отображения протеинов интереса на поверхности бактериальной поэтому является эффективной заменой традиционных гена передачи подходов и может обеспечить платформу для широкого манипуляций БЦЖ и дальнейшего применения вакцины развития.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все животные были сохранены в соответствии с протоколами, утвержденных животных уход и использование комитетами в университете Британской Колумбии. Эксперименты были утверждены животное уход и использование комитетами и выполняется согласно Канадского совета по руководящим принципам ухода животных. Номер социального обеспечения животных гарантии — A11-0247.

1. поколение мономерных авидин синтез белков, выражая плазмиды

  1. Югу клонировать мономерных авидин последовательность12 в плазмиду pDEST17 между «КТК» и «ГАА» сайты, которые соответствует 133-134bp. (то есть, между 6-histag и pDEST17 сайта Attr1 рекомбинации) для получения p17-Avi.
    Примечание: Последовательность ДНК мономерных авидин показана ниже. Три мутации в авидин одичал типа для получения мономерных авидин отображаются полужирным шрифтом.
    gccagaaagtgctcg ctgactggga aatggaccaa cgatctgggc КТСУВДatga ccatcggggc tgtgaacagc
    agaggtgaat tcacaggcac ctacatcaca gccgtaacag ccacatcaaa tgagatcaaa gagtcaccac tgcatgggac
    ACAAGCTАКК atcaacaaga ggacccagcc cacctttggc ttcaccgtca attggaagtt ttcagagtcc accactgtct
    tcacgggcca gtgcttcata gacaggaatg ggaaggaggt cctgaagacc atgtggctgc tgcggtcaag tgttaatgac
    attggtgatg acАААaaagc taccagggtc ggcatcaaca tcttcactcg cctgcgcaca cagaaggagt га
  2. Дизайн грунты с AttB1 и AttB2 сайты, соответствующие OVA полипептид757-1035 (b-A - и H-2_Kb-ограничено epitopes) последовательности ДНК. Грунтовка последовательности являются: Attb1-OVA
    GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCTTGAGCAGCTTGAGAGTAT и Attb2-OVA
    GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACCCTACCACCTCTCTGC. (Attb1 и b2 последовательности Attвыделены жирным шрифтом).
    1. ПЦР усиливают OVA полипептид757-1035 последовательность ДНК с праймерами выше с помощью pUC57-ЯЙЦЕКЛЕТКИ плазмида как шаблон.
    2. Клонировать продуктов ПЦР в pDONR-221 через участкам в vitro рекомбинации реакцию (например, BP Clonase) для получения pDONR-OVA.
  3. Перенос гена интереса в p17-Avi с помощью LR Clonase реакции для получения p17-Avi-OVA.
    Примечание: Для деталей BP и LR рекомбинации клонирования, смотрите руководство изготовителя.

2. мономерные авидин синтез белков, очистки и складывая

  1. Трансформировать p17-Avi-ЯЙЦЕКЛЕТКИ плазмида в E. coli BL21 и побудить 250 мл E. coli BL21 культуры с IPTG (0,1 М) за 3 ч при 37 ° C.
  2. Лизис бактерий и включение органы солюбилизация
    1. Пелле 250 мл индуцированных BL21 культуры 30 мин центрифугирования 4000 x g и при 4 ° C.
    2. Собирать окатышей в 10 мл буфера lysis (50 мм трис-HCL, 150 мм NaCl, 6 M гуанидина-HCL, рН 1,5-2,5) и Инкубируйте 15 мин при 95 ° C. Инкубируйте на ночь при комнатной температуре на ротатора.
    3. Центрифуга 30 мин на 15000 x g и 4 ° C и собирать супернатант.
  3. Очищайте Avi-OVA от супернатант (растворимых включения органов фракция) с помощью Ni НТА столбцов.
    1. Развести органы включение 1:2 с буфера lysis.
    2. Используйте 4 мл Ni-НТА смолы на 250 мл культуры производные включения органов.
    3. Вымойте 3 x с 10 мл буфера lysis (рН 7,0).
    4. Элюировать с 10 мл буфера (лизис буфер рН 7.0 с 250 мм имидазола).
  4. Сворачивают eluted белка путем постепенного разбавления (1:10) и быстрое vortexing в трис-буфере (рН 7,5), содержащие 1 мм DTT, 200 мм NDSB256 (3-(Benzyldimethylammonio)propanesulfonate), 0.5 мм 80 анимации, аргинин 500 мм и 200 мм NaCl на 30 минут при комнатной температуре.
  5. Де Соль и буфера обмена сложил белка из буфера Tris в PBS с концентраторами белка по данным производителя протоколы.
  6. Удаление агрегатов центрифугированием 30 мин на 3500 x g и на 4 ° C и хранить аликвоты растворимого белка при-20 ° C.

3. Biotinylation БЦЖ клеточной поверхности

  1. Расти БЦЖ в Мидлбрук 7H 9 бульон с 10% OADC (олеиновая кислота, раствор альбумина и декстроза) и 0,05% 80 анимации при 37 ° C на платформе шейкер 50 об/мин до OD = 0,5-1.
    Примечание: БЦЖ патогена 2-го уровня биобезопасности и все эксперименты, касающиеся БЦЖ должно быть сделано в области биобезопасности, кабинет с надлежащего личного защитного оборудования.
  2. Вымойте 109 БЦЖ 3 раза с 500 мкл ледяной эндотоксина бесплатно PBS плюс 0,1% Tween80 (PBST) (рН 8,0). Приостановите Пелле БЦЖ в стерильных эндотоксина бесплатные PBS.
  3. Непосредственно перед применением Подготовьте 1 мл 10 мм СС сульфогруппу-NHS биотина в стерильных фильтрованной воды.
    1. Инкубируйте бактерий с 1 мл 0,5 мм СС сульфогруппу-NHS биотина при комнатной температуре за 30 мин.
  4. Вымойте помечены бактерий 3 раза с 500 мкл ледяной холодного PBST для удаления не отреагировал biotinylation реагента.
    1. Вновь приостановите Пелле в 1 мл PBST.
  5. Для оценки эффективности biotinylation, пятно 108 биотинилированным БЦЖ с стрептавидина-FITC (1: 100, 25 мкл) при комнатной температуре в течение 20 мин.
    1. Инкубировать окрашенных бактерий в 1 мл 2% PFA для 20 мин при комнатной температуре и затем проверять уровни biotinylation путем анализа цитометрия потоков.

4. фенотип биотинилированным микобактерии: рост и выживание

  1. Расти штаммов БЦЖ в Мидлбрук 7H 9 бульон с 10% OADC (олеиновая кислота, раствор альбумина и декстроза) и 0,05% 80 анимации при 37 ° C на платформе шейкер 50 об/мин.
    1. Запись оптической плотности (600OD) бактериальной культуры над 8-дневный период.
  2. Использование БЦЖ-Люк (ранее описанных9) для обнаружения выживания бактерий в макрофагах.
    1. Заразить клетки RAW264.7 с биотинилированным БЦЖ-Люк (МВД 10:1) или необработанной БЦЖ-Люк (контроль) и инкубировали при 37 ° C в течение 48 часов периода времени.
    2. Вымойте монослои ячейки и затем лизируют с 0,025% SDS освободить организм бактерий.
    3. Мера биолюминесценции производство с системой Люцифераза пробирного и люминометра.
      Примечание: Сигнал люминесценции является показателем бактериального жизнеспособности. Пожалуйста, обратитесь к руководству производителя для деталей Люцифераза пробирного.

5. Связывание мономерных авидин синтез белка биотинилированным БЦЖ поверхности

  1. Смешайте 5 x 108 биотинилированным БЦЖ с Avi белка (10 мкг/мл финал в PBS-T) за 1 ч при комнатной температуре на платформе шейкер.
  2. Бактерий мыть 3 раза с 500 мкл ледяной холодной PBST и пятно с кролик антитела анти авидин (Ab) (разбавления 1: 100, ранее описанных10) для 20 мин при комнатной температуре, а затем с FITC конъюгированных коза анти кролик IgG Ab в тех же условиях.
  3. Промойте бактерий 3 раза с 500 мкл PBST и анализировать подачей cytometry оценить степень поверхности украшения.

6. лиофилизация микобактерий

  1. Biotinylate бактерии согласно шаг 3.1-3.4 и пальто биотинилированным бактерий с Avi-OVA по шаг 5.1.
  2. Аликвота биотинилированным и покрытые бактерий (108), мыть с PBS и вновь приостановить в 0,5 мл лиофилизации СМИ (средний Sauton 25%, 75% H2O и 1,5% Na глутамата).
  3. Передача бактерий в стеклянных флаконах и заморозить в морозильной камере-80 ° C на ночь.
  4. Lyophilize заполненные и замороженные стеклянные пробирки на 24 часа, с использованием замораживания сушки.
  5. Хранить сушеные образцов при комнатной температуре и воссоздания в PBS при необходимости.
  6. Повторите шаг 3.5 для оценки biotinylation и поверхности покрытия стабильности.

7. фагоцитоз Assay

  1. Рост клеток макрофагального RAW 264.7 в 10 см диаметр культуры блюда в DMEM средних содержащие FCS 5%, 1% L-глютамин, HEPES, несущественные аминокислот и пенициллина и стрептомицина до 70-80% confluency.
  2. Семенной 2 x 106 RAW 264.7 макрофагов ячейки в пластине 6-хорошо. Позволяют клеткам присоединиться на ночь при 37 ° C и 5% CO2.
  3. Генерировать DsRed БЦЖ (ранее описанных9) украшены Avi-OVA (DsRed БЦЖ-Avi-OVA) согласно шаги 3.1-3.4 и 5.1.
  4. Заразить RAW клетки с DsRed БЦЖ-Avi-ЯЙЦЕКЛЕТКИ или необработанной DsRed БЦЖ в мои 20:1 в течение 24 ч при 37 ° C.
  5. Вымыть клетки три раза и trypsinize с помощью 1 мл 0,25% трипсина при 37 ° C 10 мин для удаления частично отдельностоящий бактерий.
  6. Исправить в 2,5% ПФА в PBS для 20 мин при комнатной температуре.
  7. Вымойте 3 x с PBS и анализировать проточной цитометрии.

8. внутриклеточных торговлей OVA оформленный биотинилированным БЦЖ в макрофагах

  1. Микроскопии флуоресцирования
    1. Семя 3 x 105 RAW 264.7 макрофагов ячейки на coverslips в пластине 24-хорошо. Позволяют клеткам присоединиться на ночь при 37 ° C и 5% CO2.
    2. Заразить клетки макрофагального с микобактерий (МВД 10:1) в средствах массовой информации содержание без антибиотиков при 37 ° C и 5% CO2 для 4-24 ч.
    3. Вымыть клетки и trypsinize для удаления поверхности вложения, не в организм бактерии как шаг 7.5.
    4. Исправить зараженные клетки в 2,5% ПФА в PBS для 20 мин при комнатной температуре следуют 3 стирок с PBS.
    5. Разрушения клеток в буфере блокирование/permeabilization (0.1% тритон X-100, 3% BSA в PBS) для 20 мин при комнатной температуре.
      1. Использование специфическое антитело интерес (например, кролик анти авидин Ab) в 10 мкг/мл в permeabilization буфер для 20 мин при комнатной температуре после вторичного антитела (например, FITC-коза анти кролик IgG) за 20 мин.
    6. Вымыть клетки 3 x с PBS, один раз с водой и горе на слайды в 10 мкл водный монтажа среды к минимуму флуоресценции Фотообесцвечивание.
    7. Изучить слайды по цифровой confocal микроскопии с помощью эпифлуоресцентного микроскопа с 63 x / 1.4 план-Апохромат цель. Запись изображения с помощью цифровой камеры в сочетании Микроскоп программного обеспечения.
  2. Immunogold окрашивание и электронной микроскопии
    1. Семенной 2 x 106 RAW 264.7 макрофагов ячейки в 6-ну пластины.
    2. Исправить БЦЖ зараженные макрофаги с 4% PFA для 4 ч при комнатной температуре.
    3. Стирайте образцы дважды с PBS.
    4. Внедрить образцы в 4% агарозном низкой температурой плавления и обезвоживанию в 70% этиловом спирте.
    5. Передача образцов акриловой смолы и полимеризации при 50 ° C.
    6. Вырезать из 60 Нм секции с микротом и собирать разделы на никель сетках.
    7. Ярлык образцы с 10 мкг/мл авидин антитела для 1 ч при комнатной температуре или 4 ° C на ночь в растворе инкубации (PBS и 0,1% BSA) и затем промойте инкубации решения золото конъюгированных F(ab')2 ультра-малых коза анти-кролика IgG (1/20) за 1 ч в комнате Температура инкубации решения.
    8. Вымойте секций в дистиллированной воде, пятно в низкотемпературном растворе глютаральдегида 2%, мыть, сухой воздух и изучить с микроскопом.

9. животных иммунизации и орган обработка

Примечание: Все шаги должно быть сделано в области биобезопасности кабинета.

  1. Перевал биотинилированным и белка покрытием бактерий через иглу 271/2G 10 раз сделать одну ячейку подвеска.
  2. Возьмите 1 х 106 бактерий в 100 мкл бесплатно эндотоксина PBS и иммунизацию женщин C57BL/6 мышей (b-A, H - 2 Kb, 5-6 неделе старый) подкожно в загривок шеи.
    1. Внедрить контроль мышей с 100 мкл PBS одиночку.
  3. Усыпить иммунизированной мыши 20 дней после иммунизации на CO2 ингаляции следуют шейки матки дислокации.
    1. Изолировать селезенки и перевести его в RPMI СМИ.
  4. Маш селезенки через стрейнер ячейки 70 мкм с плунжером шприц 5 мл.
    1. Вымойте с 5 мл RPMI. Центрифуга (800 x g, 3 мин), чтобы изолировать одну ячейку подвеска.
    2. Разрушающим РБК с мыши биотина положительный выбор комплекта с биотин Ter119/эритроидные клетки Ab.
    3. Центрифуги и вновь приостановить клетки в 10 мл полной RPMI (10% FCS, 1% L-глютамина, 1% пенициллин, стрептомицин 1% и 50 мкм 2-ME).

10. я-Ab Тетрамер окрашивания для определения частоты антиген-специфические CD4+ Т-клеток и внутриклеточных цитокинов окрашивания по для определения частоты из антиген-специфические T клетки освобождения цитокинов в иммунизированных животных

  1. Тетрамер пятнать
    1. Пятно splenocytes от контроля и иммунизированной мыши (~ 20 x 106 клеток) с PE-конъюгированных Ab-OVA323-339 тетрамера (1/12,5 разрежения) за 1 ч при 37 ° C в буфере привязки (PBS с FCS 2% и 0,1% НАН3).
    2. Добавьте AF647 CD4 Ab (1:25) и 7-AAD (для выявления мертвых клеток) в splenocytes 20 мин при комнатной температуре.
    3. Анализировать образцы проточной цитометрии.
    4. Приобрести 500000 события в регионе положительный CD4 для определения частоты Тетрамер позитивные события.
      Примечание: Общая splenocytes определяются по помаркой точка SSC/FSC, живые клетки путем исключения 7-AAD позитивные события и CD4 подмножеств стробирования AF647 позитивные события.
  2. Частота антигена конкретных внутриклеточных цитокинов, выпуская Т-клеток
    1. 7 splenocytes передачи примерно 1 × 10 в 4 мл полного RPMI среды в шести ну пластины с или без рекомбинантных OVA (10 мкг/мл) и инкубировать на 16 h.
    2. Лечить клетки с Brefeldin (1:1, 000) для дополнительных 5 h.
    3. Вымойте с PBS и при условии внутриклеточных цитокинов, окрашивание следующим образом:
      1. Пятно образцы клетки с PE-CD8 или PE-Cy7-CD4 Ab (1:50 в буфере привязки) при комнатной температуре за 30 мин.
      2. Исправить в 4% PFA при комнатной температуре в течение 20 мин.
      3. Разрушения с помощью permeabilization решение, в соответствии с инструкциями производителя.
      4. Вымойте клетки и этикетка с AF647-конъюгированных ИФН γ Ab (1:50) для 20 мин при комнатной температуре.
      5. Вымыть клетки и cytometry анализ потока как описано выше.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

С общие процедуры, описанной выше был рассмотрен возможности БЦЖ поверхности biotinylation и украшения с суррогатной антигена OVA. Иммуногенность модифицированных БЦЖ была затем испытания в естественных условиях. Поверхности бактериальной легко помечены биотина для быстрого отображения авидин химерных антигены без каких-либо обнаружить изменения в бактериальных фенотипов. Результирующее изменение БЦЖ эффективно заглатывается клетки презентации антигена и может вызвать иммунный от...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы сообщали в этом исследовании Негенетические подход для быстрого и эффективного отображения внешних белков на поверхности БЦЖ добавить конкретные антигены или конкретных функциональных свойств, ожидается эффективного повышения иммуногенности бактерии. Мы продемонстрировали, что БЦЖ клеточной поверхности может быть легко биотинилированным для мгновенной поверхности украшения с белками авидином фьюжн. Общая процедура может быть выполнена в течение 2 ч, в то время как генетическая трансформация и подбор положительных клон...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы благодарим д-р R Стоукс для штамма БЦЖ Пастер и Талал A. для технической поддержки. Мы также благодарим GenScript за помощь с Джин синтеза.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Технологии стволовых клеток RPMI 1640, не содержащие эндотоксинов 36750
Sulfo-NHS SS биотинThermo Fisher 21328
FITC-конъюгированный стрептавидинSigma-AldrichS3762
Phycoerythrin (PE)-конъюгированный I-Ab-OVA323-339 tetramer МБЛ Интернэшнл TS-M710-1
7-AADBD Pharmingen559925
TALON полигистидин-смола для очистки Clontech635501
Alexa Fluor (AF) 647 конъюгированный крысиный антимышиный CD4BD Bioscience 
AF647 крысиный антимышиный ИФН-гBD Bioscience 
AF647 крысиный антимышиный I-A/I-EBD Bioscience 
PeCy7 крысиный антимышиный CD4BD Bioscience 
ПЭ крыса антимышиный CD8 AbBD Bioscience 
AF 647 крыса антимышиный H-2kbBD Bioscience562832
FITC-конъюгированное козье антитело к кроликуThermo Fisher31635
AF 647 крыса антимышиный CD4BD Bioscience 
Ультра-маленькая золотая конъюгированная козья анти-кроличья IgGЭлектронная микроскопия Sciences25100
Middlebrook 7H9 бульонBD Диагностические системы271310
OADCBD Диагностические системыB11886
Tween 80Sigma-AldrichP1379
RAW 264,7 мышиные макрофагальные клеточные линииАмериканский тип Коллекция
pDEST17 плазмидаИнвитроген11803012
плазмиде pUC57-OVA Клоназа GenScriptSD1176
BP Инвитроген11789020
клоназа LR Колонки Invitrogen11791043
pDONR221Plasmid Invitrogen12536017
Ni-NTA Qiagen31014
Концентраторы белка Pierce Термо Фишер 88527
FlurosaveCalbiochem-Novabiochem345789
Axioplan II эпифлуоресцентный микроскопCarl Zeiss Inc
CCD цифровая камера Retiga EX, QImaging
Tecnai G2 200 кВ FEI CompanyG2 200Kv 
70μ m Сетчатый фильтр для соколиной клетки Термо Фишер 87712
Набор для положительного отбора биотина мыши EasyStep Стволовые клетки18556
биотин-Ter119/Эртироидные клетки антителаBioLegend116203
Brefeldin ABD Pharmingen555029
набор Cytofix/Cytoperm BD Pharmingen554714
Bright-Glo люциферазная системаPromegae2620
Turner Biosystem люминометрPromegaTD-20/20
Leica EM UC6 микротом  Leica MicrosystemsUC6
Novalyphe NL 500 сублимационная сушилкаSavant Instruments NL 50
Уитон боросциликатный стеклянный флаконWheaton  ВВР 66011-675
557681557735562367552775561095557681культурЭлектронный микроскоп

Ссылки

  1. Horwitz, M. A., Harth, G. A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis. Infect. Immun. 71 (4), 1672-1679 (2003).
  2. Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nat Med. 9 (5), 548-553 (2003).
  3. Grode, L., et al. Increased vaccine efficacy against tuberculosis of recombinant Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin mutants that secrete listeriolysin. The J Clin Invest. 115 (9), 2472-2479 (2005).
  4. Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A. Recombinant Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 27 (47), 6495-6503 (2009).
  5. Mederle, I., et al. Plasmidic versus insertional cloning of heterologous genes in Mycobacterium bovis BCG: impact on in vivo antigen persistence and immune responses. Infect Immun. 70 (1), 303-314 (2002).
  6. Singh, N. P., et al. A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity. Cancer Res. 63 (14), 4067-4073 (2003).
  7. Oizumi, S., Strbo, N., Pahwa, S., Deyev, V., Podack, E. R. Molecular and cellular requirements for enhanced antigen cross-presentation to CD8 cytotoxic T lymphocytes. J Immunol. 179 (4), 2310-2317 (2007).
  8. Sharif-Paghaleh, E., et al. Monitoring the efficacy of dendritic cell vaccination by early detection of (99m) Tc-HMPAO-labelled CD4(+) T cells. Eur J Immunol. 44 (7), 2188-2191 (2014).
  9. Sun, J., et al. A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria. Plasmid. 62 (3), 158-165 (2009).
  10. Laitinen, O. H., et al. Rational design of an active avidin monomer. J. Biol. Chem. 278 (6), 4010-4014 (2003).
  11. Flynn, J. L., Chan, J., Triebold, K. J., Dalton, D. K., Stewart, T. A., Bloom, B. R. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
  12. Liao, T. Y. A., Lau, A., Joseph, S., Hytonen, V., Hmama, Z. Improving the immunogenicity of the Mycobacterium bovis BCG vaccine by non-genetic bacterial surface decoration using the avidin-biotin system. PLoS ONE. 10 (12), e0145833(2015).
  13. Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
  14. Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. PNAS. 102 (21), 7583-7588 (2005).
  15. Lesch, H. P., Kaikkonen, M. U., Pikkarainen, J. T., Yla-Herttuala, S. Avidin-biotin technology in targeted therapy. Expert Opin Drug Deliv. 7 (5), 551-564 (2010).
  16. Paganelli, G., Bartolomei, M., Grana, C., Ferrari, M., Rocca, P., Chinol, M. Radioimmunotherapy of brain tumor. Neurol Res. 28 (5), 518-522 (2006).
  17. Cummings, J. F., et al. Safety and immunogenicity of a plant-produced recombinant monomer hemagglutinin-based influenza vaccine derived from influenza A (H1N1)pdm09 virus: a Phase 1 dose-escalation study in healthy adults. Vaccine. 32 (19), 2251-2259 (2014).
  18. Kolotilin, I., et al. Plant-based solutions for veterinary immunotherapeutics and prophylactics. Vet Res. 45, 114-117 (2014).
  19. Demonte, D., Drake, E. J., Lim, K. H., Gulick, A. M., Park, S. Structure-based engineering of streptavidin monomer with a reduced biotin dissociation rate. Proteins. 81 (9), 1621-1633 (2013).
  20. Deghmane, A. E., et al. Lipoamide dehydrogenase mediates retention of coronin-1 on BCG vacuoles, leading to arrest in phagosome maturation. J Cell Sci. 120 (19), 3489-3489 (2007).
  21. Soualhine, H., et al. Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin secreting active cathepsin S stimulates expression of mature MHC class II molecules and antigen presentation in human macrophages. J Immunol. 179 (8), 5137-5145 (2007).
  22. Bubb, M. O., Green, F., Conradie, J. D., Tchernyshev, B., Bayer, E. A., Wilchek, M. Natural antibodies to avidin in human serum. ImmunolLett. 35 (3), 277-280 (1993).
  23. Petronzelli, F., et al. Therapeutic use of avidin is not hampered by antiavidin antibodies in humans. Cancer Biother Radiopharm. 25 (5), 563-570 (2010).
  24. Bigini, P., et al. In vivo fate of avidin-nucleic acid nanoassemblies as multifunctional diagnostic tools. ACS Nano. 8 (1), 175-187 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

MHC
Выражение Экзогенные антигены в вакцины БЦЖ Mycobacterium bovis через Non генетические поверхности украшения с системой авидин биотин
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.