Методическая статья

Простой подход к побудить Экспериментальный аутоиммунный неврит мышей C57BL/6 для оценки функциональных и патологического

9.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56455

⸱

9 ноября 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Neuroscience, School of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, The University of Melbourne

В этой статье

Краткое содержание

В настоящем докладе излагается простой подход к успешно побудить экспериментальной аутоиммунных неврит (EAN) с использованием миелиновый белок ноль (P0)180-199 пептида в сочетании с полного адъюванта Фройнд и коклюша токсин. Мы представляем современные парадигмы способны точно оценить степень функциональной дефицита и невропатологии, которые происходят в этом EAN.

Аннотация

Экспериментальный аутоиммунный неврит (EAN) представляет собой хорошо оценили экспериментальный модель аутоиммунных периферийных демиелинизирующих заболеваний. МАКПТ болезни индуцируется иммунизация мышей с нейрогенной пептиды направлять нападение воспалительных сторону компонентов периферической нервной системы (ПНС). Последние достижения позволили индукции EAN в строке мыши относительно устойчивые C57BL/6, используя миелиновый белок ноль (P0)106-125 или P0180-199 пептиды доставлены в адъювант в сочетании с инъекции токсина коклюша. Способность вызывать EAN в штамм C57BL/6 позволяет для использования многочисленных генетических инструментов, которые существуют на этом фоне мыши и таким образом позволяет сложные исследования патогенеза заболевания и допроса механистический действий Роман терапии в комбинация с трансгенных подходов. В этом исследовании мы демонстрируем простой подход к успешно побудить EAN, используя P0180-199 пептида в мышей C57BL/6. Мы также наметить протокол для оценки функциональных дефициты, которые происходят в этой модели, в сопровождении массив патологического функций. Таким образом эта модель является мощным Экспериментальная модель для изучения патогенеза человека периферийных демиелинизирующих нейропатии и определить эффективность потенциальных терапий, которые направлены на содействие миелина ремонта и защиты от повреждения нерва в аутоиммунных неврит.

Введение

Периферические нейропатии может быть генетическое происхождение или приобретенные, с приобретенных невропатий, имеющих либо метаболических, ишемическая, воспалительных, или токсических выделений. Эти заболевания целесообразно также классифицируются как аксональное или demyelinative происхождение. Наиболее распространенных приобретенных демиелинизирующих периферической нейропатии, острые воспалительные демиелинизирующих полиневропатии (МАУП, также известный как синдром Гийена-Барре, GBS) и хронические воспалительные полиневропатии демиелинизирующих (ХВДП)1, 2 , 3 , 4; патогенетически оба характеризуются аутоиммунные реакции, направленной против Миелиновые оболочки, вызывая демиелинизации периферических нервов. При этих заболеваниях активированные Т-клетки пересечь барьер крови нерва и генерировать иммунной реакции в рамках ПНС. Активация макрофагов в нерв затем вызывает демиелинизации либо непосредственно через фагоцитарной атаки, или косвенно через секретируемые медиаторы воспаления, что приводит к клинической инвалидов как паралич и сенсорные дисфункции5. В то время как demyelinated аксоны сохраняют способность быть remyelinated после демиелинизации, remyelination часто задерживается или неполными, что приводит восприимчивости голый аксоны необратимый ущерб, который является основной причиной постоянного клинического инвалидности. В настоящее время наиболее эффективных методов лечения иммуномодулирующих, но несмотря на их эффективность во многих случаях восстановление часто является медленным и ~ 25% пациентов будут испытывать остаточный функциональные дефициты, которые значительно уменьшить их качество жизни6, 7.

EAN-широко используемых животных модель демиелинизирующих периферической нейропатии, которая предоставила ценную информацию в патогенезе и средства для оценки роман терапевтических агентов4. Эта модель может быть наведено в различных видов, таких как кролики, крыс, мышей и морских свинок и индуцированный иммунизации с нейрогенной антигены. Однако в конечном счете успешное индукции EAN зависит соответствующий иммунный ответ для болезни происходят. Учитывая видов (и Межамери-species/штамм) изменения в иммунной функции, были разработаны несколько комбинаций антигенов и адъювантов успешно побудить EAN. С точки зрения мышиных генетических инструменты C57BL/6 является наиболее широко используемым; Однако традиционные P2 белка пептидные 57-81 (P257-81), что приводит к болезни в подверженных SJL мыши штамм8 неспособен незаконным патогенеза, ведущих к функциональные дефициты в штамм C57BL/6. К счастью, сенсибилизации парадигмы с помощью P0106-125 или P0180-199 пептиды, доставлены в адъювант в сочетании с вдуванием коклюша токсин может преодолеть этот барьер, позволяя сложных генетических инструменты для использования в мышиных EAN модель.

Здесь представлен простой метод для индукции EAN мышей C57BL/6. Кроме того предоставляется подробный всеобъемлющий подход для оценки функциональных и патологического недостатки, связанные с болезнью. P0-180–-199 пептид9 был выбран предпочтение P057-81 альтернативных10. P0180–199 модель была описана производить менее тяжелые клинические признаки, по сравнению с57-81 альтернативных P010и поэтому вероятен выдержать введение потенциально пагубное генетических возмущений, оправиться от хирургических процедур (например, осмотических насосов имплантация) и поддается беговая дорожка походка функции тестирования4. Однако беговая дорожка походка функция тестов и гистологической протоколы, описанные здесь могут легко применяться при изучении болезни в варианте57-81 индуцированной P0.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

все описанные здесь процедуры были одобрены Флори института неврологии и психического здоровья (центр Мельбурна мозга) Комитета по этике животных и следуйте Австралийский кодекс практики для использования животных для науки Целей.

1. МАКПТ индукции

Примечание: EAN может быть успешно вызван в самцов мышей C57BL/6, в возрасте 6-8 недель. Протокол индукции занимает 9 дней в общей сложности. День 0 относится к дню первого иммунизации. Для этого протокола, инъекции были проведены под наркозом (см. шаг 1.1.2 ниже).

  1. На день -1:
    1. подготовить коклюша токсин (см. Таблицу материалы) раствор 1,6 мкг/мл, с использованием стерильных 0,1 М мыши изотонический фосфат буфер солевой раствор (MT-PBS).
    2. Анестезии с изофлюрановая:
        ,
      1. Поместите курсор мыши (C57BL/6, миастения, 6-8 недель) в зале анестезии и отрегулировать поток кислорода до 1 Л/мин
      2. Включите изофлюрановая испарителем, настроить его в 2,5% для анестезии и монитор дыхания и ждать за 2 мин, или до первичных рефлексов (роговицы и задние конечности) больше не реагируют
    3. Удалить мыши из камеры для анестезии и управлять 250 мкл раствора выше коклюша токсин через инъекцию внутрибрюшинного (и.п.), с помощью 0,5 мл шприца с иглой 30 1/2 G.
    4. Подготовить инъекционные посевным материалом для иммунизации:
      1. подготовить решение A с помощью 2 мг/мл раствора P0 180-199 пептида (с > 98% чистоты, последовательность S-S-K-R-G-R-Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) в 0,9% физиологического раствора.
      2. Подготовить Решение B с использованием 20 мг/мл раствора микобактерии туберкулеза (см. Таблицу материалы) в Фройнд ' s полный адъювантной (FCA, состоящий из: 15% mannide monoolate + 85% парафинового масла и 0,5 мг/мл из высушенной убитых и сушеные butyricum M микобактерии).
      3. Сделать окончательный посевным материалом для инъекций, объединить части равного объема решения A и B в било шарик и смешайте их с максимальной скоростью за 1 мин при комнатной температуре.
        Примечание: Решения A и B можно держать как запас и хранить при 4 ° C для максимум один месяц, но комбинированные посевные окончательный необходимо свежеприготовленные на день инъекции мыши.
  2. На день 0, управлять 50 мкл посевным материалом (подготовка, описанные в шаге 1.1.4) в мышь через подкожные инъекции иглой 23 G.
    Примечание: Инъекции могут быть размещены между лопатками, или задних конечностей и хвост на тыльной поверхности хвостового.
  3. На 1 день сделать решение коклюша токсин 1,2 мкг/мл (в MT-PBS) и управлять 250 мкл в мышь через инъекции и.п., с помощью 0,5 мл шприца с иглой 30 1/2 G.
  4. На 3 день, повторите шаг 1.3 выше.
    Примечание: Фондовая решения A и B можно сделать и хранить при 4 ° c для более одного месяца. Однако, окончательное инъекционные посевным материалом, производится путем объединения запасов решения A и B, должно быть сделано в день инъекции.
  5. На 8-й день, управлять 50 мкл посевным материалом (подготовка, описанные в шаге 1.1.4) в мышь через подкожные инъекции (см. шаг 1.2 выше), в том же месте инъекции как шаг 1.2 (для каждого животного)

2. Клиническая забил

  1. выполняют клинических скоринга ежедневно начиная день 0.
  2. Дать каждой мыши счетом 0, 1, 2, 3 или 4 согласно опубликованных критериев 4. Приведены в таблице 1 для EAN клинических скоринга.
    Примечание: Для обеспечения согласованности, следует приложить Оценка мыши в то же время ежедневно же исследователь.

3. Моторные функции оценки

Примечание: Мотор производительности проводится параллельно с клинической забил же когорты животных. Моторную функцию оценки аппарат должен подключаться к компьютеру что походка функция визуализации системы (см. Таблицу материалы) установил. Рекомендуется также, что все мыши следует оценивать следует привыкли к выполняемой задачи до EAN индукции. Для этого, практика работает (2 тестовых запусков на мышь) выполняются три дня до болезни индукции (день -3).

  1. Включите аппарат оценки двигательной функции и переключатель на кнопке света.
  2. Загривок мыши твердо и чернила ее ноги, опустив его на контейнер с красными чернилами удерживая ее хвост.
    Примечание: Этот шаг необходим для штамма C57BL/6, но может быть пропущен, если используется мышь штамма с белым пальто цвета.
  3. Поместите курсор мыши в отсеке пешеходной и беговой дорожки скорость на 15 см/s.
  4. Повернуть на беговую дорожку и нажмите " запись " кнопку для захвата работает движения мыши, используя функцию походки, визуализации системы (см. Таблицу материалы).
  5. Использовать таймер и измерить каждый работает для 36 s. После 36 s, остановить запись и остановить беговая дорожка.
    Примечание: Мышей, которые не может успешно завершить выполняющееся задание для этого 36 интервала s, считаются провалились.
  6. Сохранить видео файл в указанной папке.
  7. Повторите вышеуказанные шаги для каждой мыши необходимо оценить. Протестировать мышей с той же запущенные задачи каждые 3 дня.
  8. Анализ редактировать видео файлов, с помощью программного обеспечения для параметров функции походки (см. Таблицу материалы).
    Примечание: Подробности о том, как анализировать различные моторные параметры варьируются среди программного обеспечения так пожалуйста, обратитесь к производителю ' s инструкция перед анализом. Для получения гистологического свидетельства аксональное и повреждение миелина через иммуногистохимия или электронной микроскопии, животных тканей могут быть приняты на любой стадии пост моторную функцию оценки в зависимости от конкретных целей исследования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

P0180-199 пептид индуцированной EAN приводит мышей C57BL/6 монофазные болезни с клинической оценкой начала от 6 дней поста первого иммунизации (dpi) и максимальная оценка тяжести наблюдается от 25 ДОИ следуют некоторые клиническая оценка улучшение от 40 dpi Продолжительность (рис. 1)4,9. С точки зрения функции походки мышей начинают неудачу в простой выполняющаяся задача 6 ДОИ в кратчайшие ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В настоящем докладе излагается простой способ заставить EAN используя P0180-199 пептида в мышей C57BL/6, позволяя количественная оценка ключевых патологического и функциональные дефициты мышей, индуцированной с EAN. Собственный протокол индукции EAN, описанный здесь является использование анестезии во время выполнения инъекции иммунизации. Использование изофлюрановая анестезии значительно повышает способность обеспечить, что общий объем посевным материалом вводится подкожно в нужном месте с минимальной ошибки ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют никаких конфликтов интересов об этой работе.

Благодарности

DGG-NHMRC Питер Доэрти и начале карьеры парень рассеянный склероз исследований Австралии (MSRA). JLF поддерживается MSRA докторантура стипендий. Эта работа была поддержана австралийского национального здравоохранения и медицинских исследований Совета (NHMRC) проекта предоставить JX #APP1058647.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
C57BL/6, самец, 6-8 недельAustralian Bioresources Cenre, WA, Австралия
Pertussis toxinList Biological Laboratories, Inc., CA, США#181
0,1 M мышиный изотонический фосфатированный буферный (MT-PBS)Laboratories будет иметь свой собственный протокол.
IsofluranePharmachem, QLD, AustraliaLaboratories будет иметь свой собственный протокол введения.
P0180– 199 пептидWuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHNP0180– 199, секвенция S– S– K– R– G– R– Вопросы и ответы; Т&ндаш; P– V– Л&ндаш; Y– А&ндаш; М&ндаш; Л&ндаш; D– Х&ндаш; S– R– S
Тепло убило Mycobacterium tuberculosis (штамм H37RA)Difco, MI, США#231141
Полный адъювант Фройнда (FCA)Difco, MI, США#263910
16% параформальдегид (PFA)Услуги электронной микроскопии#15710Разбавьте до 4% PFA день сбора ткани.
25% глутаральдейдProSciTech Pty Ltd, QLD, Австралия#11-30-8Разбавьте до 2,5% глутаральдегида в день фиксации.
Азид натрияChem-Supply Pty Ltd, SA, АвстралияSL189Создание 10% (w/v) запасов в 0,1M MT-PBS. Используйте при 0,03% (v/v).
SucroseChem-Supply Pty Ltd, SA, АвстралияSA030Использование в концентрации 30% (по мас./об.).
Оптимальная температура резания (ОКТ) средыSakura Finetek, CA, США#4583
Нормальная ослиная сывороткаMerck Millipore, MA, США#S30-100Используйте в качестве разбавителя антител в концентрации 10% (v/v) или другой концентрации, определенной собственной лабораторией.
Triton-X 100Sigma Aldrich, MI, США#90o2-31-1Применение в качестве разбавителя антител в концентрации 0,3% (v/v) или другой концентрации, определенной собственной лабораторией.
кроличий антиамилоидный прекурсор белка (APP)Invitrogen (Life Technologies), CA, СШАS12700Используется в соотношении 1:400 или титруется в собственной лаборатории.
Антиконтактин-ассоциированный белок-1 кролика (Caspr)Подарок от профессора Элиора Пелеша, Научный институт Визмана, ИзраильИспользуется в 1:500 или титруется в собственной лаборатории.
Соответствующие конъюгированные вторичные антитела Alexa FluorMolecular Probes (Life Technologies), OR, СШАРазличноеиспользование в соотношении 1:200 или титрование в собственной лаборатории. Выбор видов, в которых было выращено антитело, и выбор Alexa Fluor остается на усмотрение каждой лаборатории.
Решение для монтажа на водной основеDako (Agilent), CA, США#S3023У каждой лаборатории будут свои предпочтения.
Name<strong>CompanyНомер в каталогеКомментарии
Оборудование
0,5 мл шприц с иглами 301/2 г BD#326105
23 гBD#305143
Подушечкачернилами Любая подушечка с красными чернилами или красный пищевой краситель могут быть использованы для обозначения ног животных.
Аппарат DigiGate (включая беговую дорожку)eMouse Specifics Inc. Фрамингем, Массачусетс
DigiGate Imaging SystemeMouse Specifics Inc. Фрамингем, Массачусетс
СекундомерМожно использовать любой таймер.
DigiGait 8 SoftwareeMouse Specifics Inc. Фрамингем, Массачусетс
Препарирующий микроскопZeissМожно использовать любой подходящий микроскоп для препарирования.
Заряженные слайдыSuperfrost Plus, Lomb Scientific Pty LtdSF41296SP
CyrostatLeicaМожно использовать любой подходящий циростат.
Лаборатории перфузионного оборудования и анатомических инструментовбудут иметь свои собственные перфузионные протоктолы.
Лаборатории с непрозрачными гумифицированными камерамимогут производить свои собственные, используя непрозрачный пластиковый контейнер.
PAP peneGeneTex (США)Восковой карандаш или поверхностное натяжение также могут быть использованы для создания лунки вокруг участка ткани.
Конфокальный микроскопZeis LSM780Можно использовать любой конфокальный микроскоп с соответствующими лазерными линиями.
FIJI/Image JНациональные институты здравоохранениядоступны с www.fiji.sc
иглы с красными

Ссылки

  1. Newswanger, D. L., Warren, C. R. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 69 (10), 2405-2410 (2004).
  2. Ruiz, E., Ramalle-Gomara, E., Quinones, C., Martinez-Ochoa, E. Trends in Guillain-Barre syndrome mortality in Spain from 1999 to 2013. Int J Neurosci. 126 (11), 985-988 (2016).
  3. Walling, A. D., Dickson, G. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 87 (3), 191-197 (2013).
  4. Gonsalvez, D. G., et al. A Functional and Neuropathological Testing Paradigm Reveals New Disability-Based Parameters and Histological Features for P0180-199-Induced Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice. J Neuropathol Exp Neurol. 76 (2), 89-100 (2017).
  5. Berg, B., et al. Guillain-Barre syndrome: pathogenesis, diagnosis, treatment and prognosis. Nat Rev Neurol. 10 (8), 469-482 (2014).
  6. Koller, H., Schroeter, M., Kieseier, B. C., Hartung, H. P. Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy--update on pathogenesis, diagnostic criteria and therapy. Curr Opin Neurol. 18 (3), 273-278 (2005).
  7. Griffin, J. W., et al. Pathology of the motor-sensory axonal Guillain-Barre syndrome. Ann Neurol. 39 (1), 17-28 (1996).
  8. Taylor, W. A., Hughes, R. A. Experimental allergic neuritis induced in SJL mice by bovine P2. J Neuroimmunol. 8 (2-3), 153-157 (1985).
  9. Zou, L. P., et al. P0 protein peptide 180-199 together with pertussis toxin induces experimental autoimmune neuritis in resistant C57BL/6 mice. J Neurosci Res. 62 (5), 717-721 (2000).
  10. Miletic, H., et al. P0(106-125) is a neuritogenic epitope of the peripheral myelin protein P0 and induces autoimmune neuritis in C57BL/6 mice. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (1), 66-73 (2005).
  11. Hafer-Macko, C., et al. Acute motor axonal neuropathy: an antibody-mediated attack on axolemma. Ann Neurol. 40 (4), 635-644 (1996).
  12. Griffin, J. W., et al. Early nodal changes in the acute motor axonal neuropathy pattern of the Guillain-Barre syndrome. J Neurocytol. 25 (1), 33-51 (1996).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

EANP0 180 199

Похожие статьи