Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Обобщение и оценка ингибитор поглощения на основе рутений митохондриальной кальция

7.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56527

⸱

26 октября 2017 г.

 , 
1Department of Chemistry and Chemical Biology, Cornell University

В этой статье

Краткое содержание

Протокол для синтеза, очистки и характеристика рутений основе ингибиторов митохондриальных кальция поглощения представлен. Демонстрируется процедура для оценки ее эффективности в permeabilized клетках млекопитающих.

Аннотация

Мы подробно синтеза и очистки ингибиторов митохондриальных кальция поглощения, [(2OH) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(2OH)]5 +. Оптимизированный синтез этого соединения начинается от [Ru (NH3)5Cl] Cl2 в 1 М NH4OH в закрытом контейнере, давая зеленый раствор. Очистка осуществляется с катионообмен хроматографии. Это вещество характеризуется и UV-vis и ИК-спектроскопии проверены, чтобы быть чистым. В permeabilized клетки HeLa митохондриальной кальция поглощение ингибирующих свойств оцениваются флуоресцентной спектроскопии.

Введение

Митохондриальной Кальций является ключевым регулятором для целого ряда процессов, которые имеют решающее значение для нормальной клеточной функции, включая производство энергии и апоптоз. 1 , 2 , 3 Унипорт митохондриальных кальция (MCU), Ион транспортер белок, который находится на внутренней митохондриальной мембраны, регулирует приток ионов кальция в митохондрии. 4 , 5 , 6 химических ингибиторов MCU являются ценными инструментами для продолжения усилий для изучения функции и клеточных роли этого транспортного белка и митохондриальной кальция. Соединения [(2HCO) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, является одним из только известных селективных ингибиторов для Микроконтроллера с заявленной стоимостьюd K 24 µM.7 ,8,9,10 этот комплекс является общей примеси в коммерческих препаратах Рутения красный (RuRed), triruthenium ди µ оксо мост hexacation формулы [(NH-3) 5 Ru (µ-O) Ru (NH3)4(µ-O) Ru (NH3)5)]6 +, который также использовался как ингибитор поглощение кальция. Хотя Ru360 является коммерчески доступных, это очень дорого. Кроме того обобщение и изоляции Ru360 оспаривается трудно очистительные процедуры и методы неоднозначными характеристике.

Недавно мы сообщили альтернативные процедуры для доступа к аналоговых, Cl [(2OH) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(2OH)] Ru3605. 11 это соединение подавляет MCU с высоким сродством, похож на Ru360. В этом протоколе мы будем описывать наши наиболее эффективным синтез этого соединения, который начинается от [Ru (NH3)5Cl] Cl2. Очистки продукта с помощью настоятельно кислой катионообменной смолы подробно, а также распространенных ошибок для этой процедуры. Мы также методы для характеристики и оценки составных чистоты и определить простой подход к проверить его эффективность в блокирует поглощение митохондриальной кальция.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: в этом синтезе используются концентрированных кислот и щелочей. Используйте все практики безопасности при выполнении реакции, включая использование инженерного управления (Зонта) и средств индивидуальной защиты (СИЗ) включая защитные очки, перчатки, лаборатории пальто, брюки полной длины и закрыты носок обуви.

1. подготовка [(2 OH) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (2 OH)] Cl 5

  1. синтез Cl [Ru (NH 3) 5 Cl] 2 12
    1. распустить 1.00 g RuCl 3 · n H 2 O (40% Ru по весу, 4,1 ммоль) в 5 мл H 2 O. Cool темно коричневый решение до 0 ° C в ледяной бане. Добавьте 11 мл (0.23 моль) 80% Гидразина гидрат решения в духе прикапывают. Первоначальная реакция будет энергичные с эволюции газа, что приводит к коричневый решения. Пусть полученный раствор перемешать при комнатной температуре для 16 h; окончательное решение будет темно Ред
      Предупреждение: Гидразина остро токсичными и канцерогенными. Кроме того безводный формы этого реагента взрывоопасны. Как всегда используйте соответствующие средства индивидуальной защиты и дыма вытяжки при обработке. Не концентрируйтесь эти решения к сухости.
    2. В этот раствор добавить примерно 5-10 мл концентрированной HCl для регулировки рН до 2. На данный момент, решение будет желто коричневого цвета.
    3. Тепло это решение при 105 ° C помешивая для 1-2 ч. Желтое тело будет выпадать в осадок из раствора. Когда не более заметно осадок форм, удалить от жары.
    4. Позволяют реакционной смеси остыть до комнатной температуры, а затем поместить в ледяной бане 0 ° C на 10 минут собрать желтого тела вакуумной фильтрации и мыть с 5 мл этанола и диэтиловом эфире.
    5. Полностью растворить сырой продукт в 15-25 мл горячей воды. Холод 10 мл концентрированного раствора HCl в колбу фильтра, поместив его в ледяной бане. Фильтр желтый раствор в охлажденный раствор HCl побудить осадков бледно желтый чисто твердого тела. Фильтровать этот преципитат и мыть с 5 мл 0,5 М HCl, этанола и эфира.
    6. Характеризуют соединения с помощью ИК-спектроскопии. Проверьте чистоту, выявление растяжения частот на 3226 см -1, 1604 см -1, 1297 см -1 и 801 см -1. [Ru (NH 3) 5 N 2] Cl 3 назначается общим незначительные примеси на 2069 см -1.
  2. Синтез [(2 OH) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (2 OH)] Cl 5
    1. растворить 100 мг (0,34 ммоль) [Ru (NH 3) 5 Cl] 2 CL в 50 мл 1 M NH 4 OH в 200 мл толстостенных круглодонные давления судна. Слабо крышка колбу с пробкой и тепла реакционной смеси при 75 ° C для 6 h. удалить от жары и перемешать при комнатной температуре в течение 4 дней, чтобы принести темно зеленый раствор.
      Внимание! Отопление запечатанный сосуд результаты в давления. Убедитесь в том использовать соответствующие давления Сейф посуда. Для этой реакции герметизация судно призвана свести к минимуму потери газообразных NH-3. Таким образом, место пробку слабо для того, чтобы позволить для выпуска избыточного давления в.
  3. Очистки хромотографией катионообмен
    1. в 25 мл стакан, приостановить 5 g-катионообменной смолы (например, Dowex 50WX2 200-400 сетки (форма H +) в 10 мл 0,1 М HCl.
    2. Загрузить этот раствор в столбец 10 мл (диаметр 10 мм, высота 15 см) с 50 мл растворителя водохранилище. Мыть смолы с приблизительно 20-30 мл 0.1 М HCl, до тех пор, пока элюата бесцветен.
    3. Возвращение к зеленому реакция решение изолированы в шаг 1.2.1. В этот раствор добавить концентрированной HCl для регулировки рН 2, в этот момент решение цвет изменится на Браун.
    4. Загрузить этот подкисленных решение столбце смолы-катионообмен, подготовленный на шаге 1.3.2 нежно закупорить поверх смолы. Пусть элюата полностью слейте воду и продолжить загрузку решения. Повторите этот процесс, пока будут добавлены все решение. В верхней части смола будет темно-коричневый/черный. Смола будет уменьшаться в объеме слегка.
    5. Использовать стеклянные бусины для покрытия верхней части смолы. Это будет препятствовать нарушался при добавлении новых решений смолы.
    6. Элюировать столбец с 20 мл 1 М HCl.
    7. Элюировать столбце с повышенной концентрацией HCl 1,5 м (≈ 50 мл). Желтый раствор начнет сходить в столбце. Увеличение концентрации HCl до 2 М и продолжить элюирующие до тех пор, пока элюата бесцветен или очень бледно-зеленый желтый. Для этого процесса потребуется суммарный объем 150-200 мл.
    8. Увеличение концентрации HCl до 2,5 М (20-50 мл). Соберите элюата фракций в пробирках. Увеличить до 3 М HCl. Продукт будет элюировать из столбца как решение зелено коричневый. Красно коричневый фракция может также начать прийти прочь в столбце. Как эти фракции окисленных рутений красный примесей, не бассейн с зелено коричневый фракций.
  4. Характеристик и проверки чистоты [(2 OH) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (2 OH)] Cl 5
    1. тест всех фракций от Шаг 1.3.8. по отношению к УФ спектроскопия. Для выполнения этой задачи, 100 мкл данной дроби в 2 мл 3 M NH3 и анализировать, UV-vis спектроскопии. Фракций, содержащих чистый продукт будет иметь большой поглощения группы на 360 Нм и менее интенсивного поглощения на 600 Нм. Поглощения в 480 или 533 Нм свидетельствует о окисленных рутений красный и красный рутений примесей, соответственно.
    2. Бассейн фракций, содержащих чистый продукт и испаряются решение сухости Ротари испарением. Продукт будет изолирован как прочной зелено коричневый. Урожаи, обычно порядка 5-15 мг (10-20% доходности). Одноместный кристаллы, подходит для рентгеновской дифракции, могут быть получены путем диффузии паров этанола в водных растворах соединения.
    3. Для проверки чистоты, анализировать комплекса спектроскопия UV-vis в растворе рН 7,4 фосфат амортизированное saline (PBS). Чистота может оцениваться, принимая отношение интенсивности 360 Нм и 600 Нм пиков. Это соотношение является 31 для чистого соединения. Для нечистых соединений, соотношение будет меньше,.
    4. Анализ образца в твердотельных методом ИК-спектроскопии. Диагностических групп находятся на 3234 см -1, 3151 см -1, 1618 см -1, 1313 см -1 и 815 см -1. Общие примеси полос видны в 1762 см -1 и 1400 см -1, характерные для NH 4 Cl. рутений красный может быть идентифицирован полос в 1404 см -1, 1300 см -1, 1037 см -1 и 800 см -1.
  5. Оценки митохондриальной кальция флуоресцентной спектроскопии поглощения ингибирования
    осторожно! В следующих процедурах используются mammalian клеток. Работа должна осуществляться в соответствующих ламинарные шкафы, которые сертифицированы для биологической безопасности уровня 2 исследований (BSL2).
    ​ Примечание: [(2 OH) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (2 OH)] Cl 5 будет именоваться как [Ru] в этом разделе
    1. сделать буфер глюкозы содержащих солевой раствор (BGSS) пробирного СМИ. BGSS это решение состоит из 110 мм KCl, 1 мм х 2 PO 4, 1 мм MgCl 2, 20 мм 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic кислота (HEPES), сукцинат натрия 5 мм, 30 мкм этиленгликоля bis(β-aminoethyl ether)-N, N , N ', N '-tetraacetic кислота (EGTA). Объединить все за исключением EGTA, скорректировать рН 7,4. Добавить EGTA и скорректировать рН 7,4. Для 50 мл пробы СМИ добавить 0,5 мл 1 мг/мл глюкозы.
    2. Культура НеЬа клетки в 500 см 2 чашки Петри в Дульбекко ' s Modified Eagle среднего (DMEM) с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) в увлажненные инкубатор с 5% CO 2 при 37 ° C. усиливают НеЬа клетки, растущих в 100 мм Петри путем посева их в чашке Петри 2 500 см. Объем всего СМИ в большое блюдо-115 мл. Каждое большое блюдо даст около 18 миллионов клеток, достаточно для двух экспериментов флуоресцентной спектроскопии.
      1. Расти ячейки до тех пор, пока они достигают 90-95% confluency. Удалите средства массовой информации и промойте клетки с 15 мл рН 7,4 PBS. Добавляют 15 мл 1 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) в PBS и проинкубируйте втечение 10 мин для отсоединения клетки. Перевести 14 мл вокруг трубки сокола нижней клетки
    3. подсчитать ячейки с помощью Трипановый синий и Горяева с инвертированным микроскопом и рассчитать общее количество клеток и объем средств, необходимых для достижения 7.5 миллион клеток в объем 1.8 мл среды. Центрифуга клетки для 10 мин на 5310 × g. Decant супернатант и добавьте вычисляемый объем BGSS. Нежно ресуспензируйте клетки.
      1. Для этого анализа, подготовка запасов решения digitonin 40 мм в диметилсульфоксида (ДМСО), 1 мм кальция Грин 5N H 2 O, и 10 мм CaCl 2 H 2 O. [Ru] акций решения, подготовленные в чистой воде, может варьироваться от 1-3 мм.
        ​ Примечание: кальция Грин 5N чувствителен к свету. Хранить в темноте и сведения к минимуму воздействия света.
    4. Установка fluorimeter для возбуждения в 506 Нм и чтения выбросов на 532 нм с держатель кювет, контролируемых на 37 ° C. Prepare акриловые кювета с перемешать бар или колесо, 1.8 мл суспензии клеток от 1.5.2 выше, 1.8 мкл digitonin решение, 3.6 & #181; L кальция Грин 5N (решения) и 9 мкл [Ru] (для 1 мм раствор, 5 мкм конечная концентрация). Инкубируйте клетки за 15 мин в fluorimeter.
      1. Прочитать данные как отношение возбуждения/выбросов вместо сырой поглощения. Эта практика минимизирует ошибки, связанные с колебаниями в интенсивность источника света.
      2. Проведения первого анализа проб в отсутствие [Ru], чтобы измерить эффект добавления CaCl 2 на ответ клетки.
      3. Начать анализ на fluorimeter с использованием параметров, описанных в 1.5.4. Подождите около 2 минут, чтобы установить стабильной выбросов базового, а затем добавьте 1.8 мкл CaCl 2 (конечная концентрация 10 мкм). Интенсивность выбросов увеличится сразу же после добавления CaCl 2 и затем распадается в течение минут, как ионы кальция введите митохондрий. Дождитесь завершения распада (≈ 5 мин). Добавьте дополнительные кальция болюсов для определения реакции поглощение митохондриальной кальция клеток, не получавших [Ru].
    5. В другой кювета, содержащий 5 мкм [Ru], повторить эксперимент, как описано выше в 1.5.4.3. В присутствии ингибиторов интенсивности выбросов будет увеличить, но не гниет. Это наблюдение указывает, заблокирован поглощение кальция митохондриальной.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этот метод описывает синтез митохондриальной кальция поглощения ингибиторы [(2OH) (NH-3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(2OH)] Cl5 начиная с [Ru (NH3)5Cl] Cl2, хорошо известна ruthenium(III) исходного материала. [Ru (NH3)5Cl] CL2 характеризуется ИК-спектроскопии, с колебательных режимах на 3200 см-1, 1608 см-1, 1298 см-1и 798 см...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Cl [(2OH) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(2OH)] митохондриальной кальция поглощение ингибитор5 может быть синтезированным из [Ru (NH3)5Cl] Cl2, хорошо известна ruthenium(III) исходный материал, как описано в этой процедуре. Синтез [Ru (NH3)5Cl] Cl2 легко достигается без особых трудностей. После перемешивания3 RuCl для 16 h в гидразин гидрат, рН раствора следует скорректировать...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать

Благодарности

Это исследование было поддержано Корнельского университета. Эта работа использовала центра Корнелл для материалов исследований общий зал, которые поддерживаются через программу NSF MRSEC (Грант DMR-1120296). S.R.N. признает поддержку стипендий исследований NSF (Грант DGE - 1650441) и доктор Дейв Holowka для помощи с кальция экспериментов. Любые мнения, выводы и выводы или рекомендации, выраженные в этом материале являются те из авторов (s) и не обязательно отражают взгляды национального научного фонда.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Рутений трихлорид гидратДавление Химикат3750
Концентрированная соляная кислотаJ.T. Baker9535
Концентрированный гидроксид аммонияMallinckrodt Chemical WorksA669C-2 1
Dowex 50 WX2 200-400 МешAlfa Aesar13945
Кальций зеленый 5NInvitrogenC3737
ДигитонинОлдрич260746
ДМСООлдрич471267
EGTAAldrichE3889
KClUSB20598
KH2PO4AldrichP3786
MgCl2Fisher ScientificM33-500
HEPESFluka54466
Сукцинат натрияAlfa Aesar33386
EDTAJ.T. Baker8993-01
ГлюкозаAldrichG5000
200 Колба с круглым дномChemGlassCG-1506-14
Стеклянная пробкаChemGlassCG-3000-05
10 мм x 15 см стеклянная колонна с резервуарамиCustom - аналогично колонкам ChemglassАналогично CG-1203-20
DMEMCorning10-017-CV
FBSGibco10437028
PBSCorning21-040-CV
Трубки Falcon с круглым дномFisher Scientific14-959-11B 
500 см<суп>2 чашкиПетри Corning431110
Трипан синийThermoFisher Научный15250061
гемацитометрОлдричZ359629
акриловые кюветыVWR 58017-875
УФ-ВИД спектрометрAgilent Модель Cary 8454 
СпектрофлуориметрSLM Модель 8100C
ИК-спектрометрBruker Hyprion FTIR с насадкой
ATR ЦентрифугаALC Модель PM140R
Микроскоп с инвертированным светомVWR 89404-462
(Английский)

Ссылки

  1. De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth. Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).
  2. Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. Mitochondria: the calcium connection. Biochim. Biophys. Acta. 1797 (6-7), 607-618 (2010).
  3. Giorgi, C., et al. Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine. Mitochondrion. 12 (1), 77-85 (2012).
  4. De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabò, I., Rizzuto, R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).
  5. Baughman, J. M., et al. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 341-356 (2011).
  6. Kamer, K. J., Mootha, V. K. The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16 (9), 545-553 (2015).
  7. Ying, W. -L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex. Biochemistry. 30 (20), 4949-4952 (1991).
  8. Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -L., Sanadi, D. R. The component of "ruthenium red" responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of µ-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3. J. Am. Chem. Soc. 115 (25), 11799-11805 (1993).
  9. Matlib, M. A., et al. Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes. J. Biol. Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).
  10. Oxenoid, K., et al. Architecture of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).
  11. Nathan, S. R., et al. Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake. Inorg Chem. 56 (6), 3123-3126 (2017).
  12. Allen, A. D., Senoff, C. V. Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III). Can. J. Chem. 45 (12), 1337-1341 (1967).
  13. Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (18), 9893-9898 (1996).
  14. Deak, A. T., et al. Assessment of mitochondrial Ca⁺ uptake. Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Аналог рутения 360катионообменная хроматографияУФ-видимая спектроскопияИК-спектроскопияфлуоресцентная спектроскопияпермеабилизированные клетки HeLaпримеси коричневого рутениязелено-коричневые фракциисинтез с использованием гидроксида аммония
Обобщение и оценка ингибитор поглощения на основе рутений митохондриальной кальция
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.