Живой клетки микроскопии флуоресцирования соблюдать основные процессы во время роста микробных клеток

Краткое содержание

Понимание функции основных процессов в бактерий является сложной задачей. Микроскопии флуоресцирования целевой объект специфического красителями может обеспечить понимание ключевых микробных клеток роста и клеточный цикл прогрессии. Здесь Agrobacterium tumefaciens используется как модель бактерии для выделения методы для живых клеток изображений для характеризации основных процессов.

Аннотация

Основные клеточные процессы такие как репликации ДНК и сегрегации, синтез белков, биосинтез клеточной стенки и деление клеток полагаются на функции белков, которые имеют важное значение для выживания бактерий. Серия красители для конкретных целевых объектов может использоваться как зонды для лучшего понимания этих процессов. Окрашивание с помощью липофильных красителей позволяет наблюдение мембранные структуры, Визуализация microdomains липидов и обнаружение шелесту мембраны. Использование флуоресцентных d-аминокислоты (FDAAs) для проверки сайтов биосинтез мукопептида может указывать на потенциальные дефекты в клеточной стенки биогенеза или патронирования рост клеток. Наконец пятен нуклеиновой кислоты могут указать возможные дефекты в ДНК хромосомы или репликация сегрегации. Цианиновые ДНК пятна лейбл живых клеток и подходят для покадровой микроскопии позволяет в реальном времени наблюдения nucleoid морфологии во время роста клеток. Протоколы для маркировки клеток может применяться для истощения мутанты белка для выявления дефектов в структуре мембраны, клеточной стенки биогенеза или хромосома сегрегации. Кроме того покадровой микроскопии может использоваться для мониторинга морфологические изменения как необходимый белок удаляется и может обеспечить дополнительное понимание функции протеина. Например истощение важнейших деление клеток белков приводит к филаментацию или ветвления, тогда как истощение белков рост клеток может привести к клетки, чтобы стать короче или круглее. Здесь протоколы для роста клеток, целевой объект специфического маркировки и time-lapse микроскопии предусмотрены возбудителя бактериального завод Agrobacterium tumefaciens. Вместе, целевой объект специфического красители и time-lapse микроскопии дать характеристику основных процессов в A. tumefaciens. Наконец протоколы могут быть легко изменены для зонда важнейшие процессы в других бактерий.

Введение

Прогрессии через бактериальный клеточный цикл требует координации многих процессов, включая мембраны и клеточной стенки биосинтез, репликации ДНК и сегрегации и деление клеток. Чтобы полностью понять сложность биологии бактериальной клетки, необходимым для изучения этих основных событий; Однако это нетривиальная задача, поскольку жизнеспособность клеток нарушается, когда mutagenized ключевых компонентов этих путей. В сочетании с целевыми красители микроскопия помощью эпифлуоресцентного представляет собой мощный подход к зонд эти основные процессы в wildtype и мутантных штаммов бактерий.

Мукопептида конкретных красители включают люминесцентные антибиотики (ванкомицин FL, bocillin-FL) и люминесцентные d-аминокислоты (например, 7-hydroxycoumarin-3-карбоновых кислот-3-амино d аланина, ХАДА; 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino-d аланина , НАДА; тетраметилродамина-3-амино d аланина; ТАДА). В грам-положительных бактерий использование сублетальные концентрации флуоресцентные антибиотик аналогов зонда сайты биосинтез мукопептида была эффективная стратегия раскрыть мукопептида вставки шаблоны^{1,2, 3,4}. Хотя флуоресцентные ванкомицин маркировки был использован для получения понимание мукопептида вставки шаблоны в⁵фиксированных грамотрицательных бактерий, внешней мембраны обычно обеспечивает проницаемость барьер, который предотвращает использование люминесцентные антибиотики, как зонд для биосинтез мукопептида в живых клетках. В отличие от коротких импульсов люминесцентные d-аминокислоты или d-аминокислоты с биортогональный функциональных групп ковалентно ярлык регионах недавние мукопептида вставки в широкий спектр живых бактериальных клеток^6,7. Шаблоны мукопептида вставки, которые были отмечены с синтетическими d-аминокислоты включают пунктата и межжелудочковой перегородки (кишечная палочка и Сенная палочка), полярных и межжелудочковой перегородки (Agrobacterium tumefaciens и Листерий), только межжелудочковой перегородки (Staphylococcus aureus) и верхушечно (Streptomyces venezuelae)^6,7. Эти наблюдения показывают, что бактерии проявляют разнообразных моделей биогенеза клеточной стенки, и что использование синтетических d-аминокислоты как зонды для изучения роста патронирования ценные стратегии многих бактерий.

Красители, которые ярлык бактериальной хромосомы включают связывателя конкретные мелкие канавки дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) (4,6-diamidino-2-phenylindole; DAPI) и высоким сродством цианиновые красители (зеленый и оранжевый; список материалов). DAPI пятнать фиксированных ячеек помогает в перечислении бактерий из⁸проб окружающей среды, тогда как DAPI пятнать живых клеток используется для обозначения бактериальных жизнеспособности⁹. В отличие от цианиновые красители, такие, как оранжевый и зеленый часто описывается как impermeant «мертвых» клеток мембрана пятна для перечисления нежизнеспособных клеток⁹. Замечательно когда эти реагенты используются для зонда морфология бактериальный nucleoid во время роста клеток, DAPI, оранжевый и зеленый были все показано мембраны permeant и способных маркировки живых клеток¹⁰. В клетках E. coli живут, DAPI окрашивание ДНК появляется диффузных благодаря auto флуоресценции от цитоплазмы и повторные воздействия ультрафиолетового (УФ) света DAPI-окрашенных клеток возмущает структуры nucleoid¹⁰. Окрашивание E. coli или B. subtilis с оранжевый показывает, что эта краска является мембрана permeant и обеспечивает длительное флуоресценции после привязки к ДНК в живых клетках без влияния на рост клеток, репликация ДНК или хромосомы сегрегации¹⁰ . Эти наблюдения предполагают, что цианиновые красители ДНК может использоваться для мониторинга морфология нуклеоидах во время роста клеток в многих бактерий.

Phospholipid-specific stryl красителей, таких как N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) фенил) hexatrienyl) пиридиния дибромид (4-64; см. перечень материалов) Катионный соединений и связывается преимущественно отрицательно заряженные фосфолипиды например cardiolipin и фосфатидилглицерина¹¹. Различные шаблоны наблюдаются при 4-64 используется для обозначения мембраны различных бактерий. В Escherichia coli4-64 обогащается в полюсах, в группах вдоль боковых стен и в конце pre-divisional сайтов отдела¹²клеток. Сенная палочка4-64 маркировки позволяет визуализацию липидов спирали¹³. В Agrobacterium tumefaciens4-64 этикетки внешней мембраны и наблюдается в шаблоне характерный «подкова», в котором полюса роста является лишен Этикетировочный^14,15. Эти наблюдения показывают, что эти бактерии проявляют распределения гетерогенных липидов вследствие наличия липидных доменов, которые способствуют сотовой асимметрии. Изменения в 4-64 маркировки шаблонов, таких как наличие диффузного маркировки, раковины или везикулы, кариолеммы или мембраны усадка может быть информативным в характеристике мутантов, которые влияют на распространение или биосинтеза липидов.

Помимо окрашивания клеток, определения функции белков, участвующих в основных процессах является необходимым. Характеристика основных белков технически сложным, потому что это не возможно удалить важно генов и изучить фенотипические последствия. Таким образом появились альтернативные подходы, которые разрушают белки. Например важно генов может поставить под контролем индуцибельной промоутер, вместо того, чтобы его родной промоутер. Индуцибельной промоутеров реагировать малых молекул, таких как; цинка¹⁶, изопропиловый β-d-1-тиогалактопиранозид (IPTG)^{17,18,19,20,21}, Арабиноза²²,²³vanillate^17,, Ксилоза²³, таким образом перестает транскрипции гена целевой и протеина интереса истощается при удалении индуктором. Альтернативные подходы для разрушающих эфироносных протеинов интереса включают синтетические riboswitches²⁴ , которые используют малые молекулы РНК взаимодействия мешают транскрипции генов-мишеней, ТРИФОСФАТЫ вмешательства^25,26 для блока транскрипции генов-мишеней, и протеин индуцибильный деградации^27,28 , который использует пептид теги для белков-мишеней для деградации ClpXP протеазы. Истощение штаммов обеспечивают лишь на короткое время для характеризации, прежде чем клетки теряют жизнеспособность, поэтому, микроскопических изображений с течением времени во время белковых истощения клеток мощный подход для определения характеристик. Действительно микроскопия живых бактериальных клеток позволило исследователям получить понимание основных биологических процессов, включая механизмы клеток форму обслуживания, секреции и дробления²⁹.

A. tumefaciens — возбудитель бактериальной растений³⁰ и естественный генетический инженер^31,32. Таким образом, механизмы, связанные с патогенностью, включая хост возбудитель взаимодействия^33,34,35, секрецию³⁶и принимающих преобразования^{30,31, 37} широко исследованы. Для разработки стратегий, которые предотвращают A. tumefaciens опосредованной болезни или расширить завод преобразования, процессов, необходимых для выживания A. tumefaciens необходимо лучше понимать. Использование целевых красителей и последние разработки стратегии истощения белка для A. tumefaciens¹⁸ предоставляет средства для изучения основных процессов.

Здесь предоставляются подробные протоколы для микроскопического анализа wildtype, мутанты и белка истощения штаммов A. tumefaciens . Первые два протокола описывается, как подготовить клетки и маркировать их с целевыми красители. Третий протокол содержит пошаговые инструкции для подготовки агарозы прокладки (рис. 1) и визуализации бактериальной клетки (Рисунок 2, Рисунок 3, , рис. 4). Эти протоколы также могут быть пригодны для других бактерий с дополнительных приспособлений для учета различных средств массовой информации условия, темпы роста, кислороде и клеточных структур.

Протокол

1. рост A. tumefaciens штаммов

1. Культивирования штаммов A. tumefaciens
   1. Используйте стерильные деревянные палки или пипетки подсказка для инокуляции 1 мл с одной колонии штамма желаемого ATGN роста средств массовой информации (см. перечень материалов для рецепта).
      Примечание: A. tumefaciens истощения штаммов, ATGN должен содержать 1 мм ИПТГ как индуктор для поддержания биосинтеза необходимый белок.
   2. Растут в A. tumefaciens штаммов на ночь в ATGN на 28 ° C с встряхивания на 225 об/мин.
   3. Измерение оптической плотности клетки на 600 Нм (₆₀₀OD) с помощью спектрофотометра. Разбавить клеточной культуры ОД₆₀₀ = ~0.2 и продолжать расти до₆₀₀ OD = ~0.6 достигается. Для истощения штаммов, продолжают расти с индуктором до₆₀₀ OD = ~0.6 достигается.
   4. Используйте wildtype и мутантных штаммов A. tumefaciens ОД₆₀₀ = ~0.6 для целевой объект специфического окрашивания или промежуток времени микроскопии (см. разделы 2 и 3.1). Для истощения штаммов промывают индуктором (см. раздел 1.2).
2. Удаление индуктор для характеризации A. tumefaciens белка истощения штаммов
   1. Пелле 1 мл экспоненциального культуры (OD₆₀₀ = ~0.4-0.6) центрифугированием в 7000 x g 5 мин в центрифугу Обои при комнатной температуре.
   2. Помыть, удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в свежих СМИ без индуктор и Пелле клетки, как описано выше (1.2.1). Вымойте клетки в общей сложности 3 раза в свежих СМИ.
   3. Ресуспензируйте окончательный Пелле в свежих СМИ и сконцентрировать клетки к ОД₆₀₀ = ~0.8 для немедленного пятнать с целевых конкретных красители (раздел 2 и на рисунке 4В-D) или замедленной микроскопии (раздел 3.2 и рис. 4A) . Кроме того, предварительно разрушающим клетки для желаемого количества времени путем выращивания клеток в СМИ без индуктором до окраски и обработки изображений клеток.

2. Целевой объект специфического окрашивания клеток A. tumefaciens

1. Флуоресцентный d амино кислоты клеточной стенки маркировки
   Примечание: FDAAs, нетоксичные флуоресцентные d-аминокислоты которые легко включены в мукопептида A. tumefaciens . Эта простая маркировка процедура зонды роста кучность в живые клетки⁶. Протоколы для синтеза четыре FDAAs являются доступны³⁸.
   1. Пелле 500 мкл экспоненциального культуры (OD₆₀₀ = ~0.4-0.6) центрифугированием в 7000 x g 5 мин в центрифугу обои. Ресуспензируйте Пелле клеток в 100 мкл свежих средств массовой информации.
   2. 5 мкл 5 мм FDAA для промывают и сосредоточены клетки и инкубировать в течение 2 минут в темноте.
      Примечание: Ограничение FDAA воздействия света. Время инкубации будет варьироваться в зависимости от темпов роста штамма. Как правило время инкубации должно быть 5-10% удвоения время⁶.
   3. Пелле клетки центрифугированием и мыть ячейки окатышей с-фосфатный буфер (PBS) три раза.
   4. Ресуспензируйте Пелле в ~ 50 мкл PBS.
      Примечание: Объем PBS для ресуспендирования может различаться в зависимости от размера гранул.
   5. Применить 0,8-1 мкл клеток агарозы pad и изображения с помощью эпифлуоресцентного сразу (см. разделы 3.1 и 3.2).
      1. Кроме того остановите дальнейшее включение метки, фиксируя клетки с ледяной 70% этиловом спирте. Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл ледяной 70% этанола и Инкубируйте 15 минут на льду.
      2. Собрать клетки центрифугированием и Ресуспензируйте в небольшом объеме PBS для изображений в более позднее время. Хранить клеточных суспензий на 4 ° C и изображения в течение 48 часов.
2. ДНК, окрашивание с DAPI или оранжевые пятна
   Примечание: Соблюдать ДНК структуры, клетки помечены DAPI или оранжевый (мертвые клетки пятно). Хотя классически описал как «мертвых клеток пятно», оранжевый permeant, фотостабилен и не влияет на рост клеток бактерий, позволяя жить клеточной ДНК изображений¹⁰. В A. tumefaciensоранжевый маркировки работает также в живых клетках и подходит для покадровой микроскопии (рис. 3). В отличие от ультрафиолетового (УФ) света воздействия необходимые для визуализации DAPI-окрашенных клеток имеет фототоксических (рис. 3) и таким образом DAPI окрашивания лучше всего подходит для окрашивания живой клетки для немедленной обработки изображений или окрашивание фиксированные клетки.
   1. DAPI окрашивания клеток
      1. Пелле 1 мл экспоненциального культуры (OD₆₀₀ = ~0.4-0.6) центрифугированием в 7000 x g 5 мин в центрифугу обои.
      2. При необходимости исправить клетки до окрашивания, Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл ледяной этанол 70%. Инкубируйте на льду на 10-15 минут собрать клетки центрифугированием, как описано в 2.2.1.1.
      3. Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл PBS, содержащие 1 мкл DAPI Стоковый раствор (1 мг/мл; см. Таблицу материалов). Осторожно перемешать, закупорить и инкубировать в течение 5 минут в темноте.
      4. Пелле клетки центрифугированием в 7000 x g 5 мин и Ресуспензируйте в 1 мл PBS для удаления избыточных DAPI. Вымыть клетки еще два раза и Ресуспензируйте Пелле в средствах массовой информации или 50 мкл PBS.
      5. Применить 0,8-1 мкл клеток агарозы pad и изображения с помощью эпифлуоресцентного немедленно. Смотрите в разделах 3.1 и 3.2.
         Примечание: Этот протокол не является оптимальным для покадровой микроскопии соблюдать хромосома динамика (рис. 3). Рассмотрите возможность использования оранжевой окраски как альтернатива (см. раздел 2.2.2).
   2. Оранжевой окраски живых клеток
   3. Пелле 1 мл экспоненциального культуры (OD₆₀₀ = ~0.4-0.6) центрифугированием в 7000 x g 5 мин в центрифугу обои. Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл PBS, содержащие 1 мкл оранжевый раствор (см. список материалов). Осторожно перемешать, закупорить и инкубировать в течение 5 мин в темноте.
   4. Пелле клетки центрифугированием и Ресуспензируйте в 1 мл PBS для удаления избыточных оранжевый. Вымыть клетки еще два раза и Ресуспензируйте гранулы в 50 мкл PBS.
   5. Применить 0,8-1 мкл клеток агарозы pad и изображения с помощью эпифлуоресцентного немедленно. Смотрите в разделах 3.1 и 3.2.
      Примечание: Этот протокол работает хорошо с живой клетки и подходит для покадровой микроскопии соблюдать хромосома динамика (рис. 3). Если это не удобно для изображения немедленно, клетки может быть исправлена в ледяной 70% этанола (см. раздел 2.2.1.2).
3. Мембрана маркировки
   Примечание: Липофильных стириловых Люминесцентную краску 4-64 широко используется для наблюдения за мембраны клеток бактерий. В отличие от многих бактерий 4-64 помечены A. tumefaciens клетки метки не равномерно, но довольно часто exhibit шаблон^14,«подкова»¹⁵. Удивительно полюса роста является почти лишена пятен, в то время как старый полюс обозначен интенсивно. Таким образом 4-64 позволяет визуализацию шаблонов роста клеток и мембранные структуры в A. tumefaciens.
   1. Добавить FM 4-64 в конечной концентрации 8 мкг/мл в 1 мл экспоненциальная фаза клеточной культуры и инкубации при комнатной температуре на 5 минут в темноте.
   2. Пелле помечены клетки центрифугированием в 7000 x g 5 минут в центрифугу обои и Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл ФСБ. Вымойте клетки в общей сложности три раза, чтобы удалить излишки красителя.
   3. Ресуспензируйте клетки в небольшом объеме PBS и пятно на площадку агарозы для изображения немедленно. (См. в разделах 3.1 и 3.2)
      Предупреждение: Клетки должны быть imaged немедленно соблюдать характерными узорами маркировки.

3. imaging A. tumefaciens клеток

1. Подготовка площадки агарозы
   Примечание: На рисунке 1 содержит последовательность изображений (Группа А) и схема (Группа B) типичный агарозы колодки, подготовленных для покадровой микроскопии. Агарозы колодки обычно готовы при необходимости.
   1. 3.1.1. Использование coverslip как гид и вырезать 22 x 22 мм квадратный лаборатории фильм (см. перечень материалов), запустив скальпелем по краям.
   2. Вырезать квадрат из центра в фильме лаборатории, оставляя ~ 2-5 мм границы в качестве прокладок для pad агарозы. Отказаться от центра выреза.
   3. Поместите прокладку фильм на стеклянное скольжение (75 мм x 25 мм), протирать аммиака и чистого спирта (см. перечень материалов) и тепла до тех пор, пока фильм подтаявший на стекло (верхнее изображение на рисунке 1A). Таять Лаборатория фильм, использовать край набор блок тепла до 70 ° C или слегка расплава на огне.
   4. Подготовка агарозы решение путем смешивания ~0.075 g агарозы (см. перечень материалов) в 5 мл СМИ в небольшой флакон. Тепла раствор в микроволновую печь с периодической закрученного смесь до полного растворения агарозы и решение ясно. Держите агарозы решение на 55-70 ° C и использовать для строительства нескольких агарозы прокладки в течение 48 часов.
   5. Пипетка СМИ, содержащих 1,2-1,5% агарозы в центр прокладки.
      Примечание: Объем средств массовой информации обычно составляет 50-60 мкл но будет зависеть от размера прокладок. Добавление средств массовой информации, в холодные слайд может вызвать агарозы закрепить слишком быстро, таким образом слайд должен храниться на теплой поверхности. Края блока тепла равным 70 ° C работает хорошо. Агарозы воды или буферизованное агарозы решения, такие как-фосфатный буфер (PBS) может использоваться вместо того, чтобы средства массовой информации, содержащие агарозы для приложений, в которых не требуется продолжение клеточный рост. Для визуализации истощения штаммов, индуктор можно представить или отсутствует в средствах массовой информации. Присутствие индуктор может использоваться как элемент управления, в то время как отсутствие индуктором покажет истощения фенотип.
   6. Место coverslip через прокладку, чтобы равномерно распределить агарозы.
   7. Поместите слайд на прохладном, ровную поверхность для закрепления для ~ 2 мин во избежание Пересушивание агарозы колодки, как это приведет к морщинистой поверхности на площадку агарозы и объединение суспензию клеток при применении к поверхности.
   8. Осторожно сдвиньте coverslip покинуть площадку агарозы.
      Предупреждение: Не спешите этот шаг. Агарозы pad может легко порваться и площадку неравномерным агарозы может затруднить изображений.
   9. Разрешить агарозы pad в воздух сухой для 1-2 мин при комнатной температуре до поверхности панели появляется сухой. С помощью скальпеля, удалите небольшую полоску агарозы для создания воздушного кармана (средняя изображение, Рисунок 1A); воздушный карман обычно ~ 2 x 7-10 мм и A. tumefaciens клетки, как правило, растут лучшие вблизи воздушный карман (Рисунок 1 c).
      Примечание: Для изображений фиксированных ячеек или в условиях, где рост не контролируется, воздушный карман не является необходимым.
   10. Пятно 0,8-1 мкл клеток на агарозы панель и крышка с новой coverslip. Осторожно поместите coverslip над верхней частью агарозы pad распространить ячейки по всей поверхности панели агарозы.
   11. Уплотнение края с помощью расплавленного VALAP coverslip (см. Таблицу материалы для рецепта; Рисунок 1A, нижнее изображение). Нарушение герметизации вдоль все края и углы coverslip может вызвать сушки агарозы pad, который приведет к дрейфующих клеток во время визуализации. Примечание: Герметизация coverslip необходима только для долгосрочной покадровой изображений.

Рисунок 1: подготовка площадки агарозы. (A) изображение последовательности подготовки протокола агарозы площадку. Изображение 1 — это слайд с уплотнением фильм лаборатории. В изображении 2 визуализируются агарозы pad и воздушный карман. Наконец изображение 3 показывает полный агарозы pad с клетки под coverglass и опечатаны с VALAP. (B) схема площадку агарозы для покадровой микроскопии предоставляется. Ключевые особенности агарозы pad помечены на схеме. (C) воздушный карман способствовало росту A. tumefaciens на агарозы колодки. Показываются изображения wildtype A. tumefaciens клеток, выращиваемых на площадку агарозы для 20 часов. Изображения были взяты на позициях более далекие от воздушного кармана. Расстояние от ближайшего края изображения в карман воздуха показано выше каждого изображения. Шкалы бар = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

2. Обработка изображений
   Примечание: Контраст дифференциальной помехи, Фазовый контраст и эпифлуоресцентного изображений производится с инвертированным микроскопом оснащены аппаратные автофокусировки, автоматизированный этап, стандартные фильтры, светодиодный источник света, 60 X нефти погружения цели (1,4 НС) для фазового контраста или дифференциальной помехи контраст (ОПК) и 1K электрон умножения заряд сочетании устройство (EMCCD) камеры. Микроскоп должны находиться в комнате с регулируемой температурой. Кроме того этап с подогревом или палата может использоваться для поддержания постоянной температуры во время визуализации.
   1. Микроскопия помощью эпифлуоресцентного
      Примечание: Для флуоресценции изображений живых клеток, необходимо ограничить количество изображений приобретений и оптимизировать время экспозиции, чтобы свести к минимуму Фотообесцвечивание и Фототоксичность. Для отображения каждой краски, рекомендуется найти время оптимальной экспозиции, которая обеспечивает достаточную флуоресценции обнаружения, но не приводит к Фотообесцвечивание или Фототоксичность. В 2-4 цифрывыдержек из 200 мс были использованы для всех изображений флуоресценции. Для покадровой последовательности, показанный на рисунке 3изображения были приобретены каждые 10 мин за 3 ч.
      1. Место погружения нефти на желаемой цели и место Перевернутый слайд слайд держатель на сцене. Используйте ручки фокусировки для приведения клетки в фокус.
      2. Приобрести изображений в фазе (или ДВС) и желаемый флуоресценции фильтр.
         Примечание: Максимальная возбуждения и выбросах волн для пятна, используемых на рисунке 2, рис. 3и рис. 4 заключаются в следующем: ХАДА (405/460), Нада (450/555), Тада (555/570), 4-64 (515/640), DAPI (360/460), оранжевый (547/570).
   2. Покадровой микроскопия
      Примечание: Во время промежуток времени микроскопии следующие функции являются контролируется компьютером: x, y и z положение, ставни и флуоресценции фильтры. Аппаратные авто фокус системы является оптимальным для поддержания внимания во время промежуток времени визуализации. В качестве альтернативы может использоваться петлю автоматический пистолет фокус на основе программного обеспечения.
      1. Место погружения нефти на желаемой цели и место Перевернутый слайд слайд держатель на сцене. Используйте ручки фокусировки для приведения клетки в фокус.
      2. Дополнительно: Приобрести несколько (x, y) позиции. Случайным образом выберите 10 поля клеток в непосредственной близости от воздушный карман агарозы колодки.
      3. Установка времени приобретения последовательности изображения в фазе или ДВС на желаемый временной интервал.
         Примечание: Для покадровой последовательности, показанный на рисунке 4, DIC изображения были приобретены с воздействием каждые 10 мин для 14 h 30 мс. При использовании флуоресценции изображений во время промежуток времени микроскопии, Отрегулируйте время интервала и воздействия приобретение для сведения к минимуму Фотообесцвечивание и Фототоксичность.

Результаты

Целевой объект специфического маркировки wildtype A. tumefaciens клетки
Для того чтобы проиллюстрировать что морфологии клеток не влияет мыть шаги или лечение с 1% ДМСО, (который используется для разбавления флуоресцентных красителей), клетки были образы непосредственно от культуры (рис. 2A, далеко левой панели), после мытья клетки Центрифугирование, как описано в 1.2 (рис. 2...

Обсуждение

Этот протокол содержит ряд процедур для расследования случаев A. tumefaciens wildtype, мутант и истощение штаммов. Стоит отметить, что все процедуры, перечисленные в разделе Протокол может быть легко адаптирована для других бактериальных штаммов с дополнительными изменениями для учета роста СМИ, температуры и темпы роста.

Использование целевых красителей является ценным инструментом для обеспечения подробную характеристику клеточного цикла событий в бактериальных клетках. Здесь мукопе...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
<сильные>бактериальные штаммы
<эм>Agrobacterium tumefaciens C58	ATCC	33970	Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Плазмида, необходимая для вирулентности Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol 123:255-264.
Agrobacterium tumefaciens C58Δ tetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-ctrA Δ ctrA			Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Введение mini-Tn7 в искусственный сайт attTn7 позволяет подавлять главный регулятор CtrA в фитопатогене Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025.
Название<	strong>Company	Номер в каталоге	>Комментарии
Компоненты носителя
ATGN Minimal Medium			К 1 л стерилизованной воды добавьте 50 мл 20X Buffer, 50 мл 20X Salts, 12,5 мл 40% глюкозы. Для тарелок добавьте 15 г Bacto Agar в 1 л воды и автоклав. Остудить до 55 градусов; C и добавьте 50 мл 20X Buffer, 50 мл 20X Salts, 12,5 мл 40% глюкозы.
20X AT Buffer			Добавьте 214 г/л KH2PO4 в воду и отрегулируйте pH до 7,0 с помощью гидроксида натрия. Автоклав.
NaOH	Fisher BioReagents	BP359
KH2PO4	Fisher Chemical	P288
20X AT соли			Добавить 40 г/л (NH4)2SO4, 3,2 г/л MgSO4&бычок; 7H2O, 0,2 г/л CaCl2• 2H2O, и 0,024 г/л MnSO4• H2O в воду. Автоклав.
(NH4)2SO4	Fisher Chemical	A701
MgSO4• 7H2O	Биореагенты Фишера	BP213
CaCl2• 2H2O	Fisher BioReagents	BP510
MnSO4• H2O	Fisher Chemical	M114
Glucose	Fisher Chemical	D16	Приготовьте 40% бульона в воде. Фильтр простерилизовать.
Bacto Agar	Fisher BioReagents	BP1423	Добавьте 15 г на 1 л воды при приготовлении тарелок.
Name<	strong>Company	Номер в каталоге	Комментарии
Дополнительные добавки для средыKanamycin
	GoldBio	K-120	Готовить в виде исходного раствора 100 мг/мл в воде и стерилизовать фильтром. Использование при конечной концентрации 200 &микро; г/мл.
IPTG	GoldBio	I2481C5	Готовить в виде 1 М стокового раствора в воде и фильтре стерилизовать. Используйте в конечной концентрации 1 мМ по мере необходимости для индукции.
Name<	strong>Company	Номер в каталоге	Комментарии
Материалы для микроскопии
Предметные стекла для микроскопа	Fisherbrand	12-550D	25 X 75 X 1,0 мм. Очистите с помощью очистителя стекол Sparkle.
Чехол для микроскопа	Fisherbrand	12-541-B	22 X 22 мм. No 1,5. Очистите с помощью средства для мытья стекол Sparkle.
Sparkle Glass Cleaner	Home Depot	203261385	не содержит аммиака и спирта.
Ultra Pure Agarose	Invitrogen	16500-100	Добавить в воду, PBS или среду до конечной концентрации 1 - 1,5%. Растопите в микроволновой печи и поместите на 70 С
PBS	биореагенты Fisher BP399500		10Х раствор, разбавленный до 1Х стерильной водой.
Парапленка	Bemis	PM-999	Лабораторная пленка, используемая в качестве прокладки при приготовлении агарозной прокладки.
ВАЛАП			Добавьте равные массы ланолина, парафинового воска и вазелина в коническую трубку. Тепловая трубка в 70 градусов; C сухим, шариком или на водяной бане растаять и перемешать. Наносите VALAP, пока он еще расплавлен.
Ланолиновое масло	SAAQIN	SQ-LAB-R1
Petroleum Jelly	Target Corp.	06-17644
Парафиновый воск	крафтовых свечей	263012
Название	Company	Номер в каталоге	Комментарии
>Красители для конкретных целей>
DMSO	Биореагенты	Fisher BP231-1	Используйте для разбавления стоковых растворов красителей по мере необходимости.
FDAA (NADA, HADA, TADA)FDAA			могут быть синтезированы или приобретены по соглашению с Майком Ван Ньювензе (Университет Индианы). Приготовьте 100 мМ стоковый раствор в ДМСО. Используйте в конечной концентрации 5 мМ.
DAPI	ThermoFisher Scientific	62247	Приготовьте 1 мг/мл стокового раствора в ДМСО. Использование при конечной концентрации 1 & микро; г/мл.
SYTOX Краситель оранжевых нуклеиновых кислот	Invitrogen	S11368	Стоковая концентрация составляет 5 мМ в ДМСО. Использовать при конечной концентрации 5 мкМ.
FM4-64	Invitrogen	T3166	Приготовьте стоковый раствор 8 мг/мл в ДМСО. Использование при конечной концентрации 8 &микро; г/мл.
Name	Company	Номер в каталоге	Комментарии
>Оборудование
Сухая ванна	Sheldon Manufacturing, Inc.	52120-200
Металлические термобусины	Lab Armor	42370-002
Эпифлуоресцентный микроскоп, оснащенный камерой EMCDD Nikon			Eclipse TiE, оснащенной камерой QImaging Rolera em-c2 1K электронно-умножительным устройством зарядовой связи (EMCCD).