Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Целом гора очистки и окраски Arabidopsis цветок органов и Siliques

17.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56441

⸱

12 апреля 2018 г.

 ,  ,  , 
1Department of Plant and Microbial Biology, Zurich-Basel Plant Science Center, University of Zurich

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе мы описывают методы для надлежащего вскрытия Arabidopsis цветов и siliques, некоторые методы расчистки основных и выбрали пятнать процедуры для наблюдений в целом гора репродуктивных структур.

Аннотация

Благодаря своей грозной инструменты для молекулярно-генетические исследования Arabidopsis thaliana является одним из наиболее известных видов модели в биологии растений и, особенно, репродуктивной биологии растений. Однако завод морфологических, анатомические и ультраструктурные анализ традиционно включает длительным встраивание и секционирование процедуры светлые области, сканирование и электронной микроскопии. Недавний прогресс в конфокальных флуоресцентной микроскопии, 3-D-искусство автоматизированного микроскопические анализы и непрерывное совершенствование молекулярных методов для использования на минимально обработанных образцов состава Гора, привело к увеличению спроса на Разработка эффективных и минимальный пример методов обработки. В этом протоколе мы описываем методы для правильно рассечения Arabidopsis цветы и siliques, основной очистки методы, и некоторые окрашивание процедур для всего гора наблюдений репродуктивных структур.

Введение

Цветы одним из наиболее важных определение органов покрытосеменных растений. Цветковых растений появились около 90-130 миллионов лет назад1и диверсифицированной так быстро, что их быстрое появление был описан как «ужасные тайны» Чарльза Дарвина2. Разнообразны интересы завода исследователей в цветок развития. Некоторые исследования были направлены на понимание эволюционного происхождения цветок в целом, или эволюция определенных анатомических, структурных и функциональных свойств цветы3,4,5,6 . Высокая вариация в цветочные формы и структуры, а также виды сексуального и бесполого размножения, опираясь на них, сделать цветок очень сложную структуру. Это привело к разнообразные усилия для характеризуют анатомии и структурные особенности цветочные органов, используя свет и электрон микроскопические методы, которые можно было бы объединить с генетические и молекулярные исследования7. Кроме того, как источник плоды и семена Цветки имеют первостепенное значение для человека и животных питания. Таким образом характеристика развития цветка и плода имеет множество последствий для прикладных исследований, в том числе продовольственной безопасности растущего населения и сохранения экологических стратегий в рамках меняющейся окружающей среды8 , 9 , 10.

Цветок развития в проростках Arabidopsis начинается с цветок индукции и преобразование вегетативного Меристемы на Меристемы соцветия (группа цветов). Цветок Примордия инициируются боково на фланге соцветия Меристемы11. Примордия цветочные орган постепенно формируют концентрические мутовках от снаружи к центру цветка и в конечном итоге превратиться в7чашелистики, лепестки, тычинки и плодолистиков. Эти цветочные органов выполнять собственный питательная, защитных и функциональных (например, привлечение опылителей) ролей в различных видов растений, с половыми органами, устойчивого развития мужских и женских gametophytes, соответственно12 , 13. gametophytes, в свою очередь, каждый дифференцировать пару мужчин (спермы) и женские гаметы (яйца и центральная ячейка), которые объединяют по двойной оплодотворения в форме следующего поколения, зиготы и основной эндосперма, поддержка терминалов ткани развитие эмбриона14,15. Плоды и семена развития поддержки роста, созревания и сохранение эмбриона и, в конечном счете, ее разгон. Обширные исследования была выполнена характеризовать цветок и развития эмбриона в видов различных растений, особенно в модели вида Arabidopsis7,16,17.

Ранние микроскопические анализы цветок развития были основаны на времени пример обработки и наблюдения, что методы, такие как парафин или встраивание смолы и секционирование, в сочетании с легкими или электронной микроскопии. Эти традиционные микроскопические методы были часто используется в сочетании с молекулярные генетические исследования, такие как микроскопические анализы мутантов, локализация РНК путем в situ гибридизация или иммуно обнаружение белков. Недавний прогресс в-поля и конфокальный флуоресцентной микроскопии, в состояние искусства трехмерного компьютерного изображения анализы и непрерывное совершенствование молекулярных методов, которые могут быть использованы на минимально обработанных образцов состава Гора, привело к необходимости методы обработки образца эффективной и минимальным, которые поддаются преференциально количественного анализа. В последние годы был достигнут значительный прогресс в развитии методов очистки на целом гора животных образца. Они транспарентности образца либо с помощью водного раствора мочевины - или на основе сахара реагенты (например, масштаб, SeeDB, КУБИЧЕСКИЙ)18,19,20, или выборочно удалить липидов (с использованием моющего средства SDS) после Встраивание образцов в стабильных гидрогели; удаление липидов может быть достигнуто либо путем пассивной диффузии (например, изменение ЯСНОСТИ протокол21, Пакт-ПАРС-колеса22) или активно электрофорезом (оригинал ЯСНОСТИ протокол23 и акт-вуаля24). Воодушевленные этой быстрый прогресс, некоторые производные методы появляются также для использования в растениях.

В этом документе методы сосредоточены на модели Arabidopsisмы описываем порядок надлежащего вскрытия бутонов, цветов, и молодые siliques и очистки всего гора образцов для разнообразной окраски и процедуры наблюдения с помощью Классическая или недавно метод очистки на базе ИКБ. Даны примеры крахмал, callose и окрашивание хроматина. Хотя эти процедуры может понадобиться дальнейшего улучшения и адаптации при использовании с другими видами, мы надеемся, что они будут почву для дальнейших исследований на этих простых, но важных методов, которые являются отправной точкой многих научно-исследовательских проектов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. цветок и стручок фиксации

  1. На открытии первого цветка синхронизации урожай цветы и siliques из растений.
    Примечание: В экспериментальных условиях использовали здесь, растения начинают цветение около 21 дней после пересадки от плиты фотосинтетическую и Скуг (МС) в почву. Семена, стратифицированная по 3 – 4 дня при температуре 4 ° C и проросшие/выращенных на MS пластинки в свет 16 h/22 ° C и 18 ° C/8 h темный для 8-10 дней, до высадки рассаду на богатые питательными веществами почвы в горшках, хранится на тех же условиях (рис. 1). Количество реплицирует зависит от цели конкретных исследований, но минимум 5 соцветия (от 5 отдельных растений) для каждого лечения рекомендуется. Если цветы экспериментальное подразделение, рекомендуется минимум 10 цветов на репликацию.
  2. Срезанные соцветия или цветы (Рисунок 1E-H), используя маленькие ножницы (например, ножницы для ногтей) и поместите их непосредственно в пробки microcentrifuge (для фиксации соцветия/цветок) или конической трубки (для коллективного записей) содержащие свежезаваренным сделал Карнуа 's, метанол/уксусной кислоты или FPA50 фиксаторы (в зависимости от приложения, см. ниже) на льду.
    Примечание: Образцы необходимо полностью погружать в фиксатором.
  3. Оставьте ткань внутри фиксатором для 4 h на ночь при 4 ° C.
    Примечание: Инфильтрации вакуум может быть использован для ускорения проникновения фиксатором в ткани, но это может быть пагубным для сохранения структуры ткани. Авторы не реализуют вакуумные инфильтрации.
  4. Снимите фиксатор, добавить достаточно 70% этанола для покрытия образцы и вернуть их до 4 ° C в течение 24 часов; образцы могут бесконечно оставаться в этом решении. После удаления этанола, немедленно приступить к следующему шагу; рассечение или SDS очистки.

2. диссекция под стереомикроскопом

  1. Положите свежеприготовленные 70% этанола в часы чайник стекла, помещаемых на небольшой Петри для поддержки.
  2. Соцветие/цветок/стручок на этом свежезаваренным сделал фиксатором и вскрыть под стереомикроскопом, с помощью щипцов и шприц с иглой.
    1. Используйте часы maker стекла или подобное устройство, которое позволяет образцов быть полностью покрыты с этанолом (рекомендуется) для рассечения соцветия и разрывает цветочные органов Зрелые цветы (чашелистики, лепестки и тычинки могут быть расчленены на данном этапе ) чтобы избежать риска высыхания образцов.
  3. Вскрыть siliques и небольшие бутоны на слайде, как описано ниже.
    1. Отложил часы чайник стекла с предварительно обработанные образцы и использовать обычный слайд для окончательного вскрытия.
    2. Переместите образец интерес к слайду и 10 мкл свежие на 70% спирте. Быстро работать на окончательный диссекции и 10 мкл этанола, при необходимости сохранить образец влажные без чрезмерной жидкости.
    3. Для выпуска зерна пыльцы из тычинок, смотрите шаг 5.1. Для рассечения плодолистиков и яйцеклеток, выполните процедуру, описанную на рисунке 2. Эта процедура применима ко всем этапам развития пестика, в том числе на стадии разработки зеленый siliques.
      Примечание: Не добавлять этанола, если есть достаточно этанола перенос перемещение образцов; Пройдя через очень небольшие образцы намного проще в минимальное количество жидкости. Всегда держите только органы интерес (чашелистики, лепестки, тычинки, плодолистиков, яйцеклеток, семян или зерна пыльцы) на слайде. Эта процедура позволит обеспечить равномерную толщину между слайд и coverslip, соответствующий толщине органа под экспертизы, что приводит к более высокой однородности и таким образом эффективности микроскопических экзаменов (большее число целевых образцов в одной фокальной плоскости).
  4. Поглощать и удалить столько этанол как можно используйте небольшой кусок промокательной бумаги. Быстро переходите к следующему шагу (раздел 3, 4 или 6) перед образца сушит вне.

3. на основе хлораль гидрата клиринга и комбинированных информационно окрашивание

Примечание: Наилучшие результаты для очистки на основе хлораль гидрата получаются с фиксированной материала FPA50.

  1. Место 20 мкл очистки раствора (хлораль гидрата/глицерина, изменение Хойер средний, Herr в 4½ или Герр ИКИ-4½ решения) на слайде образца подшипника. С помощью пары шприцев с гиподермального иглы, поместите образцы, сокращения пространства между ними и листать те где орган интерес сталкивается вниз. Удалите любые оставшиеся пузырьков воздуха с помощью иглы.
  2. Нижняя coverslip боком и осторожно поместите его, нажав очень осторожно и подождать до тех пор, пока решение очистки заполняет пространство между ними. Добавьте решение минимальная очистка, если необходимо, чтобы заполнить все пространство под coverslip.
  3. Поместите слайд слайд держатель и оставить его под зонт. Перейти к микроскопические наблюдения после по крайней мере 4 ч и в течение следующих 4-5 дней.

4. Сводные Александр окрашивание и Герр в 4½ очистки пыльники

Примечание: Оригинальный Александр протокол основан на выпуск зерна пыльцы на слайде до окрашивания. Эффективной и более информативным, изменение Александр, окрашивание и очистки процедура является окрашивание зрелого зерна пыльцы в зрелый, но не вскрывающийся пыльники.

  1. Выберите свежеубранных бутоны, которые вы собираетесь открыть с не вскрывающийся пыльники.
    Примечание: Не принимать маленьких бутонов, потому что Александр пятнать предназначен для зрелого зерна пыльцы и эффективно не испачкать Незрелые зерна пыльцы. Рекомендуется минимум 5 цветов за лечение, собирают из различных растений и соцветия.
  2. Подготовьте 96-луночных плита с достаточно Александр решение погрузиться бутон цветка. Подвергать пыльники, удалив чашелистиков и лепестков и погрузить их в растворе Александра. Храните образцы под зонт для 1-3 ч.
  3. Замените Герр в 4½ решения Александра решение и место несколькими хорошо пластины обратно под зонт для ночи инкубации.
  4. С помощью щипцов, осторожно перемещайте очищается бутоны на новый слайд. Поскольку могут возникнуть некоторые вынос Александра решения, используйте промокательную бумагу для удаления столько очистки решения как можно скорее.
  5. Вскрыть тычинок и удалите все другие ткани. Следуйте инструкциям в разделе 3, с помощью Герр в 4½ решения.

5. Удаление Экзина из пыльцы

Примечание: Мы рекомендуем использовать Карнуа с фиксатором для окрашивания DAPI.

  1. Выполните фиксацию и рассечение процедуры, описанные в разделах 1 и 2. В настоящее время необходимо иметь один для много тычинок на слайде в течение минимум на 70% спирте.
  2. Для удаления избыточных этанола использовать промокательной бумаги и 5 – 10 мкл раствора DAPI. Используя пару шприцы с иглами, выпуск зерна пыльцы в пределах этого небольшое количество раствора (например, использовать один шприц для иммобилизации тычинки и других, чтобы освободить зерна пыльцы). Если раствор высыхает, добавьте еще 5 мкл DAPI.
  3. Удаление всех мусора тычинка является важным шагом, таким образом, что только пыльца зерна остаются между слайд и coverslip.
  4. Место coverslip на слайде образца подшипник, опустив ее в сторону и добавить минимальное количество DAPI решения, необходимые для заполнения пространства. Поместите указательный палец на coverslip, и без давя слишком много сделать быстро, фирмы и короткие скользящие движения.
    Примечание: Чтобы оценить необходимую силу и амплитуда скользящие движения, этот шаг следует практиковать несколько раз, проверка результатов каждый раз под микроскопом.
  5. При необходимости добавьте DAPI решение и место слайда в коробке влажный в темноте при температуре 4 ° C 15 мин до 1 ч. Продолжайте наблюдать за образцы под-поля флуоресценции или confocal микроскопии в течение 24 ч. попытаться объединить эту процедуру с SDS, очистка проверить ли дальнейшие улучшения ments могут быть получены.

6. лаурилсульфат натрия (SDS) очистка

Примечание: В зависимости от цветочные орган для анализа и исследователь навыки, чтобы вскрыть очень мягкий и малых образцов, SDS лечение может осуществляться либо перед (для опытных исследователей) или после вскрытия шаг (для менее опытных исследователи) на метанол уксусной кислоты фиксированной материала.

  1. Используйте часы чайник стекла, вогнутой слайд или пробки microcentrifuge для инкубации расчлененных или нерассеченный образцов в 1% SDS и 0,2 N NaOH решения на ночь при комнатной температуре.
  2. Обращаться с осторожностью, потому что образец очень мягкий и прозрачный вид. Несколько раз промыть водой.
    Примечание: Остатки раствора ИКБ может привести к осадков при добавлении окрашивание раствора, например, анилиновый голубой.
  3. Для образцов, нерассеченный следуйте рассечение процедуры, описанной в разделе 2, использование воды вместо 70% этиловом спирте. После рассечения желаемого ткани, удалить любые остатки и мусора и любой избыток воды с промокательной бумаги, а затем 20 – 40 мкл окрашивание раствора и переходите к шагу 6.5.
  4. Для образцов, расчлененный тщательно, переместить выборки из моющего раствора и поместите его на чистый слайд и 20 – 40 мкл окрашивание раствора.
  5. Осторожно поместите coverslip на слайде, опустив ее в сторону. Будьте осторожны, не Сквош подготовки. Если ткань является слишком мягким, место любого тонкого разделителя в слайд и coverslip по углам (например, ленты или сломанные coverslip), оставляя пространство камеры как между слайдов и coverslip, таким образом, что coverslip не раздавить образца.
  6. Поместите все слайды в поле влажный, накрыть алюминиевой фольгой и поместите его на 4 ° C для по крайней мере 1 ч. Продолжайте наблюдать за образец, используя widefield флуоресценции или confocal микроскопии в течение 24 ч.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Арабидопсис принадлежит к семейству Brassicacea, принимая соцветия цветками бисексуалов, организовал в цветет (рис. 1). Каждый цветок имеет четыре чашелистика, четырьмя лепестками, шесть тычинок (четыре длинный и два коротких) и синкарпная гинецея, состоящий из двух врожденно плавленого плодолистиков (Рисунок 1F-H) расположены в четырех концентрических мутовках25,

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Существование многих бутоны в пределах одного соцветия Arabidopsis, охватывающей все этапы развития цветок, предлагает уникальную возможность для исследований, направленных на характеристике эффект лечения или функцию развития одновременно через различные этапы развития цветка. Хорошей отправной точкой между различными отдельных растений является открытие первый цветок основных соцветий. Растения обрабатываются таким образом, что цветение синхронизированы как возможно (например, 3 – 4 дня, расслоение на...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана университета Цюриха, МЭФ Мари Кюри Грант (Грант нет. TransEpigen-254797 года хиджры), расширенный грант Европейского исследовательского совета (Грант нет. Medea-250358 уг) и исследования и разработки технологий проект (Грант MecanX уг) от SystemsX.ch, швейцарская инициатива по биологии систем.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>реагенты и материалы
этанолШарлауET00102500
уксусной кислотойАпплименемA3686,2500100% Молекулярная биология Ледяная
уксусная кислотаСигма-Олдрич320099Молекулярная биология
МетанолШарлауME03062500
Раствор формальдегидаSigma-AldrichF1635
Пропионовая кислотаSigma-Aldrich81910-250 мл
Гидрат хлоралаSigma-Aldrich15307
ГлицеринRoth3783.1
ГуммиарабикFluka51198
Молочная кислотаFluka69773
ФенолSigma-Aldrich77607-250MLМы использовали жидкий фенол (используйте плотность, чтобы найти необходимый объем для вашего раствора)
Гвоздичное маслоSigma-AldrichC8392-100ML
XyleneRoth4436.1
ЙодFluka57665
Йодид калияMerck5043
Малахитовый зеленыйFluka63160
Фуксиновая кислотаFluka84600
Оранжевый GSigma7252
Додецилсульфат натрияSigma-AldrichL3771Молекулярная биология Класс
гидроксида натрияSigma-Aldrich71690
Дигидрофосфатнатрия ApplichemA1047,1000
Двухосновной фосфат натрияSigma-AldrichS9763-1KG
Фосфат калияSigma-Aldrich04347
EDTAApplichemA2937,1000
CalcofluorSigmaF6259Флуоресцентный отбеливатель 28
АураминChroma10120
DAPISigmaD9542токсичный
Triton-X-100SigmaT8787
Анилиновый синийMerck1275
MS среднийКаролина19-57030
Богатый питательными веществами субстратEinheitserdeED73
СтеклоБез определенной марки
Сокол центрифуга пробирки 15 млVWR62406-200
Dumond ЩипцыActimed0208-5SPSF-PS
ЩипцыDUMONT BIOLOGY0108-5
ШприцBDBD Plastipak 3000131 мл
Игла для подготовкиBDBD Microlance 304000
Предметные стекла для микроскопаThermo Scientific10143562CEобрезка
кромок Покровные стеклаThermo ScientificDV40008
Влажный ящикПластиковый ящик с влажным бумажным полотенцем и скользящими опорами внутри
НазваниеCompanyНомер в каталоге>Комментарии
Solutions<
>Fixatives
Carnoy's (Farmer's)Абсолютный этанол: ледяная уксусная кислота, 3:1 (мл:мл)Фиксатор
метанол/уксусная кислота50 % (v/v) метанол, 10 % (v/v) ледяная уксусная кислота в деионизированной воде
фиксаторФормалин, пропионовая кислота, 50% этанол; 5:5:90 (мл:мл:мл)
<сильно>Очищающие растворы
Хлорал гидрат/глицеринХлорал гидрат : глицерин : вода, 8:1:2 (г:мл:мл). Может использоваться на всех стадиях развития цветка и для силиконного развития с помощью DIC-микроскопии. Лучшим фиксатором является формалин на основе FPA50
Modified HoyerGum arabic 7,5 г, хлорал гидрат 100 г, глицерин 5 мл, вода 30 мл. Может использоваться на всех стадиях развития цветка и для силиконного развития с помощью DIC-микроскопии. Лучшим фиксатором является формалиновая основа FPA50
Herr's 4½ очищающая жидкостьмолочная кислота, хлоралгидрат, кристаллы фенола, гвоздичное масло, ксилол; 2:2:2:1, по весу. Может использоваться на всех стадиях развития цветка (особенно для развития тычинок) и для силиконного развития с помощью DIC-микроскопии. Лучшим фиксатором является раствор
SDS/NaOHРазбавьте SDS и стоковый раствор NaOH до 1% SDS / 0,2 N NaOH (10-кратное разведение). Для всех стадий развития цветка и силика. Лучшим фиксатором является фиксатор метано/уксусной кислоты; Также можно использовать два других фиксатора. Можно комбинировать с калькофтором, аурамином, DAPI и раствором для окрашивания анилинового синего.
Исходный раствор10 % (w/v) додецилсульфата натрия. Растворите 10 г додецилсульфата натрия в 80 мл деионизированной воды и сделайте до 100 мл с деионизированной водой.
Стоковый раствор2 Н раствор NaOH: 4 г NaOH растворить в 40 мл деионизированной воды и сделать до 100 мл с деионизированной водой
<сильно>Комбинированные очищающие и окрашивающие растворы
Herr's IKI-4½К стандартному 4½ (всего 9 г) Добавить: 100 мг йода, 500 мг йодида калия. Это очищающее решение может быть использовано для всех стадий развития цветка и для силикового развития, как для повышения контрастности, так и для характеристики динамики крахмала. Используйте FPA50 для структурного анализа и фиксатор Карноя для количественного анализа крахмала.
Окрашивание Александразеленый (1% в 95% EtOH) 1 мл, фуксиновая кислота (1% в ddH2O) 5 мл, апельсин G (1% в ddH2O) 0,5 мл, фенол 5 г, хлорал гидрат 5 г, ледяная уксусная кислота 2 мл, глицерин 25 мл . Это очищение/окрашивание отдельно или в сочетании с Herr's 4½ Раствор может быть использован для оценки аборта пыльцы у цветков со зрелыми и трехклеточными пыльцевыми зернами. Он используется на свежезаточенном незакрепленном материале.
<сильно>Окрашивающие растворы
Раствор калькофтора0,007% в воде (г:мл). Первоначально использовался в качестве оптического осветлителя. Может использоваться для окрашивания целлюлозы, карбоксилированных полисахаридов и каллозы в клеточных стенках. Часто используется для окрашивания внутренней части пыльцевого зерна. С этим раствором можно использовать все три фиксатора.
Раствораурамина Аурамин 0,01% в воде (г:мл). Этот липофильный флуоресцентный краситель можно использовать для окрашивания кутикулы, кутина и экзина. С этим раствором можно использовать все три фиксатора
Калькофтор-аураминовая смесьРаствор аурамина: Раствор Калькофтор, 3:1. Может использоваться для комбинированного окрашивания обоими растворами. Другие пропорции могут быть проанализированы с сохранением меньшей доли калькофтора по отношению к аурамину.
DAPI растворDAPI 0,4 мкг/мл, 0,1 М натрия фосфатный буфер (pH 7), 0,1% Triton-X-100, 1 мМ ЭДТА. Этот раствор можно использовать для окрашивания хромосомных разбросов во время мужского и женского мейоза, а также ядра клеток любых тканей. Часто используется для изучения развития пыльцевых зерен. Карной и метанол/уксусная кислота являются лучшими фиксаторами для этого решения. Фиксаторы на основе формальдегида, такие как FPA50, могут препятствовать окрашиванию. Возбуждение в ультрафиолетовом диапазоне и максимальное излучение около 461 нм.
Натрий-фосфатный буфер (0,1 М)Протонный рецептор: 0,2 М Na2HPO4, донор протона: 0,2 М NaH2PO4, соотношение протонный донор / протонный рецептор: 1,364 ( для pH 7)
Анилиновый синий раствор0,1% (w/v) анилиновый синий, 108 мМ K3PO4 (pH 11), 2% глицерин. Этот раствор можно использовать для окрашивания каллозы и целлюлозы на многих стадиях развития (например, отложение каллозы в мужских и женских терадах, каллозные пробки в пыльцевых пробирках). Возбуждение в ультрафиоле и максимальное излучение около 455. Он также может возбуждаться на длине волны 514 нм с излучением в красном цвете для окрашивания содержимого клеток.
для часовщика strongФиксатор FPA50 FPA50 на основе формалина SDS NaOH Этанол 95% 10 мл, малахитовый

Ссылки

  1. Crane, P. R., Friis, E. M., Pedersen, K. R. The origin and early diversification of angiosperms. Nature. 374 (6517), 27-33 (1995).
  2. Friedman, W. E. The meaning of Darwin's 'abominable mystery'. Am J Bot. 96 (1), 5-21 (2009).
  3. Sun, G., Dilcher, D. L., Zheng, S., Zhou, Z. In search of the first flower: A Jurassic angiosperm, Archaefructus, from Northeast China. Science. 282 (5394), 1692-1695 (1998).
  4. Mulcahy, D. L. The rise of the angiosperms: a genecological factor. Science. 206 (4414), 20-23 (1979).
  5. Friedman, W. E., Moore, R. C., Purugganan, M. D. The evolution of plant development. Am J Bot. 91 (10), 1726-1741 (2004).
  6. Endress, P. K. Angiosperm floral evolution: morphological developmental framework. Advances in botanical research Volume 44: Developmental genetics of the flower. Soltis, D., Soltis, P., Leebens-Mack, J. , Academic Press. 1-61 (2006).
  7. Alvarez-Buylla, E. R., et al. Flower development. Arabidopsis Book. 8, 30127(2010).
  8. Beddington, J. Food security: contributions from science to a new and greener revolution. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 365 (1537), 61-71 (2010).
  9. Godfray, H. C., et al. Food security: The challenge of feeding 9 billion people. Science. 327 (5967), 812-818 (2010).
  10. Burkle, L. A., Alarcón, R. The future of plant-pollinator diversity: understanding interaction networks across time, space, and global change. Am J Bot. 98 (3), 528-538 (2011).
  11. Meyerowitz, E. M., et al. A genetic and molecular model for flower development in Arabidopsis thaliana. Dev Suppl. 1, 157-167 (1991).
  12. Hafidh, S., Fíla, J., Honys, D. Male gametophyte development and function in angiosperms: a general concept. Plant Reprod. 29 (1-2), 31-51 (2016).
  13. Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Plant germline formation: common concepts and developmental flexibility in sexual and asexual reproduction. Development. 142 (2), 229-241 (2015).
  14. Sprunck, S., Dresselhaus, T. Three cell fusions during double fertilization. Cell. 161 (4), 708-709 (2015).
  15. Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. Fertilization mechanisms in flowering plants. Curr Biol. 26 (3), R125-R139 (2016).
  16. Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).
  17. Roeder, A. H., Yanofsky, M. F. Fruit development in Arabidopsis. Arabidopsis Book. 4, e0075(2006).
  18. Hama, H., et al. Scale, a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  19. Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB. a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  20. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  21. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  22. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  23. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
  24. Lee, E., et al. ACT-PRESTO: rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Sci Rep. 6, 18631(2016).
  25. Endress, P. K. Evolution and floral diversity: the phylogenetic surroundings of Arabidopsis and Antirrhinum. Int J Plant Sci. 153 (3, Part 2), S106-S122 (1992).
  26. Reyes-Olalde, J. I., Zuñiga-Mayo, V. M., Chávez Montes, R. A., Marsch-Martínez, N., de Folter, S. Inside the gynoecium: at the carpel margin. Trends Plant Sci. 18 (11), 644-655 (2013).
  27. Hill, J. P., Lord, E. M. Floral development in Arabidopsis thaliana: a comparison of the wild type and the homeotic pistillata mutant. Can J Bot. 67 (10), 2922-2936 (1989).
  28. Sessions, R. A., Zambryski, P. C. Arabidopsis gynoecium structure in the wild type and in ettin mutants. Development. 121 (5), 1519-1532 (1995).
  29. Schneitz, K., Hülskamp, M., Pruitt, R. E. Wild-type ovule development in Arabidopsis thaliana: a light microscope study of cleared whole-mount tissue. Plant J. 7 (5), 731-749 (1995).
  30. Sundberg, E., Ferrándiz, C. Gynoecium patterning in Arabidopsis: a basic plan behind a complex structure. Annual Plant Reviews Volume 38: Fruit Development and Seed Dispersal. Østergaard, L. , Wiley-Blackwell. Oxford, UK. 35-69 (2009).
  31. Meinke, D. W. 10 seed development in Arabidopsis thaliana. Cold Spring Harbor Monograph Archive. 27, 253-295 (1994).
  32. Weigel, D., Glazebrook, J. Arabidopsis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbour Laboratory Press. Cold Spring Harbour, N.Y. (2002).
  33. Herr, J. M. A new clearing-squash technique for the study of ovule development in angiosperms. Am J Bot. 58 (8), 785-790 (1971).
  34. Alexander, M. P. A versatile stain for pollen fungi, yeast and bacteria. Stain Technol. 55 (1), 13-18 (1980).
  35. Herr, J. M. Jr Applications of a new clearing technique for the investigation of vascular plant morphology. J Elisha Mitchell Sci Soc Chapel Hill N C. 88 (3), 137-143 (1972).
  36. Herr, J. M. Clearing techniques for the study of vascular plant tissues in whole structures and thick sections. Tested studies for laboratory teaching. Proceedings of the Fifth Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE). Goldman, C. A., Hauta, P. L., O'Donnell, M. A., Andrews, S. E., van der Heiden, R. 5, Toronto, Ontario, Canada. 63-84 (1993).
  37. Colcombet, J., Boisson-Dernier, A., Ros-Palau, R., Vera, C. E., Schroeder, J. I. Arabidopsis somatic embryogenesis receptor kinases1 and 2 are essential for tapetum development and microspore maturation. Plant Cell. 17 (12), 3350-3361 (2005).
  38. Heslop-Harrison, J., Heslop-Harrison, Y., Shivanna, K. R. The evaluation of pollen quality and a further appraisal of the fluorochromatic (FCR) test procedure. Theor Appl Genet. 67 (4), 367-379 (1984).
  39. Stone, J. L., Thomson, J. D., Dent-Acosta, S. J. Assessment of pollen viability in handpollination experiments: A review. Amer J Bot. 82 (9), 1186-1197 (1995).
  40. Dafni, A., Firmage, D. Pollen viability and longevity: practical, ecological and evolutionary implications. Plant Syst Evol. 222 (1-4), 113-132 (2000).
  41. Lora, J., Testillano, P. S., Risueño, M. C., Hormaza, J. I., Herrero, M. Pollen development in Annona cherimola Mill. (Annonaceae). Implications for the evolution of aggregated pollen. BMC Plant Biol. 9, 129(2009).
  42. Ross, K. J., Fransz, P., Jones, G. H. A light microscopic atlas of meiosis in Arabidopsis thaliana. Chromosome Res. 4 (7), 507-516 (1996).
  43. Park, S. K., Howden, R., Twell, D. The Arabidopsis thaliana gametophytic mutation gemini pollen1 disrupts microspore polarity, division asymmetry and pollen cell fate. Development. 125 (19), 3789-3799 (1998).
  44. Haseloff, J. Old botanical techniques for new microscopes. BioTechniques. 34 (6), 1174-1182 (2003).
  45. Truernit, E., et al. High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis. Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).
  46. Hedhly, A., et al. Starch turnover and metabolism during flower and early embryo development. Plant Physiol. 172 (4), 2388-2402 (2016).
  47. Crane, C. F., Carman, J. G. Mechanisms of apomixis in Elymus rectisetus from eastern Australia and New Zealand. Am J Bot. 74 (4), 477-496 (1987).
  48. Young, B. A., Sherwood, R. T., Bashaw, E. C. Cleared-pistil and thick-sectioning techniques for detecting aposporous apomixis in grasses. Can J Bot. 57 (15), 1668-1672 (1979).
  49. Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: a rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142, 4168-4179 (2015).
  50. Warner, C. A., et al. An optical clearing technique for plant tissues allowing deep imaging and compatible with Fluorescence Microscopy. Plant Phys. 166, 1684-1687 (2014).
  51. Hasegawa, J., Sakamoto, Y., Nakagami, S., Aida, M., Sawa, S., Matsunaga, S. Three-dimensional imaging of plant organs using a simple and rapid transparency technique. Plant Cell Physiol. 57 (3), 462-472 (2016).
  52. Musielak, T. J., Slane, D., Liebig, C., Bayer, M. A Versatile Optical Clearing Protocol for Deep Tissue Imaging of Fluorescent Proteins in Arabidopsis thaliana. PLoS ONE. 11 (8), e0161107(2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Препарирование цветка Arabidopsisконфокальная микроскопияокрашивание хлоралгидратомраствор Александрараствор ХерраSDS-гидроксид натрияокрашивание DAPIанализ органов цветкаисследование пыльцевых зерен
Целом гора очистки и окраски Arabidopsis цветок органов и Siliques
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.