Протокол для Decellularizing Cochleae мыши для внутреннего уха тканевая инженерия

Summary

Цель настоящего Протокола заключается в демонстрации эффективным методом для decellularize и известь cochleae мыши для использования как подмости для ткани инженерных приложений.

Abstract

В млекопитающих, mechanosensory клетки волос, которые облегчают отсутствие слуха способность к регенерации, которая имеет ограниченные лечения потери слуха. Нынешние стратегии регенеративной медицины были сосредоточены на трансплантации стволовых клеток или генетические манипуляции окружающих клетки поддержки внутреннего уха для поощрения замены поврежденных стволовых клеток для исправления потере слуха. Тем не менее внеклеточная матрица (ECM) могут играть жизненно важную роль в склонение и поддержание функции клетки волос и не хорошо исследовано. С помощью кохлеарной ECM как леска выращивать стволовые клетки могут обеспечить уникальные понимание как состав и архитектуры внеклеточных среды помогает клетки в поддержании функции слуха. Здесь мы представляем метод для изоляции и decellularizing cochleae от мышей для использования в качестве строительных лесов, принимая перфузии взрослых стволовых клеток. В текущем протоколе cochleae изолированы от Усыпленных мышей, decellularized и decalcified. Потом клетки человека Уортон желе (hWJCs), которые были изолированы от пуповины были тщательно увлажненную в каждом улитки. Cochleae были использованы как биореакторов, и клетки были культивированный на 30 дней перед прохождением обработки для анализа. Decellularized cochleae сохранила идентифицируемой внеклеточного структур, но не выявили наличие клеток или заметно фрагменты ДНК. Клетки, увлажненную в улитке захватила большую часть интерьера и экстерьера улитки и вырос без инцидентов в течение 30 дней. Таким образом текущий метод может использоваться для изучения как улитковый ECM влияет на развитие клеток и поведение.

Introduction

Улитки является сложной спиральной структуры, в височной кости. Он состоит из наружной костлявые лабиринта и концентрические, внутренний лабиринт membranous¹. Лабиринт membranous состоит из трех пространств жидкости: vestibuli Скала, Скала средства массовой информации и скала литавры¹. Скала издательства сенсорные эпителия, который состоит из множества типов клеток, но Сензорные клетки волос (HC), которые передают механическую энергию в звуковые волны для нервных импульсов², представляют особый интерес. Воздействие Акустическая травма^3,4,5, лекарства⁶,^7,болезни⁸и старения⁹ может привести в нарушение слуховой функции через HC смерти. Потеря волос клеток млекопитающих является постоянным, в отличие от птичьего HCs, которые могут восстанавливаться после травмы¹⁰.

Целый ряд современных исследовательских усилий стремились восстановить потеряли HCs, хотя конкретные экспериментальные подходы различаются. Манипуляция экспрессии генов в эпителии сенсорные и Вживление стволовых клеток продифференцировано вне тела являются доминирующей подходы в этой области, хотя методы индукции, стремящихся дифференцироваться стволовых клеток в улитковый organoids были попытка^11,12,13. Каждый из этих подходов является либо непосредственно зависит от стволовых клеток или развития подсказки, используемые стволовых клеток; Однако, второй совместно, и потенциально критические, элемент ECM улитки, сам^14,15.

ЭХО не только обеспечивает физическую поддержку клетки и ткани, которая включает в себя поверхность для клеточной адгезии, распространения, выживания и миграции, но также играет важную роль в развитии HCs и спираль ганглия^{15,16 ,17}. Естественно происходя ECM предоставляет индуктивный сигналы, которые могут направлять Определение фенотипа клетки или клетки адгезии, распространением и выживания¹⁸. Следовательно использование decellularized улитки в сочетании с искусственного hWJCs предлагают уникальную возможность изучить роль ECM и HC регенерации. HWJCs являются легкодоступными, неспорным ячейки тип изолированы от человеческого пуповины, которые ведут себя как мезенхимальные стволовые клетки¹⁹. HWJCs показали способности различать вниз нейросенсорные клеток линий^20,21. Таким образом текущий протокол детали изоляции, decellularization и перфузии cochleae от туши C57BL мыши с hWJCs для внутреннего уха тканевой инженерии.

Protocol

Все процедуры, включая эвтаназии животных, были проведены согласно утвержденным институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) протокол (ACUP #2014-2234) в медицинском центре университета Канзаса (KUMC).

Примечание: HWJCs были изолированы от человеческого пуповины, которые были подарены пациентов, которые предоставлены осознанного согласия и образцы были использованы в соответствии с протоколами, утвержденных Комитетом университета Канзаса по предметам (ку-СИБ #15402).

1. височной кости урожая и улитки изоляции

1. Обезглавить надлежащим образом Усыпленных, 15-недельных мыши путем разрезания между череп и первого шейного позвонка с парой острые ножницы хирургические, а затем спрей вниз головой с 70% этанола для дезинфекции (рис. 1A).
2. Пополам черепа в середине сагиттальной плоскости, с использованием той же резкое пары Ножницы хирургические (рис. 1B- C, пунктирные линии).
3. Удаление ткани мозга от черепа с помощью пары щипцов (рис. 1 d, стрелки).
4. Выявления височной кости через присутствие слухового и вестибулярного нерва корни (Рисунок 1E-F, стрелки) на интерьер черепа и ушного канала от внешнего (Рисунок 1F, стрелка). Аккуратно вырежьте через череп изолировать височной кости от остальной части черепа (рис. 1 g).
   Примечание: В некоторых случаях, может можно деликатно подглядывать окружающие кости черепа от височной кости без необходимости резки.
5. Вставьте тонкой щипцами в открытии ушного канала примерно 5 мм (рис. 1 H), поэтому советы не рискуйте проколов улитки. Аккуратно вскрывать кости буллы (рис. 1 H, верхний красный затененной области) поэтому переломы (Рисунок 1I, красная пунктирная линия).
   Примечание: В случае необходимости, микроскопом рассечение может помочь в этом процессе для обеспечения точного размещения и обработки документов.
6. С помощью тонкой щипцы, совать нос от оставшейся части буллой от височной кости, подвергая костлявые лабиринта улитки (Рисунок 1J, красный скобки).
7. Место Петри блюдо достаточно большой, чтобы держать височной кости (например, 30 мм или больше) под рассекает область поля зрения и заполнить его с достаточно фосфат буфер солевой (PBS) для покрытия височной кости (например, 0,5 – 1 мл).
8. Опускайте височной кости с буллы, удалены в PBS с овальной и круглой windows улитки вверх.
   Примечание: Удаление вестибулярной системы от улитки не является необходимым, поскольку вестибулярной системы хорошо служит ручкой для манипулирования и ориентации функции улитки (Рисунок 1I и Рисунок 2B).
9. С помощью ультра-тонкой пара щипцов, удалите stapedial артерии, которая проходит через стремени.
10. Вставьте один наконечник ультра-тонкой щипцов через арку стремени, где артерии прошел и деликатно Поднимите стремени вверх. Офф в овальном окне снять разъединённых стремени.
11. Используя один наконечник ультрадисперсных щипцов, прокол овал и круглые окна.
12. С помощью 1 x PBS заполнены 28,5 калибруйте шприц с трубки (внутренний диаметр 0,28 мм, наружный диаметр 0,61 мм) прилагается, расположите трубы через овальное окно (рисунок 2A -B).
    Примечание: Открытие трубки можно манипулировать с помощью сверхтонкого щипцы, помогая обеспечить точное размещение.
    1. Используйте свежие шприц и труб для каждой улитки.
13. Perfuse 2 мл 10% антибиотик противогрибковое (анти анти) и 10% пенициллин стрептомицином (ручка стрептококк) в PBS через улитку более 5 мин для удаления перилимфе. Perfusing слишком быстро с слишком много давления приводит к повреждению тонких структур внутри улитки.
    Примечание: Вручную вождения шприц вручную, чтобы perfuse жидкости через улитки является эффективным, хотя перфузионный насос может использоваться в качестве альтернативы.
    1. Если вручную perfusing, используйте пару штрафа, самозакрывающиеся щипцы для стабилизации улитки (рисунок 2A) при перфузии, держа вестибулярной части височной кости.
       Примечание: Хотя не требуется, это оставляет обе руки свободными для обработки документов; одной стороны может управлять шприца (рисунок 2A), а другой можно расположить трубы надлежащим образом (рис. 2B).
    2. От этого шага вперед, заботиться, чтобы не подвергать улитки излишне для воздуха. Представляя пузырьков воздуха в жидкости пространства будет блокировать циркуляции жидкости, и дальнейшее высыхание приведет к повреждению тонких структур внутри улитки.
14. Снимите и выбросьте любые оставшиеся мышечной ткани и кости фрагменты с помощью тонкой щипцы.
15. При необходимости хранения изолированных cochleae при температуре 4 ° C в анти анти 10% и 10% раствор Пен стрептококк в PBS на срок до семи дней с регулярные изменения антибиотик раствора каждые 48 ч.

2. улитковый обработка

1. Decellularization
   1. Для каждого улитки заливка стекла 20 мл флакон Сцинтилляционный с 1% натрия Додециловый сульфат (SDS) решения в деионизированной воде (DI), который используется для decellularize улитки.
   2. Отрежьте кончик офф пипетки пластиковые 7-мл передачи с помощью лезвия бритвы, так что открытие является достаточно большой для улитки пройти через.
   3. С помощью пипетки передачи, аккуратно составить улитки в пипетку так он просто передает краю отсечения на несколько миллиметров.
   4. Высылать улитки в пробирку раствор заполнены сцинтилляционные SDS 1%.
   5. Распространение 2 мл 1% SDS в деионизированной воде (DI) через улитку сцинтилляционные флакон с помощью пипетки передачи.
   6. Поместите сцинтилляционные флакона в ротатор и позволяют сцинтилляционные флакон для поворота 10 об/мин за 72 ч при комнатной температуре.
      1. Измените SDS 1% раствора каждые 24 ч в течение 72 ч. Соблюдайте осторожность при изменении SDS никогда не подвергать улитки воздух.
   7. Вымойте улитки три раза по 30 мин с ди водой.

Выполните стирок же сцинтилляционные флакон для SDS обвинения; на данном этапе является decellularized улитки.

Декальцинации

1. Удалите оставшуюся воду ди из сцинтилляционного флакон, оставляя только достаточно, чтобы держать улитки погруженной.
2. Чтобы начать декальцинации, добавьте 5 мл 10% Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) (0,02 М) в воде ди сцинтилляционные флакон, содержащий улитки.
3. Распространение 2 мл 10% ЭДТА в DI воды через улитку сцинтилляционные флакон с помощью пипетки передачи.
4. Место сцинтилляционные флакон обратно в ротатор и позволяют сцинтилляционные флакон для поворота 10 об/мин за 72 ч при комнатной температуре. Измените ЭДТА 10% раствора каждые 24 ч в течение 72 ч. Соблюдайте осторожность при изменении решения, так что улитки не подвергается воздействию воздуха.
5. Промойте улитки 3 раза по 2 ч с ПБС; на данном этапе является decalcified улитки.

Хранения

1. Хранить cochleae до 72 часов в 10% анти анти, 10% перо стрептококк раствора в PBS на 4 ° C.
   Примечание: Длительного хранения может быть возможным с регулярные изменения антибиотик раствора; Однако длительное хранение обработанных cochleae не были протестированы в настоящем Протоколе.

3. закупки и расширение hWJCs

1. Изолируйте hWJCs согласно ранее опубликованные протоколы²². Вкратце сегмент пуповины в разделы 3-см.
2. Аккуратно сделайте мелкий разрез с помощью скальпеля продольно на каждом сегменте пуповины раскатывают и подвергать Уортон желе пуповины. Используйте щипцы для удаления кровеносных сосудов.
3. Вымойте пуповины сегментов дважды с достаточно PBS (например, 40 мл в 60 мм Петри) погружаться в ткани. Мелко фарш ткани сегментов с помощью скальпеля. Дайджест ткани в 100 мм Петри с 50 мл среды пищеварения (коллагеназа типа 2 0.2%, 1% пенициллин стрептомицином, в низкой глюкозы Дульбекко изменение орла среднего (DMEM)).
4. Место ткани в переваривания среднего на орбитальный шейкер на 50 об/мин на ночь в 5% CO₂, 37 ° C инкубатора. На следующий день, разбавить среднего пищеварение в соотношении 1:16 на 2% антибиотик противогрибковое в PBS и Пелле клетки центрифугированием на 500 x g при комнатной температуре (~ 27 ° C) для 10 минут удалить супернатант.
5. Ресуспензируйте окатышей в средний рост мезенхимальных стволовых клеток (MSCGM) и перекомбинировать клетки. Плита клетки на плотности 7 х 10³ клеток/см² в культуре ткани лечение T-75 колбы. Культура HWJCs в MSCGM и расширить проход 5 для экспериментов.
   Примечание: HWJCs может быть югу культивировали в больших T-фляги (например, T-150, T-300) когда пассированый увеличить доходность hWJCs для экспериментов.

4. настой hWJCs в Decellularized Cochleae

1. Подготовка decellularized cochleae
   1. С помощью асептического технику, мыть хранимой cochleae в однократном ПБС три раза по 30 мин.
   2. Перевести cochleae на отдельных скважинах 24-ну плиты и добавьте 1 mL 37 ° C предварительно разогретую MSCGM.
   3. Инкубируйте cochleae в 5% CO₂, 37 ° C клетки культуры инкубатор для минимум 1 ч до инфузии клеток.
2. Отделить hWJCs и Ресуспензируйте
   1. Мойка hWJCs с 37 ° C предварительно разогретую ПБС дважды.
   2. Добавьте достаточно 37 ° C предварительно разогретую трипсина с 0,5% ЭДТА для покрытия поверхности клетки судна.
   3. Инкубируйте hWJCs до 5 минут в 5% CO₂, 37 ° C инкубатор культуры клеток.
      1. Убедитесь, что 90% клеток отделен от поверхности культуры клеток, просмотрев клетки под инвертированным микроскопом.
         Примечание: Клетки, которые двигают когда судно культуры осторожно прослушиваются, отсоединены. Клетки, которые остаются неподвижными, не отсоединяется.
      2. Аккуратно постучите по стенкам колбы для дальнейшего вытеснения прилагаемый клетки.
   4. С помощью асептической техники, передачи hWJCs от культуры судна в 50-мл конические трубку, содержащий эквивалентный объем MSCGM объему трипсина используется для разбить ячейки.
   5. Пелле hWJCs центрифугированием на 500 x g при комнатной температуре (~ 27 ° C) за 5 мин.
   6. Аспирационная супернатанта и Ресуспензируйте hWJCs в MSCGM в концентрации 500000 клеток/мл.
3. Perfuse cochleae
   1. Передача cochleae новый 24-ну пластине с помощью пипетки передачи.
   2. Добавьте каплю MSCGM каждого улитки, чтобы предотвратить любые улитки от высыхания.
   3. Деликатно Ориентируйте улитки с помощью сверхтонкого щипцы, так что овальные и круглые окна вверх.
      Примечание: Принять крайней осторожностью при непосредственно обработка каждого улитки улитки легко повредить.
   4. С помощью шприца стерильные 28,5 калибруйте инсулина с подключенным труб, составить 0,2 мл высокомобильна hWJCs (100000 клеток).
   5. Использование стерилизованные тонкой щипцы, позиция трубы через овальное окно.
   6. Деликатно и медленно perfuse улитки с 0,2 мл ресуспензированы hWJCs, с помощью шприца инсулина 28,5 датчик подключен к полиэтиленовые трубки (наружный диаметр: 0,61 мм, внутренний диаметр: 0,28 мм) над примерно 5 мин.
   7. После перфузии, добавить 0,8 мл 37 ° C предварительно разогретую MSCGM хорошо содержащие улитки довести общий объем в скважине до 1 мл.
   8. Повторите шаги 4.3.3-4.3.7 для каждого улитки, используя свежие шприц и НКТ каждый раз.
   9. Перфузии cochleae в 5% CO₂, 37 ° C инкубатор культуры клеток и изменить СМИ три раза в неделю.

5. улитки урожай и сохранение

Примечание: Cochleae может быть культивировали и собирают в любой момент времени до 30 дней после перфузии.

1. Чтобы сохранить cochleae, исправить в параформальдегида 4% в однократном ПБС на ночь при 4 ° C на качающейся платформе.
2. После фиксации мыть cochleae с ПБС три раза за 5 мин.
3. Постепенно обезвоживает улитки с этанолом и очистка растворителем алифатических углеводородов до встраивания в парафин.
4. В разделе образцы толщиной до 10 мкм, используя микротом и смонтировать на стеклянных скольжениях микроскопа.
   Примечание: Образцы для теперь готовы гистологические или иммуногистохимических обработки с использованием стандартных протоколов.

Results

С использованием представленные здесь методы, успешно decellularization cochleae оценивалась путем изучения наличие или отсутствие ДНК через 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) пятнать. Cochleae были рассмотрены полностью decellularized, если ДНК не был выявлен в рамках decellularized улитки. Родной улитки от предыдущих эксперимент, который не проходят decellularization или декальцинации был использован как позитивный элемент управления для иллюстрации структуры и клеток традиционно в C...

Discussion

Мы успешно продемонстрировали, что родной улитковый клетки могут быть удалены из улитки через процесс decellularization, который позволяет использовать улитки как сложную, трехмерные ткани эшафот. Санти и др. ¹⁵ разработал первоначальный метод для decellularizing cochleae и точно оценить объемы многих улитковый структур путем с помощью света лист микроскопии²³. Такая ранняя работа служит прочной основой для тканевой инженерии и представленные здесь методики культур...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Центрифуга Allegra X-14R	Beckman-Coulter	B08861
Intramedic Полужесткая трубка	Becton Dickinson	427401
New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler	Eppendorf	M1190-0002
Хирургические ножницы	Fine Science Tools	14060-10
Тонкие щипцы	Fine Science Tools	11370-40
Ультратонкие щипцы	Fine Science Tools	18155-13
50-мл Конические трубки	Fisher Scientific	12565271
чашка Петри Fisher	Scientific	FB087579B
U-100 Инсулиновый шприц	Fisher	Scientific 14-829-1B
Сцинтилляционный флакон	Fisher Scientific	03-341-73
Ротатор	Fisher Scientific	88-861-049
Переносная пипетка	Fisher Scientific	22-170-404
Лезвие бритвы	Fisher	Scientific 12-640
Антибиотик-антимикотик	Fisher Scientific	15-240-062
Пенициллин-стрептомицин	Fisher Scientific	15-140-122
24-луночный планшет	Fisher Scientific	07-200-84
SuperFrost PLUS стеклянный микроскоп предметные стекла	Fisher Scientific	12-550-15
Трансферная пипетка	Fisher Scientific	22-170-404
ProLong Gold Antifade Mountant с DAPI	Fisher Scientific	P36935
Clear-Rite 3	Fisher Scientific	22-046341
Thermo Scientific Forma Series II 3110 Водно<суб>2	Fisher Scientific	13-998-078
Мезенхимальная среда для роста стволовых клеток	Lonza	PT-3001
Трипсин-ЭДТА	Lonza	CC-3232
TPP T-75 Колба для культур	MidSci	TP90076
TPP T-150 Колба для культур	MidSci	TP90151
Колба для культуры TPP T-300	MidSci	TP90301
Диссекционный микроскоп	Nikon Instruments	SMZ800
Nikon Eclipse Ts2R-FL Инвертированный микроскоп	Nikon Instruments	MFA51010
NuAire Class II, тип A2 Шкаф биобезопасности	NuAire	NU-425-600
1X PBS	Sigma-Aldrich	P5368-10PAK
1% SDS раствор	Sigma-Aldrich	436143-100G
10% EDTA	Sigma-Aldrich	E9884-100G