Методическая статья

Определение генома всей стенограммы распада ставок в пролиферирующих и покоя фибробластов

DOI:

10.3791/56423

⸱

2 января 2018 г.

 ,  , 
1Department of Molecular, Cell and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, 2Department of Biological Chemistry, David Geffen School of Medicine, 3Molecular Biology Institute Interdepartmental Program, University of California, Los Angeles

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем протокол для генерации пролиферирующих и покоя первичного кожного фибробластов, мониторинга Стенограмма распада ставки и выявления дифференциально распадаясь генов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Покоя является временной, реверсивные государство, в котором клетки перестали клеточного деления, но сохранить способность размножаться. Несколько исследований, в том числе наша, продемонстрировали, что покоя связан с широко распространенные изменения в экспрессии генов. Некоторые из этих изменений происходят через изменения в уровень или деятельности, связанных с распространением транскрипционных факторов, таких как E2F и MYC. Мы показали, что разрушение мРНК может также способствовать изменения в экспрессии генов между покоя и пролиферирующих клеток. В этом протоколе мы описываем порядок установления пролиферирующих и покоя культуры фибробластов человека дермального плоть. Мы затем Опишите процедуры для ингибирования новой транскрипции в клетках пролиферирующих и покоя с актиномицин Д (АСРТ). АСРТ лечения представляет собой простой и воспроизводимый подход к отделения новой транскрипции от гниения транскрипт. Недостатком АСРТ лечения является, что время курс должна быть ограничена короткого промежутка времени, потому что АСРТ влияет на жизнеспособность клеток. Стенограмма уровни контролируются со временем для определения ставок Стенограмма распада. Эта процедура позволяет для идентификации генов и изоформ, проявлять дифференцированный распада в пролиферирующих против покоя фибробластов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Стационарном уровнях стенограмм отражают вклад Стенограмма синтеза и распада Стенограмма. Регулируемые и скоординированных Стенограмма кариеса является важным механизмом для контроля биологических процессов1,2,3,4. К примеру Стенограмма распада ставки было показано вносить временные серии событий после активации воспалительных цитокинов фактор некроза опухоли5.

Ранее мы показали, что переход между распространением и покоя в первичной фибробластов связан с изменениями в уровнях Стенограмма многих генов6. Некоторые из этих изменений отражают различия в деятельности факторов транскрипции между этими двумя государствами.

Изменения в скорость распада стенограмма может также способствовать изменениям уровня выражения стенограммы в двух разных государствах7,8. Основываясь на наших предыдущих выводах, что переход между распространением и покоя связан с изменениями в уровнях несколько микроРНК9, мы спросили, есть ли также взнос от дифференциального Стенограмма распада в изменения в Экспрессия генов в пролиферирующих против покоя фибробластов.

Для того чтобы контролировать Стенограмма стабильности, мы определили скорость распада стенограммы генома общесистемной в пролиферирующих против покоя клетки. Для достижения этой цели, мы наблюдение распада ставки в пролиферирующих против покоя фибробластов, представляя ингибитор новой транскрипции и мониторинг частоты, на которой отдельные стенограммы исчез со временем. Преимуществом этого подхода является, что, по сравнению с методами, которые просто контролировать общий экспрессии генов, путем ингибирования синтеза новых стенограммы, мы сможем определить скорость распада для этих стенограмм отдельно от скорость, на которой они должны переписана.

Лечение АСРТ подавляют новой транскрипции и определить показатели распада Стенограмма успешно применялся в нескольких предыдущих исследований. АСРТ был использован для рассекать важность стабильности РНК в изменения в изобилии стенограмма, что результат от лечения с5провоспалительных цитокинов. Аналогичный подход используется также вскрыть различия в Стенограмма скорость распада в пролиферирующих против дифференцированных клеток C2C12, как они принимают дифференцированных мышечных фенотип10. В качестве другого примера глобальные полувыведения mRNA также были обнаружены в плюрипотентных и дифференцированной мыши эмбриональные стволовые клетки11. В этих примерах иметь важное значение для регулирования Стенограмма изобилия и переход клеток различных клеточных государствам было показано разрушение мРНК.

Применение методов, описанных ниже, мы обнаружили изменения темпов Стенограмма распада в приблизительно 500 генов при сравнении фибробластов в пролиферирующих и покоя государств12. В частности мы обнаружили, что цели микроРНК miR-29, который downregulated в неработающем клеток, стабилизируются, когда клетки переход к покоя. Здесь мы описываем методология, которую мы использовали для определения ставок распада в клетках пролиферирующих и покоя. Эта методология является полезным для сравнения глобальные показатели распада мРНК в двух отдельных, но аналогичные условия, когда запрашивается информация о быстро распадаться генов. Он может также использоваться для решения другие такие вопросы, как влияние условий культуры клеток на стенограмму распада, например, в двух измерениях против трех мерного культур. Распад ставки могут быть определены геном широкий с методами например microarrays или РНК-след альтернативно, ПЦР в реальном времени или Северный blotting может использоваться для определения ставок распада на основе гена в геном или изоформы по изоформы. Эти ставки затем может использоваться для вычисления half-life каждого наблюдаемого гена и выявления генов с показателями распада, которые отличаются в двух условий.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты описал были одобрены институциональные наблюдательные советы на Принстонского университета и университета Калифорнии, Лос-Анджелес.

1. Подготовьте пролиферирующих и контакт мешают фибробластов АСРТ время конечно

Примечание: Этот протокол использует timecourse с четырьмя timepoints. Три независимых биологически образцы могут быть собраны за timepoint, собирая различные культуры ткани пластины в одном эксперименте, или эксперимент может повторяться несколько раз с различными культурами клеток. В нашем опыте один 10 см (диаметр) тканевой культуры блюдо (одна пластина) обеспечивает достаточную РНК для анализа. При необходимости, множественные тарелки культуры ткани могут объединяться для каждого образца увеличить количество клеток в каждом timepoint. Кроме того же эксперимент может выполняться с фибробластов, изолированы от разных людей, как подлинно независимым биологического реплицирует.

  1. Создание пролиферирующих и покоя культур клеток для анализа распада транскрипт. Для пролиферирующих клеток разбить ячейки каждые три дня, в то время как контакт тормозится клетки становятся контакт тормозится.
    1. Для контакта тормозится клеток измените носитель каждые 2 дня на 7 дней. Разделение пролиферирующих клеток 2 дней до контакт тормозится фибробластов готовы к коллекции. На рисунке 1показан пример схемы культуры клеток. Оставшиеся шаги в этом разделе предоставляют подробный протокол для установления и разбиение ячеек.
  2. Изолируйте первичного кожного фибробластов от новорожденных кожи в соответствии с установленными протоколами13. Проход фибробластов обеспечить однородное население.
    Примечание: Фибробласты могут быть заморожены и таял, при необходимости.
  3. Оттепель или replate фибробластов, если это необходимо. Растут фибробластов в среде DMEM с 10% сыворотки в стерильных условиях в инкубатор культуры ткани при 37 ° C и 5% CO2. Используйте фибробласты, которые были выросли за менее чем 10 ходов. Фибробласты должно быть < 80% притока в день разбиение ячеек для населения пролиферирующих и покоя.
  4. Чтобы разделить культуры ткани пластины на несколько пластин, prewarm PBS, трипсина и средних с сывороткой в ванну воды 37 ° C 20 мин.
  5. Аспирационная или использовать пипетки для удаления среды из каждой культуры ткани пластины с клетки, чтобы быть replated.
  6. Накапайте теплой PBS на каждой пластине (10 мл раствора для 150 мм, 5 мл раствора для 100 мм пластины, 2 мл для колодца 6 хорошо плиты) и 1 мл раствора для колодец 12 хорошо плиты.
  7. Аспирата или пипетки для удаления PBS из каждой культуры ткани пластины.
  8. Аккуратно накапайте 1 x трипсина-ЭДТА на каждой пластине (8 мл раствора для 150 мм пластины, 3 мл раствора для 100 мм, 2 мл для колодца 6 хорошо плиты и 1 мл раствора для колодец 12 хорошо плиты).
    Примечание: Сделать 1 x трипсина-ЭДТА путем разбавления стерильные 10 x трипсина-ЭДТА в стерильных PBS. Решение окончательное 1 x должно быть 0,05% трипсина и 0,02% ЭДТА.
  9. Инкубируйте трипсина с клетки на 5 мин.
  10. Аккуратно нажмите пластину выбить клетки от пластины.
  11. Накапайте Ресуспензируйте ячеек в одну ячейку подвеска.
  12. Клетки в раствор трипсина перехода к конической трубка, содержащая такой же объем DMEM с 10% сыворотки (8 мл раствора для 150 мм пластины, 3 мл раствора для 100 мм пластины, 2 мл для колодца 6 хорошо плиты и 1 мл раствора для колодец 12 хорошо пластины).
  13. Спин вниз клетки на 4 ° C за 5 минут на 1000 x g для удаления трипсина.
  14. Ресуспензируйте клетки в соответствующий объем среднего и фото с hemacytometer для определения концентрации клеток.
  15. Семена 5 x 105 на 100 мм культуры ткани пластину для пролиферирующих и контакт тормозится ячейки.
  16. С помощью этого метода, устанавливают пролиферирующих и контакт тормозится образцов, необходимых для анализа (рис. 1).

2. АСРТ время курс

  1. Ресуспензируйте АСРТ на складе концентрации 1 мг/мл (в 1 мг АСРТ, 950 мкл использования стерильных PBS и 50 мкл стерильных ДМСО).
    Примечание: Замороженные акций решения АСРТ должно быть стабильным за месяц-20 ° c. Растворы должны быть отброшен и не сохраняются для дальнейшего использования.
  2. Добавить АСРТ соответствующий объем подогретую средний для всех биологических реплицировать клеточной культуры плиты, которые были установлены на 0, 120, 240 и 480 мин timepoints (рис. 2). Добавление АСРТ в концентрации 15 мкг / мл среды. Хорошо перемешайте, аспирационная от старой среды и добавить АСРТ содержащих среднего к клеткам.
    1. На складе 1 мг/мл, 15 мкл АСРТ для каждого мл среды, например, для 10 мл среды для плиты 100 мм, 150 мкл АСРТ.
  3. Для сбора нулевой образец timepoint, нежно аспирационная АСРТ среднего и пипетки подогретую PBS на клетки. Накапайте 10 мл раствора для 150 мм пластины, 5 мл раствора для 100 мм, 2 мл для колодца 6 хорошо плиты и 1 мл раствора для колодец 12 хорошо плиты.
  4. Аккуратно аспирационная или пипетки с PBS.
    Примечание: Все шаги с участием РНК изоляции должны быть выполнены с РНКазы свободной воды, бесплатно РНКазы microcentrifuge трубы и бесплатно РНКазы пипетки. Перчатки следует носить и изменил часто при работе с РНК.
  5. Фенол Гуанидин Изотиоцианаты решение (1 мл/10-см плита с 4 x 105 клеток 4 x 10-7 ) добавьте непосредственно на пластину культуры ткани.
    Примечание: Фенол Гуанидин Изотиоцианаты решение является монофазных решение, которое сохраняет качество РНК лизировать клетки и отделяя РНК, ДНК и белка друг от друга.
    Предупреждение: Фенол и гуанидина Изотиоцианаты коррозии. Используйте соответствующую защиту.
  6. Накапайте фенол Гуанидин Изотиоцианаты решение клеточной смесь вверх и вниз несколько раз, чтобы сделать однородной смеси.
    Примечание: Фенол Гуанидин Изотиоцианаты раствор lysate может храниться при температуре 4 ° C на ночь или при-20 ° C до одного года.
  7. Соберите точки каждый раз после того, как соответствующее количество времени прошло с методом, описанным в шагах 2.3-2.6.

3. изоляция всего РНК от фенола Гуанидин Изотиоцианаты решения Lysate

  1. Проинкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 5 мин для обеспечения полного растворения РНК белковых комплексов.
    Примечание: Шаги протокола раствор фенола Гуанидин Изотиоцианаты может производиться при комнатной температуре если не указано иное.
  2. Ввести стенограммы Спайк в управления, которые могут быть обнаружены с используемой методологии.
Ввести эти элементы управления в каждый образец известно количество и концентрацию.
Примечание: Спайк в управления сочетание внешних РНК управления консорциума (ERCC)14 был специально разработан как элемент Спайк для РНК-Seq. Он также может использоваться для северной части пятна или ПЦР в реальном времени. Спайк в элементы управления, специально предназначенные для технологии microarray являются также доступна (см. Таблицу материалы).
  • Передача смеси раствор фенола Гуанидин Изотиоцианаты пробки microcentrifuge 2.0 мл с пипеткой. Добавить 0,2 мл хлороформа фенол Гуанидин Изотиоцианаты раствор смеси для каждого 1 мл Изотиоцианаты раствора фенола Гуанидин используется (например, добавить 0,3 мл хлороформа 1,5 мл фенол Гуанидин Изотиоцианаты раствор смеси).
  • Встряхнуть пробки microcentrifuge энергично для 15 s и затем инкубировать смесь хлороформ фенол Гуанидин Изотиоцианаты при комнатной температуре в течение 3 мин.
  • Спиновые образцы на 12000 x g 20 минут при 4 ° C.
    Примечание: После первоначального спина, образец следует разделить на 3 слоев - красный органический слой на дно, белый/розовый межфазной в середине и ясно водный слой на верхней части (рис. 3).
  • Передать новые 2.0 мл microcentrifuge трубки с помощью микропипеткой водный слой.
    Примечание: Будьте осторожны, чтобы не нарушить интерфаза во время этого процесса. Это нормально, чтобы оставить некоторые из водной фракции. Это лучше оставить некоторые из водной фракции, чем также включить некоторые из межфазного слоя, как включая интерфаза слой будет загрязнять РНК с ДНК. Водный слой будет примерно половину первоначального объема, так что около 0,9 мл если смесь раствора/хлороформ Изотиоцианаты фенола Гуанидин 1.8 мл.
  • Отбросить межфазной и органические фракции.
  • Добавить равное количество 2-пропанол водная фракция и инвертировать трубки 10 раз. Мкл до 1 20 мг/мл водного раствора гликогена в 20 мкл пример, особенно если доходность, как ожидается, будет низким, потому что меньше 106 клеток были собраны.
    Примечание: Это приведет к плотной, твердые гранулы, это легко контролировать после отжима шаги, которые следуют.
  • Проинкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 10 мин.
  • Спиновые образцы на 12000 x g 20 минут при 4 ° C. Убедитесь, что в конце этого спина, РНК химически осажденный сформировать белые гранулы в нижней части трубки.
  • С пипеткой снимите и выбросьте супернатанта, принимая особого ухода, чтобы не мешать белые гранулы РНК.
    Примечание: Свободные накапайте наконечник, держал в руке может использоваться для удаления избыточных этанола. Если гранулы РНК нарушается, но не отбрасываются, следователь может повторить спин и снова удалить супернатант. Избегайте, отбрасывая гранулы, поскольку это потребует следователь повторить всю процедуру.
  • Приготовляют раствор 75% этанола и 25% воды, свободной от нуклеиназы. Добавьте 1 mL этанола 75% 1 мл реагента раствор фенола Гуанидин Изотиоцианаты чтобы помыть лепешка.
  • Спиновые образцы на 12000 x g 10 мин при 4 ° C.
  • После удаления большую часть супернатанта, используйте пипетки удалить столько этанол как можно скорее, при этом по-прежнему стараясь не нарушить гранулы.
    Примечание: Гранулы РНК менее компактный на этот шаг и стремится двигаться. Будьте осторожны при обработке гранул на данный момент, чтобы избежать потери РНК.
  • Спиновые образцы 12000 x g 2 мин при комнатной температуре в Пелле все излишки этанола.
  • Удалите все избыточные этанола из трубки с помощью микропипеткой, заботясь, чтобы не нарушить гранулы.
  • Пусть воздух гранул РНК высохнуть в течение 5 мин.
  • 50 мкл воды, свободной от нуклеиназы Пелле РНК и Ресуспензируйте Пелле в воде свободной от нуклеиназы.
  • Лечить образцы с 1 мкл DNase (2 единицы/мкл) чтобы удалить ДНК и затем инактивирует DNase и катионов (см. Таблицу материалы).
  • Хранение образцов РНК в трубы microcentrifuge 2.0 мл-80 ° c.

    • 4. анализ Стенограмма изобилия

    1. Количественного определения РНК и проверьте РНК для чистоты, используя спектрофотометр.
      Примечание: Отношение absorbance на 260 Нм до 280 Нм должно быть приблизительно 2.0 для РНК.
    2. Анализировать РНК с эквивалентной технологией для визуализации степень деградации или гель агарозы 1%.
      Примечание: Две четкие группы, представляющие 18S и 28S рРНК должно быть четко видно (рис. 4). Если эти группы не являются видимыми, РНК может снизиться. Проблемы съемки советы для деградации РНК предоставляются в ходе обсуждения.
    3. Монитор Стенограмма изобилия в собранных аликвоты РНК по сравнению с шипами в внутреннего стандарта используя microarrays15, РНК-Seq16, ПЦР в реальном времени17, или Северной помарок18.
      1. Определите изобилие для каждого Стенограмма в каждый момент времени по сравнению с контролем шипами в известных изобилия.
        Примечание: Для microarrays, значения будут интенсивностью флюоресценции. Для северной части пятна полосы на рентгеновской пленки могут быть количественно. Для ПЦР в реальном времени изобилие стенограмма может быть определена по сравнению с известных стандартов с 2- σσCT метод19. Для РНК-Seq нормализованные значения могут быть определены как FPKM или фрагментов на kilobase экзона за миллион читает сопоставлены. Для распада изоформы конкретных ставок РНК-Seq данные могут быть проанализированы с использованием методологии изоформы известно как DEXSeq20. Распад изоформы конкретных ставок лучше всего определяется с РНК-Seq. Если они должны быть определены с microarray данных, данные должны быть проанализированы на основе зонд, зонд, а не на основе гена в геном. Аналитик должны быть осторожны при интерпретации информации от ограниченное количество зондов. Например может быть 5 или меньше зондами, которые являются информативными о конкретной изоформы. В этом случае аналитик будет необходимо определить, является ли поведение этих датчиков достаточно последовательно, так что результаты являются надежными.
    4. Выполняйте ПЦР в реальном времени на изолированные РНК17 в собранных образцов для анализа быстро распадаться генов, как c-Myc и медленно разлагающегося ген как GAPDH, чтобы получить уверенность, что стенограмма распада, что ставки точно были обнаружены.
      Примечание: Для дальнейшего подтверждения, может быть разработана и используется для мониторинга обилие конкретных изоформ течение времени21зонды изоформы конкретного ПЦР в реальном времени.

    5.Распад темпы постоянное определение

    1. Для каждого timepoint журнал преобразование изобилие значения для каждого Стенограмма (ген специфического или изоформы специфические).
      Примечание: Преобразование журнала значения будет преобразовать экспоненциального распада кривых линий, которые могут поместиться с Модель линейного распада22.
    2. Установите профиль выражение для каждого Стенограмма (ген специфического или изоформы специфические) для модели линейной распада. Формула для такой модели является f(t) = C - r * t. В этом уравнении C — константа, представляющая начальную сумму стенограмма, r – ставка упадка и t — время с момента начала эксперимента. Из этого уравнения, определить скорость распада как r*ln(10) (см. ссылку11).
      Примечание: MaSigPro пакет программного обеспечения является подход, основанный на регрессии, предназначенное для обнаружения значительных ген выражение профиль различия в времени курс данных23. Пример кода и результаты для maSigPro доступны на: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/maSigPro/inst/doc/maSigProUsersGuide.pdf.
    3. Фильтр из генов, которые не подходят модели журнала линейная распада. Это может быть достигнуто с ANOVA F-теста.
      Примечание: F тест основан на F-статистики, которая определяется как разница между пример средства, деленное на вариацию образцы. Исправьте p значения для нескольких сравнений, применяя линейные step-up Benjamini и Хёхберг ложных обнаружения процедуры24. Q значение больше, чем 0,05 с F-тест может использоваться в качестве среза для генов, которые не подходят модели журнала линейная распада.
    4. Выполните ANOVA F-тест для определения стенограммы с термином существенного взаимодействия между состоянием категориальной клеточного цикла и времени (ложное обнаружение ставка, Рузвельт < 0,05).

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Результаты

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Мы уже ранее сообщали результаты анализов microarray Стенограмма распада ставок в пролиферирующих и контакт тормозится первичной фибробластов за 8-часовой курс12. В дополнительной таблице 1предоставляется список генов с существенные изменения в стабильности стенограмма, сравнивая пролиферирующих и контакт мешают фибробластов. Интенсивностью флюоресценции в время ноль и течение времени после лечения АСРТ предоставляются. Гены были включены в список,...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Обсуждение

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Покоя может быть вызвана внешних сигналов, включая вывод митогены или сыворотки, отсутствие клеточной адгезии и ингибирование контакт. Ингибирование контакта, один из нескольких возможных методов для стимулирования покоя, является весьма эволюционно сохранены процесс, в котором клетки выход пролиферативной клеточного цикла в ответ на контакт к ячейке. Мы сосредоточимся на ингибирование контакт как пример метода, позволяющего стимулировать покоя. Предыдущие исследования сообщали что ячеек контакт может повлиять на микроРН...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Раскрытие информации

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Авторы имеют не конкурирующие интересы раскрыть.

    Благодарности

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    HAC был Милтон E. Cassel ученый Аллен фонда Рита (http://www.ritaallenfoundation.org). Эта работа финансировалась за счет грантов для HAC от национального института Генеральной медицинских наук центра передового опыта Грант Р50 GM071508 (David п.и. Ботштейн), Фонд PhRMA Грант 2007RSGl9572, национальной науки Фонд Грант OCI-1047879-Дэвид августа, Национальный институт Генеральной медицинских наук R01 GM081686, Национальный институт общих медицинских наук R01 GM0866465, Эли & Edythe широкой центр регенеративной медицины & исследования стволовых клеток, Iris Кантор женщин центр здоровья/UCLA CTSI низ Грант UL1TR000124 и лейкемии лимфомы общества. Исследования в этой публикации было поддержано национального института рака национальных институтов здоровья под награду номер P50CA092131. Спонсоры имел никакой роли в дизайн исследования, сбор данных и анализ, решение опубликовать или подготовка рукописи. ВАК является членом Eli & Edythe Широкое центр восстановительной медицины & исследования стволовых клеток, Институт молекулярной биологии Калифорнийского университета и UCLA биоинформатики межведомственной программы.

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Материалы

    Список материалов, использованных в этой статье
    ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
    Центрифуги для микроцентрифужных пробирок, способные достигать 12 000 x g и 4°Г; C
    Оборудование для запуска агарозных гелей
    Стерильные планшеты для культивирования тканей и конические пробирки
    Модифицированный орел Dulbecco's MediumLife Technologies11965-118
    Фетальная бычья сывороткаVWR35-010-CV
    Стерильные серологические пипетки, пипетки и наконечники пипеток для культуры тканей
    Индивидуально упакованные одноразовые пипетки, не содержащие РНКЗ, наконечники для пипеток и пробирки для выделения и анализа
    Одноразовые перчатки для ношения при работе с реагентами и образцами
    РНК РНКазаZapInvitrogenAM9780Для обеззараживания рабочих поверхностей из
    2,0 мл eppendorf
    Трипсин-ЭДТА  Раствор 10XMillipore Sigma9002-07-07
    стерильный PBSLife Technologies14190-250
    ТризолThermo Fisher Scientific15596018
    Актиномицин DMillipore SigmaA1410-2 мгингибирует транскрипцию
    Стерильный ДМСОFisher Scientific31-761-00MLрастворитель для актиномицина D
    ХлороформThermo Fisher ScientificICN19400225MP Biomedicals, Inc продукт
    ИзопропанолFisher ScientificBP2618500молекулярной биологии класс
    этанолFisher ScientificBP28184молекулярной биологии
    класс РНКазный гликоген (20 мг/мл водный раствор)Thermo Fisher ScientificR0551носитель для осаждения
    РНКТУРБО Набор без ДНКThermo Fisher ScientificAM1907удаляет ДНК с ДНКазой, затем, на последующем этапе, инактивирует ДНК и удаляет двухвалентные катионы
    АгарозаThermo Fisher ScientificICN820721MP Biomedicals, Inc продукт
    Загрузка красителя для РНК геляThermo Fisher ScientificR0641подходит даже для денатурирующего электрофореза
    МаркерыРНК тысячелетияThermo Fisher ScientificAM7150РНК-лестница
    Одноцветный набор РНК Spike-in KitAgilent Technology5188-5282Пример контроля спайка для анализа микрочипов Agient
    Tris baseFisher ScientificBP152-1молекулярная биология класса, для буфера TAE
    Ледяная уксусная кислотаFisher ScientificA38-500для буфера TAE
    EDTAFisher Научныйкласс электрофореза BP120-500, для гелей
    Бромид этидияMillipore SigmaE7637для молекулярной биологии
    Консорциум внешних регуляторов РНК Spike-in MixThermo Fisher Scientific4456740Spike-in control for RNA Seq
    TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 образцов, 12 индексов)IlluminaRS-122-2101для RNA Seq
    96-луночный ПЦР-планшет 0,3 млThermo Fisher ScientificAB-0600для количественной ПЦР в реальном времени
    Microseal B Адгезивные пломбыBio-RadMSB1001для количественной ПЦР в реальном времени
    Резервуары без реагентов Rnase/Dnase VWR89094-662для количественной ПЦР в реальном времени
    без Rnase/Dnase Восемь пробирок и колпачковThermo Fisher ScientificAM12230для количественной ПЦР
    в реальном времениSuperScript Обратная транскриптазаInvitrogen18090010для количественной ПЦР в реальном времени
    AMPure XP БусиныBeckman CoulterA63880для количественной ПЦР в реальном времени
    РНКпробирок РНКазы

    Ссылки

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Neff, A. T., Lee, J. Y., Wilusz, J., Tian, B., Wilusz, C. J. Global analysis reveals multiple pathways for unique regulation of mRNA decay in induced pluripotent stem cells. Genome Res. 22 (8), 1457-1467 (2012).
    2. Raghavan, A., Ogilvie, R. L., Reilly, C., Abelson, M. L., Raghavan, S., Vasdewani, J., Krathwohl, M., Bohjanen, P. R. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30 (24), 5529-5538 (2002).
    3. Cheadle, C., Fan, J., Cho-Chung, Y. S., Werner, T., Ray, J., Do, L., Gorospe, M., Becker, K. G. Control of gene expression during T cell activation: alternate regulation of mRNA transcription and mRNA stability. BMC Genomics. 6, 75(2005).
    4. Yang, E., van Nimwegen, E., Zavolan, M., Rajewsky, N., Schroeder, M., Magnasco, M., Darnell, J. E. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13 (8), 1863-1872 (2003).
    5. Hao, S., Baltimore, D. The stability of mRNA influences the temporal order of the induction of genes encoding inflammatory molecules. Nat Immunol. 10 (3), 281-288 (2009).
    6. Coller, H. A., Sang, L., Roberts, J. M. A new description of cellular quiescence. PLoS Biol. 4 (3), 83(2006).
    7. Wilusz, C. J., Wormington, M., Peltz, S. W. The cap-to-tail guide to mRNA turnover. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (4), 237-246 (2001).
    8. Garneau, N. L., Wilusz, J., Wilusz, C. J. The highways and byways of mRNA decay. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 113-126 (2007).
    9. Suh, E. J., Remillard, M. Y., Legesse-Miller, A., Johnson, E. L., Lemons, J. M., Chapman, T. R., Forman, J. J., Kojima, M., Silberman, E. S., Coller, H. A. A microRNA network regulates proliferative timing and extracellular matrix synthesis during cellular quiescence in fibroblasts. Genome Biol. 13 (12), 121(2012).
    10. Hoen, P. A., Hirsch, M., de Meijer, E. J., de Menezes, R. X., van Ommen, G. J., den Dunnen, J. T. mRNA degradation controls differentiation state-dependent differences in transcript and splice variant abundance. Nucleic Acids Res. 39 (2), 556-566 (2011).
    11. Sharova, L. V., Sharov, A. A., Nedorezov, T., Piao, Y., Shaik, N., Ko, M. S. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16 (1), 45-58 (2009).
    12. Johnson, E. L., Robinson, D. G., Coller, H. A. Widespread changes in mRNA stability contribute to quiescence-specific gene expression patterns in a fibroblast model of quiescence. BMC Genomics. 18 (1), 123(2017).
    13. Legesse-Miller, A., Elemento, O., Pfau, S. J., Forman, J. J., Tavazoie, S., Coller, H. A. let-7 Overexpression leads to an increased fraction of cells in G2/M, direct down-regulation of Cdc34, and stabilization of Wee1 kinase in primary fibroblasts. J Biol Chem. 284 (11), 6605-6609 (2009).
    14. Jiang, L., Schlesinger, F., Davis, C. A., Zhang, Y., Li, R., Salit, M., Gingeras, T. R., Oliver, B. Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments. Genome Res. 21 (9), 1543-1551 (2011).
    15. Tan, P. K., Downey, T. J., Spitznagel, E. L., Xu, P., Fu, D., Dimitrov, D. S., Lempicki, R. A., Raaka, B. M., Cam, M. C. Evaluation of gene expression measurements from commercial microarray platforms. Nucleic Acids Res. 31 (19), 5676-5684 (2003).
    16. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
    17. Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
    18. Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).
    19. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
    20. Anders, S., Reyes, A., Huber, W. Detecting differential usage of exons from RNA-seq data. Genome Res. 22 (10), 2008-2017 (2012).
    21. Vandenbroucke, I. I., Vandesompele, J., Paepe, A. D., Messiaen, L. Quantification of splice variants using real-time PCR. Nucleic Acids Res. 29 (13), 68-68 (2001).
    22. Hargrove, J. L., Hulsey, M. G., Beale, E. G. The kinetics of mammalian gene expression. Bioessays. 13 (12), 667-674 (1991).
    23. Conesa, A., Nueda, M. R package version 1.46.0. maSigPro: Significant Gene Expression Profile Differences in Time Course Gene Expression Data. , Available from: http://bioinfo.cipf.es (2016).
    24. Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B. 57, 289-300 (1995).
    25. Hwang, H. W., Wentzel, E. A., Mendell, J. T. Cell-cell contact globally activates microRNA biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7016-7021 (2009).
    26. Friedel, C. C., Dolken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37 (17), 115(2009).
    27. Soeiro, R., Amos, H. mRNA half-life measured by use of actinomycin D in animal cells - A caution. Biochimica et Biophysica Acta. 129 (2), 406-409 (1966).
    28. Perez-Ortin, J. E., Alepuz, P., Chavez, S., Choder, M. Eukaryotic mRNA decay: methodologies, pathways, and links to other stages of gene expression. J Mol Biol. 425 (20), 3750-3775 (2013).
    29. Chen, C. Y., Ezzeddine, N., Shyu, A. B. Messenger RNA half-life measurements in mammalian cells. Methods Enzymol. 448, 335-357 (2008).
    30. Gupta, I., Clauder-Munster, S., Klaus, B., Jarvelin, A. I., Aiyar, R. S., Benes, V., Wilkening, S., Huber, W., Pelechano, V., Steinmetz, L. M. Alternative polyadenylation diversifies post-transcriptional regulation by selective RNA-protein interactions. Mol Syst Biol. 10, 719(2014).
    31. Geisberg, J. V., Moqtaderi, Z., Fan, X., Ozsolak, F., Struhl, K. Global analysis of mRNA isoform half-lives reveals stabilizing and destabilizing elements in yeast. Cell. 156 (4), 812-824 (2014).
    32. Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Mol Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
    33. Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nat Biotechnol. 23 (2), 232-237 (2005).
    34. Rabani, M., Levin, J. Z., Fan, L., Adiconis, X., Raychowdhury, R., Garber, M., Gnirke, A., Nusbaum, C., Hacohen, N., Friedman, N., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).
    35. Marzi, M. J., Ghini, F., Cerruti, B., de Pretis, S., Bonetti, P., Giacomelli, C., Gorski, M. M., Kress, T., Pelizzola, M., Muller, H., et al. Degradation dynamics of microRNAs revealed by a novel pulse-chase approach. Genome Res. 26 (4), 554-565 (2016).

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Перепечатки и разрешения

    Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

    Запросить разрешение

    Теги

    Decay RatesProliferating FibroblastsQuiescent FibroblastsActinomycin D TreatmentRNA Isolation ProtocolReal Time qPCR AnalysisHuman Dermal FibroblastsGene Expression ChangesRNA Purity CheckPhenol Guanidine Extraction

    Похожие статьи