Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

На основе шар травмы побудить Myointimal гиперплазии в мыши брюшной аорты

9.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56477

⸱

7 февраля 2018 г.

 ,  ,  ,  , 
1Transplant and Stem Cell Immunobiology Lab, University Heart Center, 2Department of Surgery, Transplant and Stem Cell Immunobiology Lab, University of California San Francisco (UCSF), 3Cardiovascular Research Center (CVRC) and DZHK German Center for Cardiovascular Research, 4Cardiovascular Surgery, University Heart Center

В этой статье

Краткое содержание

Эта статья демонстрирует мышиных модель для изучения развития myointimal гиперплазия (MH) после травмы аорты шар.

Аннотация

Использование животных моделей имеет важное значение для лучшего понимания MH, одной из основных причин для артерий стеноза. В этой статье мы демонстрируем мышиных шар денудации модель, которая сопоставима с установленным судно травмы модели в крупных животных. Аорта денудации модель с Баллонные катетеры имитирует клинических условиях и приводит к сопоставимым pathobiological и физиологических изменений. Кратко после выполнения горизонтальный разрез в аорте abdominalis, баллонный катетер будет вставлен в судно, завышены и представил retrogradely. Инфляция шара приведет к интимы травмы и растяжением судна. После удаления катетера, аортальный разрез будет закрыт с одной швами. Модель, показанные в этой статье, воспроизводимость, легко выполнить и могут быть созданы быстро и надежно. Это особенно подходит для оценки дорогих экспериментальной терапевтических агентов, которые могут быть применены экономичным образом. С помощью различных штаммов нокаут мышь, можно оценить влияние различных генов на MH развития.

Введение

Артерий стеноза коронарных и периферических артерий имеет большое влияние на заболеваемость и смертность больных1. Один основной патологический механизм является myointima гиперплазия (MH), который характеризуется повышенной распространения, миграции и синтез белков внеклеточного матрикса от сосудистой гладкомышечные клетки (SMC)2. SMC расположены в слое СМИ судна и мигрируют на стимуляции поверхности просвета. Стимулирующее сигналы включают факторы роста, цитокины, контакт ячеек, липиды, компоненты внеклеточного матрикса и механических ножниц и растягивать силы3,4,5,6. Травм стенок сосудов, патологических или ятрогенные, вызывают повреждения клеток гладких мышц и эндотелиальных клеток и стимулировать воспалительной реакции и таким образом привести к MH7.

Различные животные модели в настоящее время доступны для изучения артериальной травмы и myointima гиперплазия. Крупные животные, как свиньи или собаки имеют преимущество обмена аналогичного артерии и коронарной анатомии с людьми и особенно хорошо подходят для исследования расследует ангиопластики методы, процедуры и устройства8. Однако свинья модели имеют недостаток выше thrombogenicity9,10, в то время как собаки только имеют мягкий ответ на травмы судно11. Кроме того все большие животные модели требуют специального жилья, оборудование и персонал, которые связаны с высокими затратами и не всегда доступны в учебном заведении. Малые животные модели включают крыс и мышей. По сравнению с крыс, мышей имеют преимущества более низкой стоимости и существование различных выбить модели. Модель, описанную в этом видео может сочетаться с ароЕ / мышей кормили с западной диеты тесно имитировать клинических условиях ангиопластика сосудов атеросклеротические12. Предыдущие модели индуцированной сосудистых повреждений через провод травмы13, жидкости усыхания14, Весна15или травмы манжеты16. Поскольку характер травмы значительно влияют на развитие и Конституции MH, с использованием баллонного катетера побудить травмы судно является лучшим способом имитировать клинических условиях.

В этой статье мы опишем новый метод побудить MH с баллонного катетера в мышах. Использование баллонного катетера (1,2 мм x 6 мм) с RX-порт (рис. 1A) позволяет соскоб интимы слоя и в то же время, индукции растяжением судна. Оба эти фактора являются важными триггеров для развития MH. Время наблюдения для этой модели составляет 28 дней17.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Животных получил гуманной помощи в соответствии с руководство по принципам лабораторных животных, подготовленный Институтом ресурсов лабораторных животных и публикуемых национальными институтами здравоохранения. Все животные протоколы были одобрены ответственным местным органом власти ('' Amt für Gesundheit und Verbraucherschutz, (отделение для здравоохранения и защиты потребителей) Hansestadt Гамбург '').

1. катетер подготовка

Примечание: Обратитесь к Таблице материалов для получения информации о катетер.

  1. Возьмите катетер из держателя катетера.
  2. Вытяните проволочного проводника от просвета через дистальный порт вне.
  3. Положите в капле Цианакрилатный клей на дистальном конце катетера.
    Предупреждение: Используйте латексные или нитриловые перчатки.
  4. Проволочный проводник в порт RX катетера и заранее через просвет в дистальный порт. Впоследствии потяните проволочного слегка оставить пространство ~ 5 мм до конца.
  5. Подождите 5 минут, чтобы позволить клей для просушки.
  6. Переместить проволочного проводника, она должна быть исправлена. Если это до сих пор мобильных, повторите шаги 1.3-1.6.
  7. Заполните шприц 3 мл с 1,5 мл 0,9% физиологического раствора и подключите его к порту инфляции шар.
  8. Толкать поршень шприца, чтобы проверить воздушный шар инфляции. Оставьте 0,6 мл физиологическим в шприц.

2. Подготовка мыши

  1. Получите мышей-самцов в возрасте 14 недель, весом около 30 грамм.
    Примечание: Мы использовали животных, полученные из Института лабораторных животных. Мы использовали C57BL/6J здесь.
  2. Используйте камеру индукции для обезболивают мыши с 2,0-2,5% isofurane (500 мл/мин скорость потока кислорода).
  3. Поместите курсор мыши на его обратно на грелку и поддержание анестезии с маску, охватывающий рот и нос мыши. Проверить наличие достаточной глубины анестезии, щипать, лапы и хвост, чтобы проверить отсутствие рефлексов.
  4. Удаление брюшной волосы с помощью машинки.
  5. Распространения задние ноги и исправить их позицию с помощью липкой ленты.
  6. Лечить области живота, используя повидон йод, а затем 80% этанола. Повторите этот шаг еще два раза.
  7. Используйте хирургические Пелерина чтобы убедиться, что хирургическое сайта не получить загрязненные. Откройте слои кожи и мышц вдоль linea alba с ножницами (или скальпеля) подвергать органов брюшной полости.
  8. Положите кишечника в 0,9% солевой увлажненной перчатку и обернуть держать их влажными.
  9. Используйте два штрафа щипцы для удаления жировой ткани выше брюшной аорты.
  10. С помощью шприца инсулина (30G), инъекционные 250 мкл раствора гепарина (50 ед/мл) в нижней полой вены (IVC) и подождать 3 минуты для его распределения системных. Гепарин будет подавлять гемостаза и предотвратить нежелательные свертывания во время операции.
  11. С помощью двух щипцы, вскрыть infrarenal аорты вплоть до его раздвоения и его исходящих судов филиал.
  12. Перевязать стороне судов, которые, как ожидается, будут размещаться в районе зажимается, с высокой температуры cauterizer.
  13. Остановить поток крови, пережатия infrarenal аорты непосредственно под почечных артерий.
  14. Место второй зажим на дистальном позиции чуть выше бифуркации аорты.
  15. Выполните небольшой горизонтальный разрез с помощью ножниц на середину между зажимами вдоль судна.
    Примечание: Размер разреза должна быть эквивалентна 1/3 длины окружности судна.
  16. Вставьте шприц с иглой (30G) в разрез и промойте аорты с 250 мкл раствора гепарина (50 ед/мл).
  17. Использование 10-0 швы, место один сингл узелок на каждой стороне разреза.
  18. Разбавить аорты, вставив расширитель сосуда в разрез и слегка распространения судна. Повторите дилатация 2-3 раза.
  19. Увлажнение баллонный катетер с 0,9% физиологического раствора.
  20. Вставьте плоский баллонного катетера в аорту и продвигаться к проксимальной зажим на аорте.
  21. При достижении проксимальной зажим, тщательно открыть проксимальной зажим и надуть шар для предотвращения утечки крови, путем инъекций ~0.6 мл физиологического раствора.
    Примечание: Отношение завышенных шар судно составляет 1.5: 1.
  22. Продвигать катетер, ретроградная для приблизительно 2 см.
  23. Тяните расширенной катетер обратно, при этом слегка дефлирования шар, выпустив шприц.
  24. Присоедините проксимальной зажим, когда катетер достигает разрез аорты. Полностью дефлирования шар и удалите его.
  25. Промойте аорты с 250 мкл раствора гепарина (50 ед/мл) с помощью шприца 30G.
  26. Закройте аорты разрез с помощью 10-0 швы. Место прервана швы на каждой боковой стороне, следуют одна или две строчки на брюшной стороне.
  27. Откройте дистальной зажим. При кровотечении, снова закройте зажим и место дополнительных швов.
  28. Откройте проксимальной зажим тщательно.
  29. Место два тампоны на шов поддержать его и остановить любое кровотечение.
  30. Место рассасывающиеся hemostats на шовный материал для его поддержания.
    Примечание: Аорты импульса должна быть видна дистально от разреза.
  31. Место кишечника обратно в брюшную полость.
  32. Промыть брюшную полость с стерильным 0,9% физиологического раствора, который был подогретым до 37 ° C.
  33. Закройте брюшной мышцы слой с помощью 6-0 работает швы.
  34. Закройте кожи с работающей швами 5-0.
  35. Придать 4-5 мг/кг Carprofen подкожно перед позволяя мышью разбудить. Следить за животное, до тех пор, пока он приобрел сознания, поддерживать грудной recumbency. Держите животных только в клетке до полного выздоровления.
  36. Добавить Метамизол натрия в питьевой воде (50 мг/100 мл) как обезболивающее для 3 дней и ежедневно следить за животное. Обычно мыши любят сладкий вкус Метамизол натрия и начать пить сразу же после операции. Если предпочтительным, устойчивый релиз инъекционные агентов может использоваться вместо Метамизол натрия.
    Примечание: Период наблюдения для этой модели составляет 28 дней.

3. гистопатология

  1. Урожай воздушный шар ранения аорты после 28 дней путем подготовки мышей, как описано в шагах 2.2 до 2,9.
  2. Используйте ножницы, чтобы удалить шар ранения аорты (между бифуркации и 0,3 мм выше почечных сосудов) и усыпить мыши путем вырезания его сердце.
  3. Промойте просвет сосуда с 0,9% NaCl.
  4. Исправить заготовленной судна в параформальдегида 4% (PFA) на ночь и обезвоживания в повышении концентрации этанола, начиная с 70% этанол на 2 часа, 80% этанола за 1 час, этанол 95% за 2 часа и 100% этанола 5 часов. Затем Проинкубируйте образцы в ксилоле 2 часа 3 раза, прежде чем проникнуть образцы с парафином.
    Примечание: вместо промывка заготовленной сосуд с 0,9% NaCl, он может быть сброшены с 4% PFA.
    Предупреждение: PFA и ксилол являются токсичными и должен рассматриваться с особой осторожностью.
  5. Внедрить образца в парафин и нарезать кружочками толщиной 5 мкм, используя микротом.
  6. Deparaffinize слайды с ксилол 3 раза за 5 минут.
  7. Увлажняет ткань слайды с помощью ряда снижение этанола. Начните с 100% этиловом спирте 2 раза за 5 мин, затем 3 минуты 95%, 80% и 70% этанола.
  8. Пятно слайды с Masson trichrome окрашивание как описано18.
  9. Обезвоживает окрашенных слайды в 100% этиловом спирте 2 раза по 10 мин. Снимите с ксилоле 2 раза по 10 мин и смонтировать в среде монтажа.
  10. Просмотрите слайды с микроскопом светлые области. Используйте объектив с 5-кратным увеличением и числовая апертура 0.12 Обзор рисунка или объектив с 20 x увеличениях с числовой апертуры 0.35 подробные наблюдения.

4. иммунофлуоресценции

  1. Увлажняет ткань слайды с помощью ряда снижение этанола. Начните с 100% этиловом спирте 2 раза за 5 мин, затем 3 min 95%, 80% и 70% этанола.
  2. Выполните антиген поиска путем нагревать слайды в антиген поиска решения в пропаривателе за 20 мин.
  3. Пусть слайды остыть до комнатной температуры.
  4. После мытья слайды в три раза с-фосфатный буфер (PBS), применяются блокировки раствор антигена на участках за 30 мин.
  5. Вымойте слайды три раза за 5 мин с PBS.
  6. Проинкубируйте секции с основного антитела, разбавленных в основное антитело разбавителя.
    Примечание: В нужное время концентрации и инкубации должен быть выбран отдельно для каждого антитела.
  7. Вымойте слайды три раза за 5 мин с PBS удалить несвязанные антитела.
  8. Проинкубируйте секции с предварительно конъюгированных вторичное антитело, разбавленных в вторичное антитело разбавителя.
    Примечание: В нужное время концентрации и инкубации должен быть выбран отдельно для каждого антитела.
  9. Удаление несвязанных антитела путем промывания слайды для 5 минут три раза.
  10. Counterstain клеточных ядер, используя 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) для 15 мин; конечная концентрация DAPI должно быть 350 Нм.
  11. Смонтируйте слайды иммунофлюоресценции совместимые монтажные решения.
    Примечание: С помощью решения неправильный монтаж может скрывать флуоресценции сигнала.
  12. Просмотр слайдов с флуоресцентным микроскопом. Используйте 40 x увеличение объектива с числовой апертуры 1.3.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Денудация шар является подходящей модели для изучения развития MH мышей. Животные также восстановиться после операции и показать отличное физическое состояние после операции. Мы создали эту модель в 50 мышей с менее чем 3% смертность из-за хирургической процедуры. Цифры-1B -C показывают основные хирургические шаги. После Кожный разрез вдоль linea alba, определить abdominalis аорты. Место микрохирургическое зажимы (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Эта статья демонстрирует мышиных модель для изучения развития myointimal гиперплазия и позволяет изучение основных патологических процессов и испытаний новых лекарств или терапевтические возможности.

Наиболее важным этапом в этот протокол является денудации аорты. Особое внимание следует уделять во время этого шага, как чрезмерное денудации приведет к формированию аневризмы и модель сбоя. С другой стороны если денудации выполняется недостаточно, слишком мало myointima будет развиваться. Таким ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Авторы благодарят Christiane Pahrmann за ее технической помощи.

D.W. был поддержан фондом Kade Max. T.D. получили гранты от еще Kröner фонд (2012_EKES.04) и Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE2133/2-1_. S. S. получил гранты на исследования от Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; SCHR992/3-1, SCHR992/4-1).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10-0 Этилон шовный материалEthicon2814G
3 мл ШприцBD Медицинский309658
37% HClSigma-AldrichH1758
5-0 проленовый шовEthiconEH7229H
6-0 проленовый шовный материалEthicon8706H
Кислота фуксинSigma-AldrichF8129-25GТрихром окрашивающий
антиген Раствор для извлеченияДакоS1699
АзофлоксинВальдек1B-103Трихром окрашивающий
Бепантен Глазная и Носовая мазьБайер1578675глаз
Бетадин РастворБетадин Пердью ФармаNDC:67618-152
C57BL/6JЧарльз РиверБиржевой номер 000664
Аппликатор зажимаFine Science Tools18056-14JAW DIMS: 4 x 0,75 мм ДЛИНА: 13 мм
Коллаген 3abcamab7778Антитело
DAPIThermo FischerD1306
Ослик против козы IgG AF555ИнвитрогенA21432Вторичное антитело
Осёл против кролика IgG AF488ИнвитрогенA21206Вторичное антитело
Осёл против кролика IgG AF488ИнвитрогенA11055Вторичный антитело
Donkey anti-rabbit IgG AF555InvitrogenA31572Вторичное антитело
Этанол 70%Th. Geyer2270
Этанол 96%Th. Geyer2295
Абсолютный этанолTh. Geyer2246
FAPabcamab28246
Антитела Щипцы тонкиеFine Science Tools11251-20
Щипцы стандартныеFine Science Tools11023-10
Ледяная уксусная кислотаSigma-Aldrich537020
Машинка для стрижки волосWAHL8786-451A ARCO SE
HeparinRotexmedicaPZN 386234025.000 т.е./мл
Набор для прижигания при высоких температурахBovie18010-00
Image-iT FX Усилитель сигналаInvitrogenI36933Блокирующий раствор
Светло-зеленый SFWaldeck1B-211Трихромное окрашивание
Микрохирургический зажимFine Science Tools18055-04Micro-Serrefine - 4 мм
MINI TREK Коронарный дилатационный катетер 1,20 мм x 6 мм / Rapid ExchangeAbbott1012268-06U
Гидрат молибдатофосфорной кислотыMerck1.00532.0100Трихромное окрашивание
NaCl 0,9%B.BraunPZN 06063042 Art. Nr.: 3570160
ИглодержательFine Science Tools12075-14
НоваминсульфонРатиофармPZN 03530402метамизол
оранжевый GWaldeck1B-221Трихромное окрашивание
парафинаLeica биосистемыREF 39602004
PBS pH 7,4Gibco10010023
PFA 4%Электронная микроскопия Наука#157135S
раствор Ponceau SСерва Электрофорез33427Окрашивание трихрома
Первичный разбавитель антителDakoS3022
Prolong Gold Монтажный растворThermo FischerP36930Монтажное решение для иммунофлуоресцентно окрашенных предметных стекол
Сменный тонкий наконечникBovieH101
Резорцин-фуксин Weigert Waldeck2E-30Трихромное окрашивание
РимадилPfizer400684.00.00Карпрофен
НожницыFine Science Tools14028-10
Ножницы Vannas-styleFine Science Tools15000-03
Вторичный разбавитель антителDakoS0809
Быстродействующий клей MINIS 3x1gUHU45370Цианоакрилатная
направляющая решеткаTed Pella21057
SM22abcamab10135Антитела
SMAabcamab21027
Тарелка для окрашиванияTed Pella21075
Хирургический микроскопLeicaM651
Tabotamp фибриллярныйEthicon431962Рассасывающийся гемостат
Transpore Хирургическая лента3M1527-1
U-100 Инсулиновый шприцBD Медицинский324825
расширитель сосудовFine Science Tools18603-14
Vitro-CludLangenbrinck04-0001
Набор гематоксилина железа Weigerts Merck1.15973.0002Трихромное окрашивание
XyleneTh. Geyer3410
антител

Ссылки

  1. Kochanek, K. D., Xu, J., Murphy, S. L., Minino, A. M., Kung, H. C. Deaths: final data for 2009. Natl Vital Stat Rep. 60 (3), 1-116 (2011).
  2. Austin, G. E., Ratliff, N. B., Hollman, J., Tabei, S., Phillips, D. F. Intimal proliferation of smooth muscle cells as an explanation for recurrent coronary artery stenosis after percutaneous transluminal coronary angioplasty. J Am Coll Cardiol. 6 (2), 369-375 (1985).
  3. Greenwald, S. E., Berry, C. L. Improving vascular grafts: the importance of mechanical and haemodynamic properties. J Pathol. 190 (3), 292-299 (2000).
  4. Majesky, M. W., Schwartz, S. M. Smooth muscle diversity in arterial wound repair. Toxicol Pathol. 18 (4 Pt 1), 554-559 (1990).
  5. Owens, G. K. Regulation of differentiation of vascular smooth muscle cells. Physiol Rev. 75 (3), 487-517 (1995).
  6. Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiol Rev. 84 (3), 767-801 (2004).
  7. Kleemann, R., Zadelaar, S., Kooistra, T. Cytokines and atherosclerosis: a comprehensive review of studies in mice. Cardiovasc Res. 79 (3), 360-376 (2008).
  8. Karas, S. P., et al. Coronary intimal proliferation after balloon injury and stenting in swine: an animal model of restenosis. J Am Coll Cardiol. 20 (2), 467-474 (1992).
  9. Ip, J. H., et al. The role of platelets, thrombin and hyperplasia in restenosis after coronary angioplasty. J Am Coll Cardiol. 17 (6 Suppl B), 77B-88B (1991).
  10. Mason, R. G., Read, M. S. Some species differences in fibrinolysis and blood coagulation. J Biomed Mater Res. 5 (1), 121-128 (1971).
  11. Lafont, A., Faxon, D. Why do animal models of post-angioplasty restenosis sometimes poorly predict the outcome of clinical trials? Cardiovasc Res. 39 (1), 50-59 (1998).
  12. Matter, C. M., et al. Increased balloon-induced inflammation, proliferation, and neointima formation in apolipoprotein E (ApoE) knockout mice. Stroke. 37 (10), 2625-2632 (2006).
  13. Lindner, V., Fingerle, J., Reidy, M. A. Mouse model of arterial injury. Circ Res. 73 (5), 792-796 (1993).
  14. Simon, D. I., et al. Decreased neointimal formation in Mac-1(-/-) mice reveals a role for inflammation in vascular repair after angioplasty. J Clin Invest. 105 (3), 293-300 (2000).
  15. Sata, M., et al. A mouse model of vascular injury that induces rapid onset of medial cell apoptosis followed by reproducible neointimal hyperplasia. J Mol Cell Cardiol. 32 (11), 2097-2104 (2000).
  16. Moroi, M., et al. Interaction of genetic deficiency of endothelial nitric oxide, gender, and pregnancy in vascular response to injury in mice. J Clin Invest. 101 (6), 1225-1232 (1998).
  17. Painter, T. A. Myointimal hyperplasia: pathogenesis and implications. 2. Animal injury models and mechanical factors. Artif Organs. 15 (2), 103-118 (1991).
  18. Stubbendorff, M., et al. Inducing myointimal hyperplasia versus atherosclerosis in mice: an introduction of two valid models. J Vis Exp. (87), e51459(2014).
  19. Deuse, T., et al. Dichloroacetate prevents restenosis in preclinical animal models of vessel injury. Nature. 509 (7502), 641-644 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

SM22
На основе шар травмы побудить Myointimal гиперплазии в мыши брюшной аорты
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.