Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

На основе RANKL остеокластов культуры Assay из мыши костного расследовать роль mTORC1 в формировании остеокластов

13.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56468

⸱

15 марта 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatric Dentistry, Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai Key Laboratory of Stomatology & Shanghai Research Institute of Stomatology, National Clinical Research Center of Stomatology, 2State Key Laboratory of Cell Biology, CAS Center for Excellence in Molecular Cell Science, Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, University of Chinese Academy of Sciences, 3Department of Oral and Maxillofacial-Head and Neck Oncology, Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Эта рукопись описывает протокол к изоляции и культуры остеокласты в пробирке из костного мозга мыши и для изучения роли млекопитающих/механистический цель rapamycin комплекс 1 в формировании остеокластов.

Аннотация

Остеокласты являются уникальные кости resorbing клеток, которые отличают от линии моноцитов/макрофагов костного мозга. Дисфункция остеокластов может привести к серии метаболических заболеваний костей, включая остеопороза. Для разработки фармацевтических целей для профилактики патологических костной потери массы, необходимо понимать механизмы, которыми остеокласты дифференцировать от прекурсоров. Способность изолировать и культуры большое число остеокластов в vitro имеет решающее значение для того, чтобы определить роль конкретных генов в дифференциации остеокластов. Инактивация млекопитающих/механистический цель rapamycin комплекс 1 (TORC1) в остеокластов может уменьшить число остеокластов и увеличения костной массы; Однако основные механизмы требуют дальнейшего изучения. В настоящем исследовании описан RANKL-протокол на основе изолировать и культуры остеокласты из костного мозга мыши и изучить влияние инактивирование mTORC1 на формирование остеокластов. Этот протокол успешно привели в большое количество гигантских остеокласты, обычно в течение одной недели. Удаление Raptor нарушения формирования остеокластов и снизилась активность секреторной тартрата стойкие кислая фосфатаза, означающее что mTORC1 имеет решающее значение для формирования остеокластов.

Введение

Кости является постоянно меняющейся органом и перестроенный остеобластов и остеокласты на протяжении всей жизни. Остеокласты отвечают для рассасывания минерализованных матрицы и остеобластов синтезировать и выделяют новые костной матрицы1. Баланс между костную резорбцию и формирования костей имеет решающее значение для здоровья костей, включая поддержание костной массы и ответ на стимуляцию и травмы. Если этот баланс нарушается, может возникнуть ряд метаболических заболеваний костей, включая остеопороза и заболеваний пародонта. В этих заболеваний костной массы потери в результате osteoclastic костную резорбцию превышает костей, образующих потенциал остеобластов2,3. Таким образом в целях разработки фармацевтических целей для лечения скелетных расстройств, таких как остеопороз, важно понять поколения и биологии остеокласты4.

Остеокласты уникальный гигантские многоядерные клетки, расположенные на или вблизи поверхности кости и принадлежат к моноцитов/макрофагов семьи1. Ibbotson K. J. и др. сообщил метод для создания остеокластов подобных клеток в пробирке с средой, содержащей 1,25-дигидрокси витамин D35. Выявление макрофагальный колонии стимулирующий фактор (M-CSF) и рецепторов активатор для ядерного фактора κ B лиганда (RANKL) как основные факторы формирования остеокластов резко повысило эффективность osteoclastogenesis в пробирке 1 , 6 , 7. способность культуры остеокласты в vitro улучшилось наше понимание поколения и регулирование остеокластов.

Млекопитающих/механистический цель rapamycin (mTOR) функций в двух структурно и функционально различных комплексов, а именно mTORC1 и mTORC28,9. Два различных белковых комплексов отличаются друг от друга из-за их различных компонентов и ниже по течению субстратов. mTORC1 содержит уникальные регулирования связанных белков mTOR (хищника), а mTORC2 rapamycin нечувствительным компаньон mTOR (Rictor)9. mTORC1 можно интегрировать и передавать важные сигналы регулировать рост клеток, пролиферации и дифференцировки. Недавно мы продемонстрировали, что mTORC1 играет ключевую роль в сети катаболических костную резорбцию путем удаления Raptor для инактивации mTORC1 в остеокласты10. Однако основные механизмы требуют дальнейшего изучения. В настоящем исследовании на основе RANKL osteoclastogenic метод был использован для создания остеокласты из костного мозга, полученных макрофагов (BMMs) одичал типа (WT) и рэпCtsk мышей, а также изучить влияние инактивирование mTORC1 на остеокластов формирование.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были выполнены в соответствии с протоколом, утвержденным в Стэнфордском административной панели на лабораторных животных уход (APLAC); и были одобрены животное уход и использование Комитета Шанхайского института биохимии и ячейки Биология.

1. Подготовка

  1. Генерировать остеокластов конкретных Raptor удаления мышей (Raptorfl/fl; Ctsk-cre, далее, рэпCtsk) путем скрещивания Raptorfl/fl мышей с Ctsk-cre мышей. Используйте мышь Raptorfl/fl как WT управления в данном исследовании.
  2. Иметь контейнер со льдом, чтобы держать изолированных кости.
  3. Подготовка питательной среды.
    1. Подготовьте α-MEM питательной среды, дополняющего минимальных основных средних альфа (α-MEM) с 1 x глутамина, пенициллин стрептомицином и 10% плода телячьей сыворотки.
    2. Подготовьте костного макрофагов индукции среднего, состоящий из 50 мл α-MEM средних и M-CSF в 20 нг/мл.
    3. Подготовка среднего индукции остеокластов, состоящий из M-CSF и RANKL на 20 нг/мл, соответственно, 50 мл α-MEM среды.
  4. Подготовьте следующие буферы до окрашивания ЛОВУШКУ.
    1. Подготовьте исправление раствор, состоящий из 6,5 мл ацетона, 2,5 мл раствора цитрата и 0,8 мл раствора формальдегида (vol/vol) 37%.
    2. Подготовьте ловушек, окрашиванию решение.
      1. Prewarm деионизованной воды 37 ° C.
      2. Добавить 100 мкл быстро граната GBC базового решения и 100 мкл раствора нитрита натрия в 1,5 мл микропробирок и смешивать, нежный инверсии для 30 s. оставить смесь стоять за 2 мин.
      3. Prewarm 9 мл деионизованной воды 37 ° C. Добавьте 200 мкл diazotized быстро граната GBC базового решения от шага 1.4.2.2, 100 мкл раствора фосфат Нафтол AS-би, 400 мкл раствора ацетата и 200 мкл тартрата раствор.
      4. Держите ЛОВУШКУ, окрашивание раствора смесь на водяной бане при температуре 37 ° C.
  5. Подготовьте следующие буфера перед ЛОВУШКУ активности количественная оценка питательной среды.
    1. Подготовить тартрата буфера (50 мл): 2 мл L-винной кислоты 0,33 М, 48 мл 0,33 М натрия тартрата двуосновной обезвоживанию. Отрегулируйте значение pH 4,9.
    2. Подготовка 4-нитрофенил фосфат динатрия (pNPP) буфера (200 мл): 1.502 g глицина, 41 мг MgCl2, 27,2 мг ZnCl2и 180 мл деионизованной воды. Отрегулируйте значение пэ-аша для 10.4 с 3 M NaOH и объем до 200 мл деионизированной водой.
    3. Подготовка pNPP буфер с фосфатазы субстрата (для одного 96-луночных Латы): 49.37 мг фосфатазы субстрат и 175 мкл буфера pNPP шага 1.5.2.
    4. Подготовка субстрата буфера (9 мл/96-луночных Латы): 6.24 мл деионизированной воды, 360 мкл раствора ацетата, а 2,4 мл тартрата буфера. Mix вихря и разогреть при 37 ° C перед использованием.
    5. Добавление 9 мл разогретой субстрата buffer(1.5.4) сделать смеси субстрата и вихревые для 10 90 мкл буфера pNPP с фосфатазы substrate(1.5.3) s.

2. Вскрытие (день -1)

  1. Усыпить 3 1 месяц старый самок мышей WT и рэпCtsk CO2 отдельно. Выполняйте CO2 ингаляции с соответствующим оборудованием, квалифицированным персоналом.
  2. Погружайте 6 мышей в стакан с 100 мл 75% этанола (vol/vol) 5 мин для предотвращения бактериального загрязнения и затем разместить на доске рассечение в лежачем положении. Сделать надрез на дистальном голени вертикально и вскрыть кожу вдоль задних конечностей офтальмологический ножницами.
  3. Вырезать суставных связок тазобедренного сустава с ножницами и вывихнуть задних конечностей из ствола.
  4. Вырезать суставных связок коленного сустава и аккуратно отделить голени и бедра от коленного сустава. Аккуратно удалите мягких тканей с ножницами.
  5. Поместите все кости одной генотипа в одной мыши в каждой скважине шести хорошо плита с 2 мл α-MEM на льду.
    Примечание: Для сохранения жизнеспособности клеток, кости должны храниться в этих условиях для менее 1 ч.

3. изоляция (день -1)

  1. Заполните одно также шесть ну плиты с 75% этанола (3 мл) и другие 5 скважин с α-MEM среднего (3 мл).
  2. Положите все кости одной генотипа в этанол мыть за 15 s и мыть кости 5 раз с α-MEM средой для 10 s каждый раз.
  3. Cut off эпифизов с ножницами и вставьте иглу шприца 0,45 мм в полости и флеш костного мозга, с α-MEM среднего в 50-мл пластиковых пробирок.
  4. Промойте полость кости, используя тот же метод из другого конца кости. Повторите по крайней мере дважды, чтобы вымыть полость кости до тех пор, пока кости бледно.
  5. Центрифуга костного мозга для получения клеток лепешки на 800 x g и 4 ° C за 5 мин аспирата супернатант.
  6. Добавьте 3 мл буфера lysis красных кровяных клеток в пластиковых пробирок и очистка нежно ресуспензируйте костного мозга. Держите пластиковых пробирок на льду на 8 минут, чтобы лизировать красных кровяных клеток.
  7. Добавьте 6 мл α-MEM среды в пластиковых пробирок остановить лизис клеток. Центрифуга 500 x g и 4 ° C на 10 минут и удалить супернатант.
  8. Ресуспензируйте в 3 мл α-MEM питательной среды и место клетки в шести ну плиту (обычно один мышь за хорошо).
  9. Инкубируйте при 37 ° C в 5% CO2 инкубатора на ночь.

4. обшивка (день 0)

  1. Передать супернатант пластиковых пробирок 15мл собирать неприсоединенной клетки на следующее утро.
  2. Центрифуга на 800 x g и 4 ° C на 5 мин и удалить супернатант.
  3. Ресуспензируйте в 4 мл α-MEM питательной среды.
  4. Возьмите 20 мкл раствора клеток и смешать с 20 мкл Трипановый синий. Добавить 10 мкл смеси в Счетной палате и получить количество клеток в мл раствора.
  5. Добавьте соответствующий объем α-MEM питательной среды для получения клеток решение 500000 клеток/мл.
  6. Добавьте 500 мкл и 50 мкл костного макрофагов индукции среды в каждой скважине 24-Ну и 96-луночных крышку, соответственно.
  7. Добавьте 500 мкл и 50 мкл раствора клеток в каждой скважине 24-Ну и 96-луночных крышку, соответственно.
  8. Инкубируйте 3 дней при 37 ° C в 5% CO2 инкубатора.

5. Дифференциация (3-7 дней)

  1. Через три дня после покрытия, собирать 50 мкл среднего от каждой скважины 96-хорошо пластины и заморозить при температуре-20 ° C, затем аспирационная остаточного среднего.
  2. Добавьте 1 мл и 100 мкл остеокластов индукции среднего в каждую лунку 24-ну плиты и плиты 96-луночных, соответственно.
  3. Инкубируйте при 37 ° C в течение 2 дней.
  4. Собирать 50 мкл среды от каждой скважины и аспирационная остаточного среднего.
  5. Добавьте остеокластов индукции среднего в каждой скважине.
  6. Инкубируйте при 37 ° C, за 1 день.
    Примечание: В этот момент времени, большие, многоядерные остеокласты следует рассматривать под инвертированным микроскопом (рис. 2A).
  7. Если не видны остеокласты, измените среднего индукции остеокластов и наблюдать ежедневно, пока не видел остеокластов.
  8. Соберите 50 мкл среды от каждой скважины 96-луночных пластины после того, как сформировались остеокластов.

6. тартрата пятнать устойчивостью кислой фосфатазы (ловушка)

Примечание: Зрелые остеокластов может присутствовать после 6-7 дней в vitro культуры (шаг 4).

  1. Аспирационная среднего и мыть нежно 3 раза с ПБС.
  2. Исправить ячейки в каждой скважине 96-луночных пластины с 100 мкл раствора исправление для 30 s при комнатной температуре.
  3. После фиксации аспирационная решения и мыть нежно 3 раза с деионизированную воду подогретую до 37 ° C. Аспирационная деионизированную воду.
  4. 100 мкл ЛОВУШКУ пятно в каждой скважине 96-луночных пластины и место пластину в инкубаторе при 37 ° C 30 мин и щит от света.
  5. После окрашивания, аспирационная ЛОВУШКУ пятно и осторожно промойте деионизованной воды 3 раза.
  6. Остеокласты изображения с помощью инвертированного микроскопа при 40 кратном.

7. ЛОВУШКУ активности количественная оценка питательной среды

  1. Сбор 30 мкл культуры супернатанта от каждой скважины 96-луночных пластины из шага 5.1, 5.4 и 5.8; Используйте 30 мкл-культивированный остеокластов индукции среды как отрицательный контроль. Поместите образцы в новой 96-луночных пластины.
  2. Добавление 90 мкл mixture(1.5.5) субстрата в каждой скважине 96-луночных пластины.
  3. Место пластину в инкубаторе при 37 ° C 1 h и щит от света.
  4. Остановите реакции, добавляя 50 мкл 3 M NaOH в каждой скважине 96-луночных пластины.
  5. Измерения theabsorbance на длине волны 405 нм.

8. западный Blotting

Примечание: После 6-7 дней в vitro культуры в пластину 24-Ну, Зрелые остеокласты должны быть видны.

  1. Аспирационная среды.
  2. Мыть нежно с предварительно охлажденный 1 x PBS 3 раза.
  3. Аспирационная PBS.
  4. 100 мкл 1 x SDS лизис буфера содержащий ингибитор протеазы коктейль.
  5. Лизатов тепла при 105 ° C 10 мин и центрифуги на 12 000 × g и 4 ° C на 10 мин собирать supernatants, содержащие белки.
  6. Отдельные лизатов, содержащие 30 мкг белка на 10% SDS-PAGE11 и затем передать винилидена фторида (PVDF) мембраны.
  7. Блокировать мембраны с 5% обезжиренное молоко за 30 мин.
  8. Инкубации мембран с анти ящера, анти P-S6, анти S6, анти β-актина в 1:1,000 разрежения в 5% обезжиренное молоко при температуре 4 ° C на ночь.
  9. Вымойте мембраны с трис буфер солевой с Tween-20 (TBST) для 10 мин при комнатной температуре.
  10. Повторите шаг 8,9 дважды.
  11. Инкубации мембран с пероксидазой хрена (ПХ)-конъюгированных IgG антитела анти мыши или кролика на 1:5,000 разрежения в 5% обезжиренное молоко в течение 1 ч при комнатной температуре.
  12. Вымойте мембраны 3 раза с TBST 10 мин при комнатной температуре.
  13. Хемилюминесцентный детектор добавить Западной Хемилюминесцентный субстрат HRP на мембранах и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре. Слейте излишки субстрата и разоблачить помарки для рентгеновской пленки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Используя настоящий Протокол, большое количество гигантских остеокласты были замечены на день 6; Если не видны гигантских остеокласты, еще один день дифференцировки остеокластов может быть необходимо (рис. 1). Формирование успешных остеокластов был подтвержден ловушек, окрашиванию (рисунок 2A). Остеокласты были гигантские клетки вино красный/фиолетовый с более чем 3 ядрами. Более чем 250 остеокласты были получены в каждой скважин...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Osteoclastogenic assay является наиболее широко используемый метод, чтобы изолировать и культуры остеокласты в пробирке12,13. Хотя несколько основанных на RANKL остеокластов индукции были описаны13,14,15, настоящее исследование описал протокол с некоторыми изменениями, на основе предыдущих методов.

В предыдущем исследовании сразу же п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Все авторы заявляют, что они имеют без конфликта интересов.

Благодарности

Авторы благодарят доктор Minghan Тонг и S. Като за любезно предоставление реагентов и мышей. Мы благодарим членов Цзоу лаборатории для полезных обсуждений. Эта работа частично поддержали грантов из 973 программы из китайского министерства науки и технологии (большинство) [2014CB964704 и 2015CB964503], программы клинических исследований 9 людей больницы, Шанхай Jiao Tong школы медицины университета. Спасибо за помощь Фонда основной клеточной биологии и основной объект для химической биологии, CAS центр передового опыта в области науки для молекулярной клеток, Шанхайский Институт биохимии и клеточной биологии, Китайской академии наук.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
мыши Raptorfl/flЛаборатория Джексона013188
ctsk-cre вподарок от С. Като, Токийский университет, Токио, Япония
α-MEMCorning10-022-CVR
GlutamineGibico25030081
пенициллин стрептомицинGibico15140122
Фетальная сыворотка теленкаBioInd04-001-1A
Рекомбинантный мышиный белок M-CSFR& DQ3U4F9
Рекомбинантный мышиный белок RANKLR& DQ3TWY5
RBC буфер для лизисаBeyotimeC3702
Трипановый синийSigma-Aldrich302643
AcetoneShanghai Chemical Co. Ltd.
Раствор цитратаSigma-Aldrich915
Раствор формальдегидаShanghai Chemical Co. Ltd.
Набор кислой фосфатазы, лейкоцитов (TRAP)Sigma-Aldrich387A-1KT
Fast Garnet GBC Base solutionSigma-Aldrich3872
Раствор нитрита натрияSigma-Aldrich914
Нафтол AS-BI Фосфатный растворSigma-Aldrich3871
Раствор ацетатаSigma-Aldrich3863
Раствор тартратаSigma-Aldrich3873
Фосфатно-солевой буферный раствор ДульбеккоCorning21-031-CVR
L-винная кислотаSigma-Aldrich251380
Диосновной дегидрат тартрата натрияSigma-Aldrichs4797
GlycineShanghai Chemical Co. Ltd.
MgCl2Shanghai Chemical Co. Ltd.
ZnCl2Shanghai Chemical Co. Ltd.
NaOHShanghai Chemical Co. Ltd.
Фосфатазный субстратSigma-AldrichP4744
анти-RaptorCell Signaling Technology2280
анти-P-рибосомальный белок S6 (S235/236)Cell Signaling Technology2317
анти-рибосомальный белок S6Cell Signaling Technology2211
анти-&бета;-актинSanta Cruz Биотехнологияsc-130300
37% формальдегидXilong научный
поливинилиденфторид (PVDF) мембранаBio-Rad
Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL)Millipore00000367MSDS
IX71Olympus
EnvisionPerkin Elmer
0,45 мм Шприц-ножницы
Щипцы
от комаров

Ссылки

  1. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
  2. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Genetics. 33, 245-254 (2003).
  3. Feng, X., McDonald, J. M. Disorders of bone remodeling. Annu Rev Pathol. 6, 121-145 (2011).
  4. Boyce, B. F. Advances in osteoclast biology reveal potential new drug targets and new roles for osteoclasts. J Bone Miner Res. 28 (4), 711-722 (2013).
  5. Ibbotson, K. J., Roodman, G. D., McManus, L. M., Mundy, G. R. Identification and characterization of osteoclast-like cells and their progenitors in cultures of feline marrow mononuclear cells. J Cell Biol. 99 (2), 471-480 (1984).
  6. Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93 (2), 165-176 (1998).
  7. Wong, B. R., et al. TRANCE is a novel ligand of the tumor necrosis factor receptor family that activates c-Jun N-terminal kinase in T cells. J Biol Chem. 272 (40), 25190-25194 (1997).
  8. Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (1), 21-35 (2011).
  9. Bhaskar, P. T., Hay, N. The two TORCs and Akt. Dev Cell. 12 (4), 487-502 (2007).
  10. Dai, Q., et al. Inactivation of Regulatory-associated Protein of mTOR (Raptor)/Mammalian Target of Rapamycin Complex 1 (mTORC1) Signaling in Osteoclasts Increases Bone Mass by Inhibiting Osteoclast Differentiation in Mice. J Biol Chem. 292 (1), 196-204 (2017).
  11. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold spring harbor laboratory press. (1989).
  12. Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
  13. Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).
  14. Tevlin, R., et al. Osteoclast derivation from mouse bone marrow. J Vis Exp. (93), e52056(2014).
  15. Xing, L., Boyce, B. F. RANKL-based osteoclastogenic assays from murine bone marrow cells. Methods Mol Biol. 1130, 307-313 (2014).
  16. Hsu, H., et al. Tumor necrosis factor receptor family member RANK mediates osteoclast differentiation and activation induced by osteoprotegerin ligand. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (7), 3540-3545 (1999).
  17. Underwood, J. C. From where comes the osteoclast? J Pathol. 144 (4), 225-226 (1984).
  18. Wein, M. N., et al. Control of bone resorption in mice by Schnurri-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8173-8178 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Анализ на основе RANKLинактивация mTORC1макрофаги костного мозгатартрат-резистентная кислая фосфатазапротокол культивирования клетокдифференцировка остеокластовделеция Raptorокрашивание на TRAP
На основе RANKL остеокластов культуры Assay из мыши костного расследовать роль mTORC1 в формировании остеокластов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.