Эффективной и простой метод для установления линии Т-клеток у больных с хроническим активный вирус Эпштейна - Барр инфекции и НК

Краткое содержание

С высокой эффективностью, небольшое количество периферической крови и низкодозированные Ил-2 был разработан простой метод для получения клоны Т-клеток и NK CAEBV больных.

Аннотация

Ряд методов были описаны установить НК/T клеточных линий от пациентов с лимфомой или лимфопролиферативных синдромом. Эти методы подачи клетки, очищенный НК или T клетки как 10 мл крови или высок дозы Ил-2. Это исследование представляет новый метод с мощной и простой стратегии учредить Т-клеток и NK линии путем культивирования периферической крови мононуклеаров (КСДОР) с добавлением рекомбинантный человеческий Ил-2 (rhIL-2) и использует как маленькое как 2 мл цельной крови. Клетки могут размножаться быстро в две недели и поддерживаться более 3 месяцев. С помощью этого метода были созданы 7 НК или Т-клеток линии с высокий уровень успеха. Этот метод является простым, надежным и применимым к созданию линии клетки от больше случаев CAEBV или НК/Т-клеточной лимфомы.

Введение

Вирус Эпштейна - Барр (EBV) повсеместно и заражает не только B-клетки, но также T и природных убийца (НК) клетки, что приводит ряд связанных EBV НК/T лимфопролиферативных заболеваний (LPD) и лимфома/лейкоз, например EBV-связанные гемофагоцитный лимфогистиоцитоз, hydroa vacciniforme как лимфома, экстранодальных НК/Т-клеточной лимфомы, носовой тип и агрессивным NK клеток лейкемии^1,2,3. Среди них заболевание тяжелой хронической активных EBV (SCAEBV), который является инцидент, главным образом в Восточной Азии, и которая теперь считается LPD, вызванные клоновых расширения EBV-инфицированных T или NK клеток^{4,5,6, 7}, но без очевидной иммунодефицита присутствует в инфекционный мононуклеоз (IM)-как симптомы, включая лихорадку, гепатоспленомегалия, лимфаденопатия и дисфункции печени постоянно или периодически, а также высокой EBV-ДНК загрузки в периферической крови^8,9. У пациентов с CAEBV плохой прогноз^10,11и его патогенез и роль EBV является неясным. Таким образом, мобильных линий, полученных от связанных EBV НК/T лимфопролиферативных заболеваний и лимфом очень полезны как ячейки модели для разъяснения механизма EBV индуцированной НК или Т-клеток распространения и его отношения с высоким уровнем заболеваемости лейкемией или лимфомы.

На сегодняшний день, были созданы несколько клеточных линий с различными методами^{12,13,14,,1516}. Человеческой линии клеток НК, НК-YS, был создан от НК лимфома/лейкоз, совместного культивирования с линией стромальные клетки мыши как фидер и в присутствии rhIL-2 в концентрации 20U за¹⁵мл. KAI3 был другой NK клеток линии от больных с тяжелой комаров аллергии или SCAEBV с аутологичной лимфобластоидных клеток линии (LCL), клетки B, преобразованная EBV, как клетки фидера и добавление rhIL-2¹⁶100У/мл. SNK6 и SNT8 были получены от опухоли тканей носа НК/T клеток больных лимфомами, добавив высок дозы rhIL-2 (700U/мл)¹². С подобную технику SNK-1 клетка был от CAEBV больных, культивированный от КСДОР, удалив Т-клеток и добавив 700U/мл rhIL-2^13,17. SNT13 и SNT15 были созданы путем удаления CD4 + и CD8 + клетки¹⁸. Пока другие Т-клеток и NK клеточных линий от EBV-НК/T LPD пациентов были разработаны с этот метод¹⁹.

Недостатки существующих методов, упомянутых выше включают занятости клетки фидера, требование высок дозы IL-2, использования как 10 мл цельной крови или очистки НК/Т-клеток, что является весьма сложной в клинике из-за необходимость проверки, какие типы мобильных что EBV латентно заражает перед началом к культуре. Как CAEBV в основном происходит в детей в Азии, 10 мл крови не является легко приобрести во всех регионах. В этом исследовании мы разработали новый простой метод с высокий уровень успеха установить НК и/или Т-клеток линии путем культивирования КСДОР от CAEBV больных с использованием низких доз rhIL2 и объемом 2 мл цельной крови без клетки фидера. Результаты этого метода доказали свою высокую эффективность и экономия времени.

Протокол

Это исследование был одобрен Комитетом по этике Института генетики и биологии развития, Китайская академия наук, и протокол следует институциональных руководящих принципов для благополучия человека.

Примечание: На рисунке 1 приведена схема рабочего процесса.

1. изоляция КСДОР от больных CAEBV

1. Очистить первичной КСДОР от 2 мл цельной крови больных CAEBV градиент (например, Ficoll доска) центрифугирования следуя инструкциям производителя. Кроме того оттепель криоконсервированных КСДОР из жидкого азота с RPMI 1640 среднего.
2. Добавить 2 мкл Трипановый синий (0,4%) 18 мкл суспензии клеток, ждать 3 мин запятнать клетки, передачи подвеска к плите счетчиков клеток и измерения концентрации клеток и жизнеспособности с счетчиком автоматизированной клеток.
3. Готовят суспензию клеток на 2-3 × 10⁶ клеток/мл дополнена полной RPMI 1640 питательной среды, содержащие 20% сыворотки крови человека (инактивированная на 56 ° C тепла), 2 мм L-глютамином, плотности и антибиотики (100 мкг/мл стрептомицин, пенициллин 100 ед/мл). 1 мл суспензии КСДОР за хорошо семян в 24-ну клетки культуры пластин.
4. Добавьте 150 U rhIL-2 на хорошо.
5. Поместите пластины для культуры в 5% CO₂ инкубатора 37 ° c.
6. На 2 день наблюдать морфологию клеток под микроскопом (200 крат); клетки находятся в хорошем состоянии, когда они яркие и круглые.

2. расширение нумерация жизнеспособных клеток и клеток

1. Наблюдать за морфологии клеток под микроскопом (увеличение Х 200) и контролировать состояние клеточного роста, Нумерация ячеек перед изменением средних: 2 мкл Трипановый синий (0,4%), до 18 мкл суспензии клеток и рассчитать концентрации клеток (см. 1.2, Рисунок 2).
2. Отменить 500 мкл среды в пластине 24-Ну и добавить 500 мкл свежие полной питательной среды. Добавьте 150U rhIL-2 на хорошо.
3. Изменения среды дважды в неделю, как в шаге 2.2.
4. Нарисуйте кривую роста клеток (рис. 3).
5. Когда концентрация жизнеспособных клеток превышает 5 × 106/мл, делят клеток на новые скважины в концентрации 1-2 × 10⁶ клеток/мл в каждую лунку. Этот процесс занимает 2-4 недели.

3. клетки фенотипирование подачей Cytometry

1. Когда клетки расширили, соберите 1 × 10⁶ клеток для определения фенотипов клеточных линий. Центрифуга клетки на 240 x g 5 мин при комнатной температуре (НК/T-клетки будет выпадать в осадок в нижней части трубки).
2. Отбросить супернатанта, мыть осадков, добавляя 7 мл PBS. Центрифуги для 5 мин на 240 x g при комнатной температуре. Повторите один раз.
3. Добавить 200 мкл человеческой сыворотки в каждую пробирку, хорошо перемешать и проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре.
4. Центрифуга клетки на 240 x g 5 мин при комнатной температуре. Отменить супернатант и вновь приостановить клетки на 1 × 106/мл с холодной PBSA (PBS+0.2%BSA). Разделите ячейки 5 трубок, каждая трубка, содержащая 2 × 10⁵ клеток.
5. Центрифуга клетки на 240 x g 5 мин при 4 ° C. Отменить супернатант и вновь приостановить клетки с PBSA буфер или PBSA, содержащие 10 мкл PE (или PE-Cy7) и 10 мкл FITC помечены антител к пятно рецепторы клеток T или NK клеток на льду, как указано на рисунке 4. Клетки, приостановлена с буфером PBSA используются в качестве отрицательного контроля.
6. Инкубируйте клетки с антител для 20-30 мин на льду в темноте.
7. Вымыть клетки дважды с холодной PBSA, вновь приостановить клетки с 300 мкл холодной PBSA.
8. Анализ фенотипа клетки с проточный цитометр.
   1. Настройка потока цитометр в состоянии «Создать таблицу». Создан экспериментальный шаблон с точкой сюжета, который отображает вперед точечной (FSC) против стороны точечной (SSC).
   2. Загрузить изотипа управления трубка для оптимизации FSC и SSC напряжений и оптимизировать FSC пороговое значение для ликвидации мусора без мешать с популяции клеток интерес. Удалите все параметры, кроме FSC, ККК, FITC, PE и пе-Cy7.
   3. Выполнение компенсации с использованием изотипа управления и один положительный контроль в каждой группе Анализ 2-цвета.
   4. Загрузить образцы и создать HLA-DR VS CD19, CD4 VS CD8, CD56 VS CD16 и CD3 VS CD16 точка участки, показаны различные популяция клеток.
      Примечание: КСДОР были использованы для выполнения компенсации с помощью отрицательных/изотипа управления и один положительный. 2-цветные иммунофлюоресценции с проточный цитометр обычно использовался для анализа экспрессии поверхностных маркеров. Включены следующие антитела: анти HLA-DR, анти CD4, конъюгированных с флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC), анти CD8, анти CD56 анти CD16, CD3, конъюгированных с фикоэритрин (PE) и анти CD19, конъюгированных с PE-Cy7.

4. расширение и криоконсервации клеток НК/T

1. Изменение среднего по завершении анализ фенотипа клетки. Тщательно удалить половину супернатант и не прикасайтесь клетки в нижней части пластины. Добавьте такой же объем свежей питательной среды, содержащий 300 ед/мл rhIL-2 для пластин ячейки.
2. Изменить половина среды каждые 3 дней (2.2) до ячейки кластеры отчетливо видны под микроскопом (рис. 2). Как правило этот процесс занимает 2-3 недели.
3. Передать клетки от 24-ну пластины T25 культуры колбы после смешивания различных скважин по той же линии. Двойной объем питательной среды как она становится желтой до объема среды расширяется до 10-15 мл. Добавьте rhIL-2 с концентрацией 150 ед/мл.
4. Изменение средних 24 ч до замораживания после 2-3 недели растет, когда ячейка массы можно наблюдать невооруженным глазом. Измерение концентрации клеток с счетчик соматических клеток.
5. Центрифуга суспензию клеток для 5 мин на 240 x g и вновь приостановить Пелле клеток на плотности тарелок 5-10 x 10⁶ клеток/мл с замороженных Стоковый раствор, который содержит плода бычьим сывороточным 90% и 10% диметилсульфоксид (ДМСО). Заморозить со скоростью 1 ° C / мин до-80 ° C, а затем передать непосредственно в жидкий азот.

Результаты

После 3 дней культуры во время создания клеточных линий, полиморфные клетки начинают появляться (рис. 2). После 7 дней клетки растут быстро, увеличением числа и жизнеспособность клеток на высокой скорости (рис. 3). После 10-14 дней, растет, когда концентрация клеток может превышать 3-6 × 10⁶четко видны небольшие кластеры клеток. В этот период клетки должен быть расширен путем разделения на два или три скважины плиты ку...

Обсуждение

В этом протоколе был разработан Роман технику для создания НК/T клеточных линий из цельной крови больных CAEBV. По сравнению с существующими методами, основным преимуществом данного метода является его простота и его требование лишь небольшого количества крови, в то время как оно exhibits высокий уровень успеха и хорошие условия жизнеспособности клеток. Кроме того НК/T клеточных линий может устанавливаться путем культивирования КСДОР без определения типов клеток EBV латентно инфицированных заранее, как определение будет ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Антитела Hu HLA-DR FITC	BD		антитела для FACS
Hu CD4 FITC	BD	555346	антитела для FACS
Hu/NHP CD8 PE	BD	557086	антитела для FACS
Hu CD3 PE	BD	555340	антитела для FACS
Hu CD16 FITC 3G8	BD	555406	антитела для FACS
Hu/NHP CD56 PE MY31	BD	556647	антитело для FACS
hu/CD19 PE-Cy7	BD	560728	антитело для FACS
человека IL-2	Roche	11147528001
сыворотки крови человека	MRC	CCC118-125
CO2	SANYO
Centrifuge	Techcomp	CT6T	Центрифугационный
микроскоп	OLYMPUS CKX53	CKX53
Автоматизированный счетчик клеток	Countstar	IC 1000	Для подсчета клеток
24 лунки кластер клеточных культур	Corning Incorporated	3524	Полистирольные пластины
25см2 колба для клеточной культуры	Гнездо	707001	Полистирол
FBS	Gibco	10270	Компонент клеточной среды
RPMI Medium 1640	срок службы	22400089	Для клеточной среды
L-глутамин	Amresco	374	Компонент клеточной среды
100 x стрептомицина пенициллина раствор BioRoYeeBRY-2309	BioRoYee	BRY-2309	Компонент клеточной среды
Ficoll paque plus	GE Healthcare	17-1440-03	Для выделения in vitro лимфоцитов
	DMSO Sigma	D2650	Для замораживания клеток
проточный цитометр	BD	BD FACSAria II
программная посуда	BD	BD FACSДива программная посуда	FACS анализ