Методическая статья

Изменение ролик трубки метод для точно локализованы и повторяющиеся прерывистый изображений во время долгосрочного культуры срезы мозга в замкнутой системе

DOI:

10.3791/56436

⸱

28 декабря 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology and Molecular, Cellular and Integrated Neuroscience Program, Colorado State University, 2IBMC-Instituto de Biologia Molecular e Celular, i3S-Instituto de Investigaçãoe Inovação em Saúde, ICBAS, Universidade do Porto, 3Denali Therapeutics

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представлены здесь метод трубки модифицированных ролика для культивирования и прерывистый с высоким разрешением изображений грызунов мозга ломтики в течение многих недель с точное перемещение на photoetched coverslips. Нейрональных жизнеспособность и морфология срез хорошо поддерживаются. Приложения полностью замкнутой системы с использованием вирусов для конкретного выражения типа клеток предоставляются.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Искусственный мозг грызунов фрагменты полезны для изучения поведения клеточном и молекулярном нейронов и глии в среде, которая поддерживает многие из их обычной в естественных условиях взаимодействия. Фрагментов, полученных от различных линий трансгенные мыши или использование вирусных векторов для выражения дневно тегами белки или Репортеры в срезах мозга дикого типа позволяют с высоким разрешением изображений по микроскопии флуоресцирования. Хотя несколько методов были разработаны для визуализации мозга ломтиками, объединяя культуры срез с возможностью выполнения повторяющихся с высоким разрешением изображений конкретных клеток в живых фрагменты течение длительного времени создает проблемы. Это особенно верно, когда вирусных векторов используются для выражения экзогенных белков, так как лучше всего это делается в замкнутой системе для защиты пользователей и предотвращения перекрестного загрязнения. Как сообщается, простые изменения, внесенные метод культуры фрагмента ролика трубки мозга, которые позволяют для повторяющихся с высоким разрешением изображения срезов в течение многих недель в замкнутой системе. Культивирование срезы на photoetched coverslips позволяет использовать величинам точно и быстро переместить на сцену, чтобы идентичные поле изображения со временем до и после различных методов лечения. Для использования этого метода в сочетании с специфического окрашивания нейронов и выражение наблюдать изменения в архитектуре гиппокампа срез, вирусный опосредованной нейрональных выражение флуоресцентных белков и развития Кофилин патологии, приводятся примеры которая ранее наблюдалось в гиппокампе болезни Альцгеймера (AD) в ответ на лечение срез с олигомеров пептида амилоид β (значения).

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Первичной культуре диссоциированных нейронов из регионов грызунов мозга является важным инструментом, используемым исследователями наблюдать ответы на патологически замешан раздражителей. Однако такие исследования имеют недостаток глядя на нейроны в только 2D и без их глиальных системы поддержки. Кроме того если выросли в условиях очень высокой плотности (640 нейронов/мм2 или около 16% от площади поверхности), в которой она становится невозможным следовать случайных нарост дендритов или аксона для более чем на расстоянии короткой прогулки от его клетки тела, гиппокампа нейрональных жизнеспособность более 4 недель значительно снижается1, ограничивая использование диссоциированных культур для расширенного исследования возрастных патологий. Культивирование ломтиками, приготовленный из грызунов мозга является привлекательным вариантом, который преодолевает эти ограничения, поддерживая организованной клеток архитектуры и жизнеспособности для недель или месяцев. Условия для поддержания многих различных регионах грызунов мозга в ломтик культуры были описаны2.

Две основные методы широко используются для долгосрочных культуры срезы мозга: культивирования на мембраны на интерфейс воздуха жидкость3 или культивирования на coverslips в герметичных труб допускается для поворота в инкубаторе ролика предоставлять аэрации4. Ломтики, культивируемых на мембраны может быть непосредственно imaged с высоким разрешением флуоресцентной микроскопии с помощью вертикально микроскоп и воды погружение цели5. Кроме того фрагменты, культивируемых на мембраны были переданы стекла дно блюда для достижения хорошего разрешения с помощью инвертированного микроскопа6дендритных шипиков. Однако оба метода визуализации ломтиками, выращенных на мембраны являются открытые системы, которые требуют среднего изменения и часто используют антибиотики или противогрибковые для предотвращения или уменьшения загрязнения5,6. Ломтики на мембрану в воздушной среде интерфейса поддерживают отличные морфологии и выживания, но возвращение в строго определенные места во время повторяющихся изображений с высоким увеличением является чрезвычайно сложной, если эксперимент следит только небольшие группы клеток выражая флуоресцентных маркеров. Хотя ломтиками, выращенных на мембраны были использованы с вирусный опосредованной выражением трансгенов5,6, протоколы биобезопасности может потребовать систему закрытых культуры использоваться для некоторых вирусных векторов, которые используются для выражая дневно tagged белков и Репортеры физиологии клетки. Кроме того погружение цели требуют очистки между образцами, последовавших в культуре5. Один из основных приложений мембраны интерфейс культур является объединение с высоким разрешением изображения с электрофизиологии на один раз точки7.

Метод трубки ролик с coverslips внутри пластиковой трубки не разрешают любой электрофизиологии или высоким разрешением изображений без удаления coverslip. Таким образом этот метод чаще всего применяется для долгосрочных исследований, в которых после фиксации замечания были сделаны8. Описанные здесь является метод, который использует техника культура трубки ролика, но на пробуренных из трубы с кусочками на coverslips, которые могут быть многократно imaged для покуда культуры сохраняются. Замкнутые системы требует не среднего изменения для обработки изображений и использует photoetched coverslips предоставлять величинам, которые позволяют изображений с высоким увеличением, дней или недель, точные ранее отображаемого поля.

Мы применяем этот метод для изучения изменений в грызунов гиппокампа, основных мозга региона, участвующих в память и обучение. Грызунов гиппокампа часто рассматривается как модель для патологических или возрастные изменения, наблюдаемые в ходе развития когнитивных нарушений9, например те, которые происходят в AD. Наш метод особенно хорошо подходит для изучения патологические изменения, которые развиваются в один срез с течением времени в ответ на экологические изменения, такие как увеличение значения пептиды, который является характеристикой AD8. Один патологии, связанные с AD мозга человека и грызунов является наличие Кофилин актина агрегатов и стержней, последний содержащие пучки нитей в котором Кофилин и актина находятся в молярное соотношение 1:110,11, 12. стержни наблюдались в фиксированных срезах гиппокампа крысы, после Aβ лечения, а также в пределах кусочек живой грызунов мозга выразив Кофилин GFP подвержены гипоксии8, и они могут способствовать синаптических дисфункции, видели в AD и инсульта. Здесь мы используем этот новый метод культивирования соблюдать время курс и распределения в рамках ломтики выраженной экзогенных химерных флуоресцентных белков, представленный различных вирусов. Затем мы используем нейрональных конкретное выражение конструкцию репортер Кофилин следить за развитием Кофилин стержня и совокупных патологии в срезах гиппокампа в ответ на лечение с растворимых значения олигомеров (oAβ).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование животных следует утвержденным селекции и протоколы использования животных, которые соответствуют животное уход и использовать руководящие принципы из университета штата Колорадо.

Примечание: Ниже протокол описывает метод подготовки и культуры для долгосрочной инкубации и прерывистый изображений гиппокампа фрагментов. Один срез гиппокампа прикрепляется к специально подготовленные photoetched coverslip с помощью сгусток плазмы, и затем опечатаны coverslips на плоской стороне трубки пробуренных из ролика, который поддерживается в инкубаторе ролика. Сгустки плазмы растворяются с плазмин до вирусной инфекции для флуоресцентных белков и высоким разрешением изображений. Флуоресцентный нейрональных жизненно краска используется для изображения нейронов в ломтики.

1. Подготовка трубы стойки роликовые

  1. Использовать шаблон, показанный на рисунке 1A напечатаны на размер, показаны на панели шкалы. С гвоздем Пробейте небольшие отверстия (достаточно большой для маркера точки штраф) в шаблоне, сосредоточены на отверстия.
  2. Установить шаблон в нижней части ткани культуры блюдо 15 см (номинальный диаметр 14 см) и отметьте положение отверстий. Повторите эту процедуру на второе блюдо.
  3. С сверла предназначены для использования на пластик просверлите шесть отверстий диаметром 1,5 см на каждое блюдо в массив гексагональной (4,8 см-для центр) с центрами отверстия 2,5 см от края блюдо. Просверлите три (3 мм в диаметре) 12 мм от края, поместивший расстоянии между двумя из больших отверстий, как показано на рисунке 1A.
  4. С днища каждое блюдо лицом друг к другу, место 2,5 дюймовый длинный крепежный винт (диаметр 3/16 дюйма) с шайбу через один из маленьких отверстий, последовал второй шайбу, кусок полиэтилена трубы (распорка, 4,7 см), другой плоская шайба , второе блюдо культуры ткани, другой плоская шайба, стопорной шайбой и гайкой.
  5. Повторите шаг 1.4 на два крепежных винтов и ужесточение лишь условно, до тех пор, пока все машины винты находятся в месте. Затем надежно затяните гайки.
  6. Работа прокладки (5/16 дюйма толщиной, диаметр отверстия 5/8 дюйма) в отверстия нижней блюдо для получения окончательного ролик трубки стойки (Рисунок 1B; показано две трубы в месте). Поместите наклейку на каждой стойке с уникальным номером.

2. Подготовка прямошовных труб и Coverslips

  1. Создание джиг для отверстий в прямошовных труб
    1. Просверлите отверстие 1,5 см глубиной 8 см в сторону центра 2 x 4 x 5,5 дюйма деревянный блок под углом такие плоская сторона вала трубки будет быть почти параллельно с блока при вставке (рисA).
    2. Увеличить отверстие с помощью круглой древесины файла как расширить, так и конусность отверстия, чтобы позволить трубки вставки (прямошовных труб немного больше в диаметре в конце колпачок) (рис. 2B).
    3. Просверлить вертикальное отверстие диаметром 1,5 см, 5,5 см со стороны блока и по центру над отверстие сбоку (рис. 2C).
    4. Когда отверстие сбоку конические достаточно, вставьте ролик трубка, которая помечена на желаемом месте, в центре отверстие для фрагмента и Расположите трубку отмеченные места центрируется в вертикальное отверстие 1,5 см.
    5. Снять трубку и измерить расстояние от места до конца трубки. Марк это расстояние от центра отверстия в джиг и вставьте гвоздь предоставлять остановить, чтобы правильно расположить трубы для бурения (стрелка на рис. 2C).
    6. Используйте ножовку с обрезают вровень с поверхностью древесины блока для предотвращения травмы ногтей.
    7. Добавьте весной клипы на дно джиг, если есть что сверлильный с разъемами, которые позволяют ему быть якорь (Рисунок 2D черная стрелка). В противном случае используйте струбцины провести джиг надежно на буровых печати.
  2. С помощью Джига описанные выше держать и Расположите трубку пластиковые культуры плоские двухсторонние 11 см с плоской стороной вверх(рис. 2), просверлить отверстие диаметром 6 мм с центром 1,0 см от дна и по центру между сторонами трубки.
    Примечание: Следует использовать сверло для пластика.
  3. С поворота для снятия заусенцев инструментом, сгладить края отверстия (рис. 2E) и сделать 4 пазами на внутренней стороне края отверстия (рис. 2E, вставкой) для облегчения слива отверстия во время вращения.
  4. С отверстием 12 мм удар, отрезные диски диаметром 12 мм из нетоксичных двойной Двусторонняя клей кремния резиновые листы. Используя стандартный одной бумаги Дырокол (диаметром 6 мм), сделайте отверстие в центре каждого диска.
  5. Промойте просверленные трубки с 70% этиловом спирте, воздух сухой их в шкаф, биологической безопасности и стерилизации труб и кулаками клей диски для 40 мин под УФ-лампа (30 Вт в среднем расстоянии 70 см) в биологической безопасности кабинета.
  6. Переместите трубы и дисков после 20 мин, чтобы все поверхности подвергаются стерилизации. В стерильных условиях шелушиться белый, бэк от клей диск и прикреплять силиконовой резины к наружной трубки, совместив отверстия (рис. 2F).
    Предупреждение: Чтобы избежать воздействия УФ, носить для защиты глаз и закрыть кабинет перед включением в УФ-лампе.
  7. Очистите 12 мм диаметр photoetched (100 квадратов центр пронумерованы 1 мм) немецкий стекла coverslips. Аккуратно возьмите coverslips пинцетом и окунуться в абсолютного этанола, следуют водой, следуют абсолютного этанола снова и наконец падение coverslips в пламя, чтобы сжечь этанола. Разрешить coverslips остыть.
  8. Проведение coverslips пинцетом, окунуться в 2% 3-aminopropyltriethoxysilane в ацетон для 10 s. промыть coverslips с ультрачистая вода и дайте высохнуть на воздухе.
  9. Установите coverslips на стерильную фильтр-бумаги внутри биологической безопасности кабинета и включите УФ света. Предоставления каждой стороне coverslips на 20 мин.
    Предупреждение: Чтобы избежать воздействия УФ, носить для защиты глаз и закрыть кабинет перед включением в УФ-лампе.

3. гиппокампа ломтик подготовка

  1. Перед началом рассечение, подготовьте половинки обоюдоострый лезвия для измельчителя ткани. Сложите лопасти вдоль тщательно с пальцами и оснастки в два раза.
  2. Промойте лезвие половинки с ацетоном, используя ватный тампон для их, следуют промывка в абсолютного этанола очистки и осушки воздуха.
Перед монтажом половину лезвия на ткани измельчитель, стерилизуйте его путем полоскания с 70% этиловом спирте.
  • Следуйте протоколы, одобрены институциональные животное уход и использование Комитета; После изофлюрановая анестезии усыпить 4-7 день старые мыши или крысы щенка, обезглавливание и снимите головку с ножницами или гильотины.
    Примечание: Протокол культуры срез мозга независима от мыши или крысы штамм или генотипа. Были использованы многие трансгенные мыши линии с генетическими различиями.
  • Промыть голову с 70% этиловом спирте и поместите его в 60 мм Петри. До окончательного монтажа срез мозга в трубу ролика, все следующие шаги выполняются в Ламинарный шкаф для поддержания стерильности.
  • Использование #21 хирургическое лезвие, сделайте Сагиттальный разрез через кожу и черепа. Пинцетом Дюмон #5 пил обратно кожи и черепа, чтобы разоблачить мозга.
  • С закрытыми щипцами нежно дразнить из весь мозг, освободив его путем сжимать с щипцами через ствол мозга позади мозжечка. Место мозга в стерильных 60 мм блюдо, содержащих 4 ° C Gey сбалансированный соли Solution/0.5% глюкозы (GBSS/глюкозы).
  • С помощью микроскопа диссекции для визуализации мозга (рис. 3А), место мозг дорсальной стороне вверх и отрезать передней трети мозга и мозжечке с хирургического лезвия (рис. 3B).
    1. Пинцетом прижмите подстриженные мозга задней стороной вверх и вентральной стороне стороне Петри для стабильности. Аккуратно дразнить прочь мозговых оболочек вокруг сагиттальной срединной и удаление ткани мозга с помощью тонкой наконечником щипцы Дюмон #5 (рис. 3C, пунктирной окружности).
    2. Сделайте два надреза вдоль стороны мозга для распространения его открытым (рис. 3C, пунктирные линии). После установки мозг дорсальной стороне вниз и спреда открытое, гиппокампа трещины должны быть видны (рис. 3D, стрелка).
    3. Передать кусок пластиковой пленки полихлортрифторэтилена открытых мозг спред и расположите его для нарезки на сцене измельчитель ткани. Мокрый лезвие с GBSS/глюкозы и нарезать ломтиками толщиной ~ 300 мкм гиппокампа.
    4. С передача пипетки флеш нарезанный мозга от пластиковой пленки в блюдо свежих 60 мм, содержащие GBSS/глюкозы (рис. 3E). Аккуратно щепотка покинуть и дразнить, с тонкой наконечником щипцы, оставшиеся мозговых оболочек и других не гиппокампа ткани (рис. 3F) от срезы (рис. 3G, H).

    • 4. обшивка ломтиками

    1. После того, как были получены фрагменты, место 2 мкл плазмы курица на центре photoetched стороны готовы coverslip. Распространение плазмы слегка добиться пятно диаметром 3-4 мм.
      Примечание: Photoetched сторона является верхней стороне coverslip при просмотре через микроскоп рассечение, таким образом, чтобы правильно ориентированы чисел.
    2. Передача 1 ломтик мозга с стерильных УЗК наконечник шпателем (рис. 4A) плазмы место (рис. 4B). Используйте закрытый щипцы сохранить фрагмент на кончик шпатель во время подъема фрагмент из глюкозы GBSS.
    3. Touch шпатель для плазмы, пятно на coverslip и с закрытыми щипцами, вставьте фрагмент на coverslip.
    4. Mix 2.5 мкл плазмы с 2,5 мкл тромбина в отдельном трубку. Быстро место 2,5 мкл этой смеси над и вокруг фрагмента и пипетки вверх и вниз осторожно смешать его (рис. 4B).
      Примечание: Плазма будет сгустка в течение 10-15 сек, так что это должно быть сделано быстро. Если срез адгезии является проблемой, смешать 5 мкл плазмы с 5 мкл тромбина и использовать 4-5 мкл на срез, удаление некоторых после смешивания так что срез лежит плашмя на coverslip.
    5. Удаление прозрачного пластика, охватывающих со стороны подвергаются силиконовый резиновый клей, ранее прикреплены к трубке ролик и место coverslip с срез мозга на клей, совместив срез в отверстие (рис. 4C).
    6. Для обеспечения адгезии, давление мягкий, даже для coverslip пальцем, нажав coverslip равномерно и удерживая его для около 1 мин передачи его в биологической безопасности кабинета.
    7. В биологической безопасности кабинета добавьте 0,8 мл полного Neurobasal A питательной среды (Таблица материалов) к каждой трубе (рис. 4D).
    8. Поток 5% CO2/95% воздушной смеси через стерильную хлопок подключен Пастер пипеткой надежно удерживается на струбцине. Флеш ролик трубка с газовой смеси и быстро крышка трубки, как он снимается с вокруг пипеткой.
    9. Этикетке трубки с номер слайса и рейки номер. Вставьте трубки в роликовых стойки, гарантируя они геометрически сбалансированы. Если есть нечетное количество трубок, добавьте трубы для баланса.
    10. Место стойки в инкубаторе ролик 35 ° C с роликами, поворачивая стойки роликовые на о 10-13 RPH (Рисунок 4E). Чтобы средство в нижней части трубы, наклон инкубатора обратно примерно 5° путем повышения его фронта на доске.
    11. Введите номер фрагмента и трубка на электронную таблицу, которая используется для записи всей информации ломтик процедуры и сроки наблюдения.
    12. На приблизительно 6 день в культуре, добавить 1 мкл (0,002 U) активных плазмин каждой трубы.
    13. После растворения сгустков (обычно в течение нескольких часов), удалите среды и замените свежей среды без плазмин. При необходимости, ломтики можно инкубировали с плазмина на ночь и среднего изменено на следующий день.
    14. Ломтики инкубируют обычно по крайней мере 7-10 дней перед использованием в экспериментах. Аспирационная среднего и заменить его на день 3 или 4, снова на 7 день и раз в 7 дней.

    5. Подготовка вирусных векторов выражения трансген

    Примечание: Выражение трансгенов в нейронах ломтик культур достигается либо с помощью мозги от генетически грызунов или представляя трансген инфекции с рекомбинантным репликации вирусов и несовершенным.Аденовирусов (AV), аденоассоциированный вирусов (ААВ) и векторов рекомбинантных человека были использованы в наших культурах гиппокампа срез для выражения различных флуоресцентный белок химер в срезах головного мозга.

    1. Подготовка репликации, несовершенным AV для выражения РНК интерес согласно методов описанных в других13,14. Титр вирусов для инфекционных ед/мл методом последовательного разрежения с использованием антитела вирусно выраженной белка как описано14. Соблюдать Кофилин агрегатов и формирования стержень Кофилин актина, используют cDNA Кофилин R21Q-mRFP (плазмида #51279)16.
      Примечание: Синапсин 1 промоутер является отличным выбором для нейронов конкретное выражение15, тогда как промоутер цитомегаловирус полезен для вождения уровни высокой выражения в много типов клетки13.
    2. Подготовьте AAV, Сопредседатель трансфекции передачи плазмида, содержащие ген интереса и рэп/cap плазмида, с или без вспомогательной плазмида, в HEK293 упаковка клетки, которые поставляют вирусный E1 генов, как было описано выше17,18.
      Примечание: Рекомбинантных AAV можно также для целевых вставки в геном клетки принимающей19. Для передачи плазмида мы используем человека Кофилин 1 тегом C-терминала mRFP1 флуоресценции белков (плазмида #50856) клонирован в Синапсин промоутер содержащих AAV плазмиду вниз по течению от датчика GCaMP5G кальция20. Кусок ДНК кодирования P2A последовательность самостоятельно расщепления пептидов вставляется методом ПЦР между GCaMP5G и Кофилин ППП в ходе подготовки передачи плазмида предоставлять выражение обоих белков из одного AAV Стенограмма21.
    3. Подготовить рекомбинантных человека векторов, Сопредседатель трансфекции плазмида передачи, содержащие ген или cDNA сигналов интерес и интеграции, наряду с человека третьего поколения, упаковка смесь, которая делит вирусный кляп, ГСМ, rev и гены vsv-g на три отдельных плазмид22,23.
    4. Для передачи плазмида чтобы собрать Синапсин промоутер и cDNA Кофилин R21Q-mRFP (от плазмида #51279) в pLKO.1-GFP (плазмида #30323), с Синапсин промоутер и Кофилин R21Q-mRFP, заменив hPGK используйте один шаг клонирования системы24 промоутер и GFP cDNA, соответственно.
    5. Transfect окончательный плазмида в HEK293T клетки, фосфат кальция как описано23.
    6. Собирать среднего из четырех блюд 10 см, сосредоточиться на 500 мкл, используя 150K-среза Центробежные концентраторы и храните окончательный человека-80 ° c в небольших аликвоты после быстрое замораживание в жидком азоте. Оттепель аликвота только один раз для заражения клеток.
    7. Определите эмпирически, объем каждого типа вируса готовы достичь степени выражения желаемого путем создания ряда культур различных фрагментов следовать выражение трансгенов после инфекции с различными объемами вируса.
      Примечание: Как правило, 1-10 мкл вируса используется на срез.

    6. фрагмент лечения

    1. Заражение ломтики с вирусом
      1. Работая в биологической безопасности кабинет одобрил для работы вирус на уровне биологической безопасности для вектора, смешайте с 0,8 мл полной среды Алиготе вируса (обычно 1-10 мкл).
      2. Аспирационная среднего из фрагмента, используя стерильные пипетки Пастера в ловушку коллекции, содержащие отбеливатель. Вторичные ловушка всегда используется между Первая ловушка и источник вакуума.
      3. Замените этот носитель вируса содержащих Алиготе, подготовленный выше, возвращение культуры трубы к стойке и место в инкубаторе.
      4. После 2-5 дней инкубации срезов с вирусом в биологической безопасности кабинета удалить вирус содержащих среды с стерильных передачи пипетки и поместите его в бутылку, содержащий утвержденные противовирусное средство убить вирус.
    2. Пятнать нейронов жизненно краской
      1. Готовить и хранить аликвоты Люминесцентную краску нейрональных жизненно25 быстрого замораживания 4 мкл аликвоты в жидком азоте в концентрации 100 мкм и хранить эти при-20 ° C. Не замораживания/оттаивания краситель более одного раза.
      2. Для обозначения нейронов для визуализации по микроскопии флуоресцирования, размораживать один Алиготе нейрональных жизненно красителя и разбавляют до 4 мл в полной Neurobasal среднего (окончательный краситель концентрация составляет 100 Нм).
      3. Удалите носитель из кусочков аспирации (или с передачи пипетки, если среда содержит вирус) и заменить его с 0,8 мл среды, содержащие 100 Нм нейрональных жизненно красителя. Возвращение фрагментов в ролик аппарат в инкубаторе.
      4. После инкубации срезов для 2 h, аспирационная краситель содержащих среднего и заменить его с 0,8 мл свежего полной среды в биологической безопасности кабинета.
        Примечание: Маркировки нейронов в ломтики с жизненно краска требует нескольких часов инкубации. Первые изображения обычно принимаются 24 часа после лечения красителя. Хотя специально помечены нейронов, есть фон флуоресценции, который отказывается дать лучше нейрональных изображений более чем 2-3 дней. Интенсивность жизненно краски падает после 72 ч.
      5. Чтобы следовать изменения в морфологии фрагмент со временем, переименовали ломтики каждые 7 дней.

    7. фрагмент изображения

    1. Просмотр фрагментов на инвертированным микроскопом. Для ярких изображений флуоресценции, на 24 ч до изображений, Обмен питательной среды с полной Neurobasal A средних без фенола Красного pH индикатор.
      Примечание: Для экспериментов, сообщили здесь, фрагменты рассматриваются на Перевернутый спиннинг диск конфокальный флуоресценции микроскоп с линейной кодировке x, y сцену с пьезо z управления и чувствительной цифровой камеры с высоким разрешением.
    2. Передать трубку с ломтик культуры к записи образа из ролика трубку аппарата для держателя на заказ трубки (рис. 5A), который находится в стадии адаптер (рис. 5B), чтобы сохранить coverslip перпендикулярно Цель и сохранить фрагмент в ту же ориентацию во время повторяющихся изображений сессий более длинные интервалы.
    3. Нажмите бегунок на стадии адаптер плотно против трубки держать трубку в положении (рис. 5B).
    Сохранить фрагмент температуре 35 ° C во время визуализации использованием нагрева полосы и терморегуляторных контроллер, встроенный в адаптер на заказ стадии (рис. 5C).
    Примечание: Детали держателя трубки, этап адаптер, и нагреватель можно получить по адресу: https://vpr.colostate.edu/min/custom-machining/roller-tube-holder/.
  • Использование низкой мощности (например., 4 X) цель и яркие области просвечивания, сосредоточиться на photoetched сетка (рисA) под срез. Для первоначальной визуализации сессии, быстро сканировать вокруг срез найти и записать номер для различных регионов, где желательно выше увеличения изображений (например, корню ammonis (CA) 1, CA3, зубчатой извилине (ГД) и т.д.).
  • Переместите стадии первого квадрата сетки, содержащий региона интерес. Перейдите на 20 X воздушные цели и найдите фидуциальный Марк (например., кончик травлению номер) (Рисунок 6B).
  • Перейти к более высокой цели мощности (40 X или 60 X), локализовать фидуциальный Марк и затем запись x и y позиции этапа. Перейти на сцену, чтобы найти поля интерес неподалеку и записывать их x и y смещения от фидуциальный Марк (Рисунок 6B, стрелка). При необходимости повторите в других областях сетки.
    Примечание: Эти позиции-набор из координатных Марк позволяют последовательно выявлением в том же месте coverslip когда imaged срез, даже несмотря на то, что оригинальный x, y параметра фидуциальный марки изменения когда адаптер трубки или стадии удаляются и вместо.
  • Захват изображения Z-стека в каждое выбранное поле с помощью микроскопа объективного контроля или элемента управления стадии пьезо, если таковые имеются.
    Примечание: Обычно плоскостей изображения получаются с интервалом 0,5 мкм до 2 мкм, в зависимости от размер и разрешение изображения функций. Строительство качество 3D изображение требует, чтобы функции изображения продлить на несколько плоскостей приобретения, и так визуализировать меньше функций, небольшие интервалы между плоскостями.
  • Держите общей визуализации времени для каждого среза как можно более коротким.
    Примечание: Большинство тепловизионных сессий сообщили здесь под 18 мин/срез. Однако, мы imaged некоторые фрагменты десять или более раз и даже как долго как 40 мин в одной сессии, без явного вреда в долгосрочное выживание фрагмента.

    • Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Результаты

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Чтобы определить, насколько точно могут быть использованы отсчета к reimage же клеток в тех же областях с течением времени, мы рассмотрели ломтиками, выращенных на photoetched coverslips(рис. 6). Нейроны были визуализированы пятнать с краской жизненно (100 Нм 2 h; не пятно не нейрональные клетки), которое исчезает из нейронов со временем не повреждая клетки25. Мы определили фидуциальный Марк в одной сетки (

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Обсуждение

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Ролик трубки метод, описанный здесь позволяет для долгосрочного культивирования и высоким разрешением живой изображений нарезанный мозговой ткани. Одной из основных проблем с техникой фрагмент как применяется здесь находится в монтаж и обслуживание ломтиками. Coverslip покрытия, которые поддерживают ломтик адгезии, содействовать ломтик истончение путем усиления нарост невритов и миграцию клеток из фрагмента; Таким образом мы избегали использования этих субстратов. Вставки аминогруппами на стекло, лечение с 3-aminopropylt...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Материалы

    Список материалов, использованных в этой статье
    ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
    Дно из посуды для культуры 15 смVWR Scientific25384-326
    Винты с крестообразной головкой (#10-32)Ace Hardware2,5" длиной и 3/16" в диаметре
    Плоские шайбы #10ACE Hardware
    Machine Винтовые гайки (#10-32)ACE Hardware
    резиновые втулки Фурнитура ACE 5/16 дюйма, толщина; диаметр отверстия 5/8 дюйма; 1,125 дюйма, наружный диаметр
    полиэтиленовой трубки (5/16 дюйма; OD, 3/16"; ID)ACE HardwareCut to 1.8"
    Стопорная шайба # 10ACE Hardware
    Сверлильный станок, 5 скоростей  Ace HardwareProTech Model 1201
    Nunclon Delta Плоские трубкиVWR62407-076
    Сверла, 3 мм, 6 мм и 15 мм Ace HardwareDiablo freud марки Сверладля резки пластика.
    Сверла по дереву, 1,5 см и 1 ммAce Hardware
    Деревянный напильник, круглыеAce Harware
    1/4", держатель защелки 16 ммИнструмент для
    , 5-дюймовыйAce Hardware26307
    (надежное уплотнение)Grace Bio-Labs666581толщиной 0,5 мм
    Дырокол 6 ммOffice Max
    12 мм дыроколthepunchbunch.com
    70% этанол
    Phototeched Coverslips, диаметр 12 ммBellco Glass, Inc.1916-91012
    Горелка
    Абсолютный этанол Наночистая
    вода
    3-аминопропилтриэтоксиланСигма-ОлдричA3648
    АцетонСигма-Олдрич179124
    #5 Пинцет ДюмонТонкие научные инструменты11251-30
    Измельчитель тканей McIlwainTed Pella, Inc.10180
    Лезвия для бритвы с двумя лезвиямиTed Pella, Inc.121-6
    Ватман Фильтровальная бумагаVWR28450-182Нарезать на круги диаметром 5,8 см
    полихлор-трифтор-этилен (Aclar)Ted Pella, Inc.10501-10Разрезать на круги диаметром 5,8 см
    #21 Хирургическое лезвиеVWR Scientific25860-144
    #5 Щипцы DumontFine Science Tools11251-30
    Шпатель, нержавеющий с коническим концомVWR82027-518
    Сбалансированный солевой раствор ГеяSigma-AldrichG9779 
      ГлюкозаThermoFisher Scientific15023-02125% (мас.) Раствор, 0,2 мм фильтр стерилизованный
    курицейPlasma Cocalico Biologicals30-0300-5 лРегидратировать в стерильной воде, центрифугировать при 2500 x g 30 мин при 4 ° В, быстро заморозить аликвоты в жидком азоте и хранить на складе; -80 °С.
    Тромбин, Топический (бычий)PfizerThrombin-JMIБыстро замораживают аликвоты в жидком азоте при концентрации 1 000 международных единиц/мл в разбавителе и хранят при температуре -80°С. Используйте при концентрации 250 единиц/мл.
    Клеточная роликовая системаBellco BiotechSciERA
    Роликовый инкубаторForma Модель3956
    N21-MAXThermoFisher ScientificAR008
    Pen/Strepping (100X)ThermoFisher Scientific15140122
    200 мМ ГлутаминThermoFisher Scientific25030081
    глюкозаThermoFisher Scientific15023-02125% (w/v) раствор, 0,2 мм фильтр стерилизованный
    Neurobasal AThermoFisher Scientific10888-022 Полная среда: 48 мл нейробазала А, 1 мл N21-MAX, 0,625 мл 200 мМ глутамина, 0,180 мл 25% глюкозы, 0,250 мл 100x шприц/стрептококк.
    Лентивирусная упаковка третьего поколенияLife TechnologiesK4975-00
    Отсечные фильтры 159 K (Centricon)лентивирусов EMD Millipore
    (InFusion)Clonetech
    Plasmids 30323, 50856, 51279Addgene
    Краситель для жизнеспособности нейрональных клеток (NeuO)Технологии стволовых клеток1801Разморозьте один раз и быстро заморозьте в 4 & микро; L aliquots. Хранить при -20 °deg; C
    Инвертированный микроскопOlympusIX83
    Объективы микроскопаOlympusвоздух: 4X, 20; масло: 40X, 60X,
    Конфокальная система с вращающимся дискомYokagawaCSU22
    Микроскоп EMCCD камераФотометрияCascade II
    Линейное кодирование (x,y), пьезо и столик с плоским верхом ASI
    Микроскоп лазеры и интеграцияIntelligent Imaging Innovations
    HEK293T клеткамиAmerican Type Culture CollectionCRL-3216
    Human PlasminSigma AldrichP18670,002 Ед/мл в 0,1% бычьей сыворотки альбумина (0,2 мм фильтр стерилизован), быстро замораживают в жидком азоте и хранят при -80 °C.
    пружинные зажимы снятия заусенцев с поворотной головкой Ace Hardware силиконовый лист БунзенаСистема клонирования

    Ссылки

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evage, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
    2. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
    3. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
    4. Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
    5. Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Long-term imaging of neuronal circuits in organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1 (3), 1223-1226 (2006).
    6. Roo, M. D., Ribic, A. Analyzing structural plasticity of dendritic spines in organotypic slice culture. Methods Mol Biol. 1538, 277-289 (2017).
    7. Lee, K. F. H., Soares, C., Thivierge, J. -P., Béīque, J. -C. Correlated synaptic inputs drive dendritic calcium amplification and cooperative plasticity during clustered synapse development. Neuron. 89 (4), 784-799 (2016).
    8. Davis, R. C., Maloney, M. T., Minamide, L. S., Flynn, K. C., Stonebraker, M. A., Bamburg, J. R. Mapping cofilin-actin rods in stressed hippocampal slices and the role of cdc42 in amyloid-beta-induced rods. J Alzheimers Dis. 18 (1), 35-50 (2009).
    9. Clark, R. E., Squire, L. R. Similarity in form and function of the hippocampus in rodents, monkeys, and humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, Suppl 2 10365-10370 (2013).
    10. Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biol. 2 (9), 628-636 (2000).
    11. Rahman, T., et al. Cofilin rods and aggregates concur with tau pathology and the development of Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 42 (4), 1443-1460 (2014).
    12. Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease. Cytoskeleton(Hoboken). 73 (9), 477-497 (2016).
    13. He, T. C., Zhou, S., da Costa, L. T., Yu, J., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (5), 2509-2514 (1998).
    14. Minamide, L. S., et al. Production and use of replication-deficient adenovirus for transgene expression in neurons. Methods Cell Biol. 71, 387-416 (2003).
    15. Kügler, S., Kilic, E., Bähr, M. Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area. Gene Ther. 10 (4), 337-347 (2003).
    16. Mi, J., et al. A genetically encoded reporter for real-time imaging of cofilin-actin rods in living neurons. PLOS ONE. 8 (12), 83609(2013).
    17. Wang, L., Blouin, V., Brument, N., Bello-Roufal, M., Francois, A. Production and purification of recombinant adeno-associated vectors. Methods Mol Biol. 807, 361-404 (2011).
    18. Matsushita, T., et al. Adeno-associated virus vectors can be efficiently produced without helper virus. Gene Therapy. 5 (7), 938-945 (1998).
    19. Ward, P., Walsh, C. E. Targeted integration of rAAV vector into the AAVS1 region. Virology. 433 (2), 356-366 (2012).
    20. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
    21. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLOS ONE. 6 (4), 18556(2011).
    22. Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. Lentivirus production and purification. Methods Mol Biol. 1382, 107-114 (2016).
    23. Huang, L., Chen, C. Autoprocessing of human immunodeficiency virus type 1 protease miniprecursor fusions in mammalian cells. AIDS Res Ther. 7, 27(2010).
    24. Bordat, A., Houvenaghel, M. C., German-Retana, S. Gibson assembly: an easy way to clone polyviral full-length infectious cDNA clones expressing an ectopic VPg. Virol J. 12, 89(2015).
    25. Er, J. C., et al. NeuO: a fluorescent chemical probe for live neuron labeling. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (8), 2242-2246 (2015).
    26. Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. Am J Physiol Cell Physiol. 291 (5), 828-839 (2006).
    27. Cichon, J., et al. Cofilin aggregation blocks intracellular trafficking and induces synaptic loss in hippocampal neurons. J Biol Chem. 287 (6), 3929-3939 (2012).
    28. Stine, W. B. Jr, Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem. 278 (13), 11612-11622 (2003).
    29. Maloney, M. T., Minamide, L. S., Kinley, A. W., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Beta-secretase-cleaved amyloid precursor protein accumulates at actin inclusions induced in neurons by stress or amyloid beta: a feedforward mechanisms for Alzheimer's disease. J Neurosci. 25 (49), 11313-11321 (2005).
    30. Davis, R. C., et al. Amyloid beta dimers/trimers potently induce cofilin-actin rods that are inhibited by maintaining cofilin phosphorylation. Mol Neurodegener. 6, 10(2011).
    31. Walsh, K. P., et al. Amyloid-β and proinflammatory cytokines utilize a prion protein-dependent pathway to activate NADPH oxidase and induce cofilin-actin rods in hippocampal neurons. PLOS ONE. 9 (4), 95995(2014).
    32. Woo, J. A., et al. RanBP9 at the intersection between cofilin and Aβ pathologies: rescue of neurodegenerative changes by RanBP9 reduction. Cell Death Disease. , 6(2015).
    33. Shaw, A. E., Bamburg, J. R. Peptide regulation of cofilin activity in the CNS: a novel therapeutic approach for treatment of multiple neurological disorders. Pharmacol Ther. 175, 17-27 (2017).

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Перепечатки и разрешения

    Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

    Запросить разрешение

    Теги

    Brain Slice CultureRoller Tube MethodPhotoetched CoverslipsFluorescence ImagingViral Vector ExpressionNeuronal Vital DyeConfocal MicroscopyHippocampal SlicesLong term CultureEnclosed System

    Похожие статьи