Методическая статья

Обобщение и оценка ингибитор поглощения на основе рутений митохондриальной кальция

DOI:

10.3791/56527

⸱

26 октября 2017 г.

 , 
1Department of Chemistry and Chemical Biology, Cornell University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол для синтеза, очистки и характеристика рутений основе ингибиторов митохондриальных кальция поглощения представлен. Демонстрируется процедура для оценки ее эффективности в permeabilized клетках млекопитающих.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы подробно синтеза и очистки ингибиторов митохондриальных кальция поглощения, [(2OH) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(2OH)]5 +. Оптимизированный синтез этого соединения начинается от [Ru (NH3)5Cl] Cl2 в 1 М NH4OH в закрытом контейнере, давая зеленый раствор. Очистка осуществляется с катионообмен хроматографии. Это вещество характеризуется и UV-vis и ИК-спектроскопии проверены, чтобы быть чистым. В permeabilized клетки HeLa митохондриальной кальция поглощение ингибирующих свойств оцениваются флуоресцентной спектроскопии.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Митохондриальной Кальций является ключевым регулятором для целого ряда процессов, которые имеют решающее значение для нормальной клеточной функции, включая производство энергии и апоптоз. 1 , 2 , 3 Унипорт митохондриальных кальция (MCU), Ион транспортер белок, который находится на внутренней митохондриальной мембраны, регулирует приток ионов кальция в митохондрии. 4 , 5 , 6 химических ингибиторов MCU являются ценными инструментами для продолжения усилий для изучения функции и клеточных роли этого транспортного белка и митохондриальной кальция. Соединения [(2HCO) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, является одним из только известных селективных ингибиторов для Микроконтроллера с заявленной стоимостьюd K 24 µM.7 ,8,9,10 этот комплекс является общей примеси в коммерческих препаратах Рутения красный (RuRed), triruthenium ди µ оксо мост hexacation формулы [(NH-3) 5 Ru (µ-O) Ru (NH3)4(µ-O) Ru (NH3)5)]6 +, который также использовался как ингибитор поглощение кальция. Хотя Ru360 является коммерчески доступных, это очень дорого. Кроме того обобщение и изоляции Ru360 оспаривается трудно очистительные процедуры и методы неоднозначными характеристике.

Недавно мы сообщили альтернативные процедуры для доступа к аналоговых, Cl [(2OH) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(2OH)] Ru3605. 11 это соединение подавляет MCU с высоким сродством, похож на Ru360. В этом протоколе мы будем описывать наши наиболее эффективным синтез этого соединения, который начинается от [Ru (NH3)5Cl] Cl2. Очистки продукта с помощью настоятельно кислой катионообменной смолы подробно, а также распространенных ошибок для этой процедуры. Мы также методы для характеристики и оценки составных чистоты и определить простой подход к проверить его эффективность в блокирует поглощение митохондриальной кальция.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: в этом синтезе используются концентрированных кислот и щелочей. Используйте все практики безопасности при выполнении реакции, включая использование инженерного управления (Зонта) и средств индивидуальной защиты (СИЗ) включая защитные очки, перчатки, лаборатории пальто, брюки полной длины и закрыты носок обуви.

1. подготовка [(2 OH) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (2 OH)] Cl 5

  1. синтез Cl [Ru (NH 3) 5 Cl] 2 12
    1. распустить 1.00 g RuCl 3 · n H 2 O (40% Ru по весу, 4,1 ммоль) в 5 мл H 2 O. Cool темно коричневый решение до 0 ° C в ледяной бане. Добавьте 11 мл (0.23 моль) 80% Гидразина гидрат решения в духе прикапывают. Первоначальная реакция будет энергичные с эволюции газа, что приводит к коричневый решения. Пусть полученный раствор перемешать при комнатной температуре для 16 h; окончательное решение будет темно Ред
      Предупреждение: Гидразина остро токсичными и канцерогенными. Кроме того безводный формы этого реагента взрывоопасны. Как всегда используйте соответствующие средства индивидуальной защиты и дыма вытяжки при обработке. Не концентрируйтесь эти решения к сухости.
    2. В этот раствор добавить примерно 5-10 мл концентрированной HCl для регулировки рН до 2. На данный момент, решение будет желто коричневого цвета.
    3. Тепло это решение при 105 ° C помешивая для 1-2 ч. Желтое тело будет выпадать в осадок из раствора. Когда не более заметно осадок форм, удалить от жары.
    4. Позволяют реакционной смеси остыть до комнатной температуры, а затем поместить в ледяной бане 0 ° C на 10 минут собрать желтого тела вакуумной фильтрации и мыть с 5 мл этанола и диэтиловом эфире.
    5. Полностью растворить сырой продукт в 15-25 мл горячей воды. Холод 10 мл концентрированного раствора HCl в колбу фильтра, поместив его в ледяной бане. Фильтр желтый раствор в охлажденный раствор HCl побудить осадков бледно желтый чисто твердого тела. Фильтровать этот преципитат и мыть с 5 мл 0,5 М HCl, этанола и эфира.
    6. Характеризуют соединения с помощью ИК-спектроскопии. Проверьте чистоту, выявление растяжения частот на 3226 см -1, 1604 см -1, 1297 см -1 и 801 см -1. [Ru (NH 3) 5 N 2] Cl 3 назначается общим незначительные примеси на 2069 см -1.
  2. Синтез [(2 OH) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (2 OH)] Cl 5
    1. растворить 100 мг (0,34 ммоль) [Ru (NH 3) 5 Cl] 2 CL в 50 мл 1 M NH 4 OH в 200 мл толстостенных круглодонные давления судна. Слабо крышка колбу с пробкой и тепла реакционной смеси при 75 ° C для 6 h. удалить от жары и перемешать при комнатной температуре в течение 4 дней, чтобы принести темно зеленый раствор.
      Внимание! Отопление запечатанный сосуд результаты в давления. Убедитесь в том использовать соответствующие давления Сейф посуда. Для этой реакции герметизация судно призвана свести к минимуму потери газообразных NH-3. Таким образом, место пробку слабо для того, чтобы позволить для выпуска избыточного давления в.
  3. Очистки хромотографией катионообмен
    1. в 25 мл стакан, приостановить 5 g-катионообменной смолы (например, Dowex 50WX2 200-400 сетки (форма H +) в 10 мл 0,1 М HCl.
    2. Загрузить этот раствор в столбец 10 мл (диаметр 10 мм, высота 15 см) с 50 мл растворителя водохранилище. Мыть смолы с приблизительно 20-30 мл 0.1 М HCl, до тех пор, пока элюата бесцветен.
    3. Возвращение к зеленому реакция решение изолированы в шаг 1.2.1. В этот раствор добавить концентрированной HCl для регулировки рН 2, в этот момент решение цвет изменится на Браун.
    4. Загрузить этот подкисленных решение столбце смолы-катионообмен, подготовленный на шаге 1.3.2 нежно закупорить поверх смолы. Пусть элюата полностью слейте воду и продолжить загрузку решения. Повторите этот процесс, пока будут добавлены все решение. В верхней части смола будет темно-коричневый/черный. Смола будет уменьшаться в объеме слегка.
    5. Использовать стеклянные бусины для покрытия верхней части смолы. Это будет препятствовать нарушался при добавлении новых решений смолы.
    6. Элюировать столбец с 20 мл 1 М HCl.
    7. Элюировать столбце с повышенной концентрацией HCl 1,5 м (≈ 50 мл). Желтый раствор начнет сходить в столбце. Увеличение концентрации HCl до 2 М и продолжить элюирующие до тех пор, пока элюата бесцветен или очень бледно-зеленый желтый. Для этого процесса потребуется суммарный объем 150-200 мл.
    8. Увеличение концентрации HCl до 2,5 М (20-50 мл). Соберите элюата фракций в пробирках. Увеличить до 3 М HCl. Продукт будет элюировать из столбца как решение зелено коричневый. Красно коричневый фракция может также начать прийти прочь в столбце. Как эти фракции окисленных рутений красный примесей, не бассейн с зелено коричневый фракций.
  4. Характеристик и проверки чистоты [(2 OH) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (2 OH)] Cl 5
    1. тест всех фракций от Шаг 1.3.8. по отношению к УФ спектроскопия. Для выполнения этой задачи, 100 мкл данной дроби в 2 мл 3 M NH3 и анализировать, UV-vis спектроскопии. Фракций, содержащих чистый продукт будет иметь большой поглощения группы на 360 Нм и менее интенсивного поглощения на 600 Нм. Поглощения в 480 или 533 Нм свидетельствует о окисленных рутений красный и красный рутений примесей, соответственно.
    2. Бассейн фракций, содержащих чистый продукт и испаряются решение сухости Ротари испарением. Продукт будет изолирован как прочной зелено коричневый. Урожаи, обычно порядка 5-15 мг (10-20% доходности). Одноместный кристаллы, подходит для рентгеновской дифракции, могут быть получены путем диффузии паров этанола в водных растворах соединения.
    3. Для проверки чистоты, анализировать комплекса спектроскопия UV-vis в растворе рН 7,4 фосфат амортизированное saline (PBS). Чистота может оцениваться, принимая отношение интенсивности 360 Нм и 600 Нм пиков. Это соотношение является 31 для чистого соединения. Для нечистых соединений, соотношение будет меньше,.
    4. Анализ образца в твердотельных методом ИК-спектроскопии. Диагностических групп находятся на 3234 см -1, 3151 см -1, 1618 см -1, 1313 см -1 и 815 см -1. Общие примеси полос видны в 1762 см -1 и 1400 см -1, характерные для NH 4 Cl. рутений красный может быть идентифицирован полос в 1404 см -1, 1300 см -1, 1037 см -1 и 800 см -1.
  5. Оценки митохондриальной кальция флуоресцентной спектроскопии поглощения ингибирования
    осторожно! В следующих процедурах используются mammalian клеток. Работа должна осуществляться в соответствующих ламинарные шкафы, которые сертифицированы для биологической безопасности уровня 2 исследований (BSL2).
    ​ Примечание: [(2 OH) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (2 OH)] Cl 5 будет именоваться как [Ru] в этом разделе
    1. сделать буфер глюкозы содержащих солевой раствор (BGSS) пробирного СМИ. BGSS это решение состоит из 110 мм KCl, 1 мм х 2 PO 4, 1 мм MgCl 2, 20 мм 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic кислота (HEPES), сукцинат натрия 5 мм, 30 мкм этиленгликоля bis(β-aminoethyl ether)-N, N , N ', N '-tetraacetic кислота (EGTA). Объединить все за исключением EGTA, скорректировать рН 7,4. Добавить EGTA и скорректировать рН 7,4. Для 50 мл пробы СМИ добавить 0,5 мл 1 мг/мл глюкозы.
    2. Культура НеЬа клетки в 500 см 2 чашки Петри в Дульбекко ' s Modified Eagle среднего (DMEM) с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) в увлажненные инкубатор с 5% CO 2 при 37 ° C. усиливают НеЬа клетки, растущих в 100 мм Петри путем посева их в чашке Петри 2 500 см. Объем всего СМИ в большое блюдо-115 мл. Каждое большое блюдо даст около 18 миллионов клеток, достаточно для двух экспериментов флуоресцентной спектроскопии.
      1. Расти ячейки до тех пор, пока они достигают 90-95% confluency. Удалите средства массовой информации и промойте клетки с 15 мл рН 7,4 PBS. Добавляют 15 мл 1 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) в PBS и проинкубируйте втечение 10 мин для отсоединения клетки. Перевести 14 мл вокруг трубки сокола нижней клетки
    3. подсчитать ячейки с помощью Трипановый синий и Горяева с инвертированным микроскопом и рассчитать общее количество клеток и объем средств, необходимых для достижения 7.5 миллион клеток в объем 1.8 мл среды. Центрифуга клетки для 10 мин на 5310 × g. Decant супернатант и добавьте вычисляемый объем BGSS. Нежно ресуспензируйте клетки.
      1. Для этого анализа, подготовка запасов решения digitonin 40 мм в диметилсульфоксида (ДМСО), 1 мм кальция Грин 5N H 2 O, и 10 мм CaCl 2 H 2 O. [Ru] акций решения, подготовленные в чистой воде, может варьироваться от 1-3 мм.
        ​ Примечание: кальция Грин 5N чувствителен к свету. Хранить в темноте и сведения к минимуму воздействия света.
    4. Установка fluorimeter для возбуждения в 506 Нм и чтения выбросов на 532 нм с держатель кювет, контролируемых на 37 ° C. Prepare акриловые кювета с перемешать бар или колесо, 1.8 мл суспензии клеток от 1.5.2 выше, 1.8 мкл digitonin решение, 3.6 & #181; L кальция Грин 5N (решения) и 9 мкл [Ru] (для 1 мм раствор, 5 мкм конечная концентрация). Инкубируйте клетки за 15 мин в fluorimeter.
      1. Прочитать данные как отношение возбуждения/выбросов вместо сырой поглощения. Эта практика минимизирует ошибки, связанные с колебаниями в интенсивность источника света.
      2. Проведения первого анализа проб в отсутствие [Ru], чтобы измерить эффект добавления CaCl 2 на ответ клетки.
      3. Начать анализ на fluorimeter с использованием параметров, описанных в 1.5.4. Подождите около 2 минут, чтобы установить стабильной выбросов базового, а затем добавьте 1.8 мкл CaCl 2 (конечная концентрация 10 мкм). Интенсивность выбросов увеличится сразу же после добавления CaCl 2 и затем распадается в течение минут, как ионы кальция введите митохондрий. Дождитесь завершения распада (≈ 5 мин). Добавьте дополнительные кальция болюсов для определения реакции поглощение митохондриальной кальция клеток, не получавших [Ru].
    5. В другой кювета, содержащий 5 мкм [Ru], повторить эксперимент, как описано выше в 1.5.4.3. В присутствии ингибиторов интенсивности выбросов будет увеличить, но не гниет. Это наблюдение указывает, заблокирован поглощение кальция митохондриальной.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот метод описывает синтез митохондриальной кальция поглощения ингибиторы [(2OH) (NH-3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(2OH)] Cl5 начиная с [Ru (NH3)5Cl] Cl2, хорошо известна ruthenium(III) исходного материала. [Ru (NH3)5Cl] CL2 характеризуется ИК-спектроскопии, с колебательных режимах на 3200 см-1, 1608 см-1, 1298 см-1и 798 см...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cl [(2OH) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(2OH)] митохондриальной кальция поглощение ингибитор5 может быть синтезированным из [Ru (NH3)5Cl] Cl2, хорошо известна ruthenium(III) исходный материал, как описано в этой процедуре. Синтез [Ru (NH3)5Cl] Cl2 легко достигается без особых трудностей. После перемешивания3 RuCl для 16 h в гидразин гидрат, рН раствора следует скорректировать...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Корнельского университета. Эта работа использовала центра Корнелл для материалов исследований общий зал, которые поддерживаются через программу NSF MRSEC (Грант DMR-1120296). S.R.N. признает поддержку стипендий исследований NSF (Грант DGE - 1650441) и доктор Дейв Holowka для помощи с кальция экспериментов. Любые мнения, выводы и выводы или рекомендации, выраженные в этом материале являются те из авторов (s) и не обязательно отражают взгляды национального научного фонда.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Рутений трихлорид гидратДавление Химикат3750
Концентрированная соляная кислотаJ.T. Baker9535
Концентрированный гидроксид аммонияMallinckrodt Chemical WorksA669C-2 1
Dowex 50 WX2 200-400 МешAlfa Aesar13945
Кальций зеленый 5NInvitrogenC3737
ДигитонинОлдрич260746
ДМСООлдрич471267
EGTAAldrichE3889
KClUSB20598
KH2PO4AldrichP3786
MgCl2Fisher ScientificM33-500
HEPESFluka54466
Сукцинат натрияAlfa Aesar33386
EDTAJ.T. Baker8993-01
ГлюкозаAldrichG5000
200 Колба с круглым дномChemGlassCG-1506-14
Стеклянная пробкаChemGlassCG-3000-05
10 мм x 15 см стеклянная колонна с резервуарамиCustom - аналогично колонкам ChemglassАналогично CG-1203-20
DMEMCorning10-017-CV
FBSGibco10437028
PBSCorning21-040-CV
Трубки Falcon с круглым дномFisher Scientific14-959-11B 
500 см<суп>2 чашкиПетри Corning431110
Трипан синийThermoFisher Научный15250061
гемацитометрОлдричZ359629
акриловые кюветыVWR 58017-875
УФ-ВИД спектрометрAgilent Модель Cary 8454 
СпектрофлуориметрSLM Модель 8100C
ИК-спектрометрBruker Hyprion FTIR с насадкой
ATR ЦентрифугаALC Модель PM140R
Микроскоп с инвертированным светомVWR 89404-462
(Английский)

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth. Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).
  2. Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. Mitochondria: the calcium connection. Biochim. Biophys. Acta. 1797 (6-7), 607-618 (2010).
  3. Giorgi, C., et al. Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine. Mitochondrion. 12 (1), 77-85 (2012).
  4. De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabò, I., Rizzuto, R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).
  5. Baughman, J. M., et al. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 341-356 (2011).
  6. Kamer, K. J., Mootha, V. K. The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16 (9), 545-553 (2015).
  7. Ying, W. -L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex. Biochemistry. 30 (20), 4949-4952 (1991).
  8. Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -L., Sanadi, D. R. The component of "ruthenium red" responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of µ-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3. J. Am. Chem. Soc. 115 (25), 11799-11805 (1993).
  9. Matlib, M. A., et al. Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes. J. Biol. Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).
  10. Oxenoid, K., et al. Architecture of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).
  11. Nathan, S. R., et al. Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake. Inorg Chem. 56 (6), 3123-3126 (2017).
  12. Allen, A. D., Senoff, C. V. Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III). Can. J. Chem. 45 (12), 1337-1341 (1967).
  13. Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (18), 9893-9898 (1996).
  14. Deak, A. T., et al. Assessment of mitochondrial Ca⁺ uptake. Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

360HeLa

Похожие статьи