Методическая статья

Улучшенная протокол для иммунопреципитации Chromatin от мыши скелетных мышц

DOI:

10.3791/56504

⸱

6 ноября 2017 г.

 ,  ,  , 
1Department of Functional Genomics and Cancer, Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представлен Роман протокол для подготовки хроматина от взрослой мыши скелетных мышц, адаптированы для изучения регуляции генов в мышечных волокон иммунопреципитации chromatin.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы Опишите эффективной и воспроизводимые протокол для подготовки хроматина от взрослой мыши скелетных мышц, физически устойчивостью тканей с высоким содержанием структурных белков. Расчлененных конечностей мышцы от взрослых мышей физически подорван механической гомогенизации или сочетание мясорубки и douncing, в гипотонический буфера до фиксации формальдегида lysate клетки. Фиксированная ядер очищаются путем дальнейшего циклов механической гомогенизации или douncing и последовательного фильтрации для удаления мусора ячейки. Очищенные ядра может быть sonicated немедленно или на более позднем этапе после замораживания. Могут эффективно sonicated хроматина и подходит для экспериментов иммунопреципитации chromatin, как иллюстрируется профили получается факторов транскрипции, РНК-полимераза II и ковалентный гистона модификаций. События привязки, с помощью хроматина, подготовленный этот протокол являются преимущественно те, кто принимает место в ядер мышечных волокон, несмотря на присутствие хроматина от других связанных волоконно спутника и эндотелиальных клеток. Этот протокол таким образом приспособлен для изучения гена регулирование в скелетных мышцах взрослых мыши.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Иммунопреципитации Chromatin (обломока) в сочетании с количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) и высокая производительность виртуализации (чип seq) стали методы выбора для изучения транскрипции и эпигенетическую регуляцию экспрессии генов в различных тканях и типов клеток1. Эта техника позволяет генома общесистемной профилирования ковалентных chromatin изменения, гистонов вариант размещение и транскрипционным фактором привязки2,3.

Хотя выполнение чип от культивируемых клеток является хорошо организованной, чип от тканей млекопитающих остается более сложным. Подготовка chromatin чипа включает в себя несколько важных шагов, которые должны быть оптимизированы для каждого типа ткани и клетки. Хроматин могут быть приготовлены из клеточных лизатов культивируемых клеток или следующие очистки их ядер. В случае тканей млекопитающих эффективной лизиса, формальдегид фиксации и очистки ядер важны для того, чтобы обеспечить оптимальное восстановление хроматина. Кроме того выбор ли исправить ядер до или после их очистки должен быть экспериментально определены. Несмотря на эти препятствия чип успешно выполнена из ткани, такие как печень, яичка или мозга4,5,6. В случае скелетных мышц нарушение такого физически устойчивостью ткани, которая обладает высоким содержанием структурных белков и изоляции его ядер является особенно сложным. Учитывая эту специфику, протоколы, оптимизированный для других тканей не дают удовлетворительных результатов для скелетных мышц.

Здесь мы описываем протокол изолировать хроматина чип класса от мыши скелетной мышечной ткани, которая включает в себя физически нарушить ткани, формальдегид фиксации, а затем изоляции ядер и sonication. Выполняя чип ПЦР и чип seq для различных факторов транскрипции, РНК-полимераза II и ковалентный гистона изменения7была продемонстрирована эффективность этого метода подготовить хроматина, подходящую для чип из этой ткани.

Этот новый метод гораздо быстрее, чем сообщалось ранее протокол8 , включающий давно коллагеназы пищеварение шаги во время которого, изменения в геномной локализация транскрипционных факторов и изменения в экспрессии генов может занять место. Быстрота, с которой ядер изолированных и фиксированной делает метод, описанный здесь особенно привлекательным для подготовки хроматина, что более точно отражает состояние родной геномной размещение. Кроме того хотя другие методы для извлечения изоляции или белка хроматина из мышечной ткани были описаны8,9,10 и используется для чип ПЦР экспериментов на отдельных генов, не чип seq данные поступили с их помощью. Метод, сообщили здесь подходит для транскрипционного фактора и гистона изменения чип seq и поэтому должны быть также пригодны для 3 / 4C или МКХ хроматина конформации захвата приложений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

мышей держали в соответствии с институциональной руководящие принципы, касающиеся ухода и использования лабораторных животных и национальные руководящие принципы ухода животных (Европейская Комиссия Директива 86/609/ЦВЕ; Французский декрет no.87-848). Все процедуры были утверждены Комитетом французской национальной этики.

1. изоляция мышечной ткани

  1. жертву один взрослый 6 к 8-недельных мышь шейки матки дислокации. Sterlise конечности, промыв его с 70% этанола и вскрыть задних конечностей мышцы (икроножной мышцы, Tibialis передние, четырехглавой) с помощью тонкой точке ножницы и щипцами.
    Примечание: Одна мышь должна принести около 500 мг ткани.
  2. Фарш мышц в 2 мл пробирки, содержащие 1 мл ледяной гипотонический буфера для однородных подготовки малых (< 2-3 мм 3) куски с помощью тонкой ножницы и оставить трубки, пожимая на скамейке Топ агитатор на 4 ° C на 5-10 мин

2. Лизис ткани

Примечание: пожалуйста, обратитесь к таблице 1 для всех буфера композиций.

  1. Передать 14 мл раунд дно огневки и Ресуспензируйте в 5 мл холодной гипотонический буфера (ЭДТА бесплатно ингибитор протеазы коктейль и PMSF).
    1. Homogenise фарш из мышечной ткани, используя свободные dounce (20-30 ударов в течение 3 мин) или механических тканей гомогенизатор для 15-30 s в туре вниз 14 мл пробирок.
      Примечание: Эффективность лизис можно оценить на данном этапе по световой микроскопии, и при необходимости могут выполняться дополнительные нарушения.
  2. Передачи огневки для 15 мл пробирок и заполнить объем до 10 мл, с использованием холодного гипотонический буфера. Исправить огневки, как описано ниже, прежде чем приступить к следующему мыши.

3. Фиксация

  1. Добавить формальдегида в конечной концентрации 1% и встряхнуть для 10 мин при комнатной температуре.
  2. Добавить Глицин в конечной концентрации 0,125 м в каждой тюбике остановить фиксации и встряхнуть для 5-10 мин при комнатной температуре.

4. Подготовка ядер

Примечание: пожалуйста, обратитесь к таблице 1 для всех буфера композиций.

  1. Homogenise, фиксированная lysate используя свободные dounce (5-10 ударов).
    1. Передачи 15 мл трубки и центрифуги на 1000 x g 5 минут при температуре 4 ° C для получения ядер и сотовой мусора.
  2. Удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в свежих 5 мл гипотонический буфера. Фильтр lysate через стрейнер ячейки 70 мкм в 50 мл трубки. Повторно фильтр фильтрата через стрейнер клеток 40 µm.
  3. Передачи фильтрат 15 мл трубки и центрифуги на 1000 x g 5 минут при 4 ° C для получения ядерных Пелле.
    Примечание: На данном этапе, ядра могут быть немедленно sonicated, или привязать заморожены как сухих гранул в жидком азоте и температуре -80 ° C.

5. Sonication

  1. оценить объем ядерной Пелле (около 50 мкл для гомогенизации как механических, так и dounce) и Ресуспензируйте ее в буфер sonication до 3-4 раза объема Упакованные ядерной и sonicate для 10-15 мин при температуре 4 ° C с помощью sonicator .
    Примечание: Хроматина могут анализировать сразу же, как описано ниже (6) или замороженные и храниться на -80 ° C.

6. Оценка размера фрагмента Chromatin, после Sonication

Примечание: пожалуйста, обратитесь к таблице 1 для всех буфера композиций.

  1. Де crosslink, взять 30 мкл хроматина в пробирке 1,5 мл и 20 мкл 5 М NaCl. Полный объем 500 мкл и инкубировать на 65 ° C ночь и.
    1. Следующий день, проводить лечение с 1 мкл протеиназы K (20 мг/мл бульона), 10 мкл 2 М трис рН 6,8 и 10 мкл ЭДТА 0,5 М за 1 ч при 42 ° C. выполнить фенол хлороформ/хлороформ добычи и осадка ДНК с 1 объем натрия используется e (3 М) и 2 тома 100% этанола для одного ч-80 ° c, или на ночь при -20 ° с.
  2. Пелле ДНК центрифугированием на 13500 g x 15 мин Decant супернатант и помыть лепешка с тщательно холодный 70% этанола и центрифуги снова для 5 минут Decant супернатант и просушите гранулы.
  3. Ресуспензируйте гранулы в первоначального объема (30 мкл) TE буфера. Измерьте концентрации ДНК в спектрофотометре абсорбция 260 Нм/280 Нм. Пипетка 500-1000 нг ДНК вместе с ДНК размер лестницы на отдельные полосы 1,5% геля агарозы и провести электрофорез оценить размер фрагмента хроматина.
    Примечание: Размер фрагмента должен быть между 200-500 пар оснований и не должно быть без обнаружению высокой молекулярной массой фрагментов, соответствующий для или плохо нефрагментированные ДНК. При необходимости, хроматина решение (шаг 5) могут быть повторно sonicated на более длительное время и затем повторно проанализированы, как описано выше, до тех пор, пока оптимальный размер получается.

7. Иммунопреципитации Chromatin (обломока)

Примечание: пожалуйста, обратитесь к таблице 1 для всех буфера композиций.

  1. Блок протеина G sepharose бусины aliquoting 1 мл 50% раствора в этиловом спирте. Пелле бусины центрифугированием на 400 x г за 1 мин в настольная центрифуга и мыть с 1 мл раствора TE буфера центрифуги на 400 x g и повторить Вашингтон
    1. После второй центрифугирования, вновь приостановить в 1 мл буфера для разведения чип с 25 мкл BSA (акций 20 мг/мл) и 20 мкл дрожжей tRNA (запасов 10 мг/мл). Блокировать Бусины для по крайней мере 2 h до использования путем вращения (40-60 мин) на 4 ° C.
    2. Разбавить 50 мкг хроматина (шаг 5) 8-10 раз с использованием буфера для разведения чип. Добавьте 50 мкл суспензии заблокированных шарик и проинкубируйте 2 ч, вращающиеся (40-60 об/мин) на 4 ° C. центрифуги на 400 x g при 4 ° C для получения предварительно отобранных хроматина и перенести его на свежий трубки.
  2. Для иммунопреципитации, добавьте соответствующее количество первичных антител (например, 1-2 мкг на 10 мкг хроматина) и инкубировать на ночь с вращением на 4 ° C.
    Примечание: Оптимальное количество антител может быть рекомендован поставщиком или можно определить эмпирически, выполняя чип ПЦР с различных количеств антител, пока наблюдается оптимальное обогащение. Также белок G sepharose могут быть заменены sepharose белок в зависимости от подтипа антитела используются.
  3. Добавить заблокированный бусины следующий день и инкубировать 1 час с вращения (40-60 мин) на 4 ° C. центрифуги на 400 x g для 20-30 s Пелле бусы, удалить супернатант и начать обломок стирает.
  4. Чип моет: выполняют следующие моет буферы: один раз с низкой соли буфера и затем дважды с высоким соли буфера, дважды с LiCl буфера и наконец дважды с буфером TE.
    1. Выполнять каждый мыть за 10 мин с вращением (40-60 об/мин) при 4 ° C и Пелле бусы между каждой стирки центрифугированием на 400 x g для 20-30 s в центрифуге настольное.
  5. Для элюции, удалите последние мыть и Ресуспензируйте бусины в 250 мкл Элюирующий буфер (свежеприготовленные) для 15 мин при комнатной температуре при встряхивании.
  6. Центрифуги 400 x g и собирать элюата в свежий трубку. Выполните этот шаг дважды, а затем де crosslink элюата ночь с 20 мкл NaCl 5 М и 1 мкл РНКазы A (10 мг/мл), лечить с протеиназы K и фенол хлороформ/хлороформ extrдействовать как в шаге 6.
  7. Ресуспензируйте в 50 мкл буфера TE и использовать аликвоты для чип ПЦР согласно стандартных протоколов 15 для проверки качества чипа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы изолировать ядер, мы провели механической гомогенизации расчлененных и фарш мышечной ткани для 15 или 45 s, в 18000 и 22000 об/мин (см. Таблицу материалы). Во всех условиях ядра могут быть отделены от мусора ткани, но выход был оптимальным, с помощью низкой скорости (рис. 1A-B). Ядра могут быть также подготовлены douncing для 3-5 мин (рис. 1Aи данные не показаны), но механической гомогениза...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем Роман протокол для подготовки хроматина от взрослой мыши скелетных мышц и показать, что это хроматина подходит для чип экспериментов, которые обнаружить связывания фактор транскрипции и ковалентный гистона изменения в ядер мышечных волокон. Этот протокол включает в себя несколько важных этапов. Во-первых, нарушение ткани, которая может быть выполнена либо путем dounce механической резки. Механической резки быстрее и более воспроизводимые и поэтому является методом выбора. Тем не менее если нет подходящ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим всех сотрудников объекта последовательности IGBMC высокой пропускной способности, членом консорциума «Франция Génomique» (ANR10-INBS-09-08) и все IGBMC общих услуг в частности сотрудников животных фонда IGBMC. Эта работа была поддержана грантов из CNRS, INSERM, AFM, le Национальная лига против рака, французский государственный фонд через НРУ по программе Investissements будущее помечены АНР-10-IDEX-0002-02, Labex нар INRT-10-IDEX-0001-02 и ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. Спонсоры имел никакой роли в дизайн исследования, сбор данных и анализ, решение опубликовать или подготовка рукописи. Le Национальная лига против рака и ANR-AR2GR-16-CE11-009-01, и V.U S.J была поддержана Ministère де образования et de la исследований. Идентификатор является «équipe labellisée» le Национальная лига против рака.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
T 25 digital ULTRA-TURRAXT 18 ULTRA-TURRAX0009022800
PMSFSIGMA-ALDRICH CHIMIESARL P7626-25G
Коктейль ингибиторов протеазы-ЭДТА СвободныйRoche Диагностика11873580001
Белок G Сефарозные шарикиSIGMA-ALDRICH CHIMIEP-3296
Протеиназа KSIGMA-ALDRICH CHIMIEP-2308
Клеточные фильтры 70 мкмCorning BV431751
Клеточные сетчатые фильтры 40 мкмCorning BV352340
Формальдегид ЭМ маркиEuromedex15710-S Рназа
А ФишераНаучный12091039
Фенол:Хлороформ:Изоамиловый спирт 25:24:1SIGMA-ALDRICH CHIMIEP3803
BSASIGMA-ALDRICH CHIMIEB4287-25G
тРНК ДРОЖЖЕЙSIGMA-ALDRICH CHIMIER5636
Гликоген BlueAMIBIONAM9516
Pol II ChIP АнтителоSanta CruzSC-9001
H3K27ac ChIP АнтителоАктивный мотив39133
Tead4 ChIP АнтителоAviva Systems Biology(ARP38276_P050)
IGEPALSIGMA-ALDRICH CHIMIEI-3021
E220 Сфокусированный ультразвуковойCovaris E220
NameCompanyНомер в каталогеКомментарии
Дополнительные позиции
Ножницы
Loose Dounce
15 мл и 50 мл Falcon Tubes
14 мл Круглое дно Tubes
1,5 мл и 2 мл Eppendorf Tubes
70 μ м и 40 μ Сетчатые фильтры для клеток m (Corning)
аппарат

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
  2. Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
  3. Wade, J. T. Mapping Transcription Regulatory Networks with ChIP-seq and RNA-seq. Adv Exp Med Biol. 883, 119-134 (2015).
  4. Alpern, D., et al. TAF4, a subunit of transcription factor II D, directs promoter occupancy of nuclear receptor HNF4A during post-natal hepatocyte differentiation. Elife. 3, e03613(2014).
  5. Martianov, I., et al. Cell-specific occupancy of an extended repertoire of CREM and CREB binding loci in male germ cells. BMC Genomics. 11, 530(2010).
  6. Achour, M., et al. Neuronal identity genes regulated by super-enhancers are preferentially down-regulated in the striatum of Huntington's disease mice. Hum Mol Genet. 24 (12), 3481-3496 (2015).
  7. Joshi, S., et al. TEAD transcription factors are required for normal primary myoblast differentiation in vitro and muscle regeneration in vivo. PLoS Genet. 13 (2), e1006600(2017).
  8. Ohkawa, Y., Mallappa, C., Dacwag-Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. Myogenesis: Methods and protocols. DiMario, J. 798, Springer Science+Business Media LLC. 517-531 (2012).
  9. Dimauro, I., Pearson, T., Caporossi, D., Jackson, M. J. A simple protocol for the subcellular fractionation of skeletal muscle cells and tissue. BMC Res Notes. 5, 513(2012).
  10. Thomas, J. L., et al. PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression. Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).
  11. Kuo, T., et al. Genome-wide analysis of glucocorticoid receptor-binding sites in myotubes identifies gene networks modulating insulin signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (28), 11160-11165 (2012).
  12. Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
  13. Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation. Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).
  14. Cowling, B. S., et al. Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy. J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).
  15. Thermo Fisher Scientific. ChIP Analysis. , Available from: https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

ChIP

Похожие статьи