Мы иллюстрируем прямой метод для получения мышиных первичной макрофагов из клеток костного мозга и простой метод для подготовки BSA-жирные кислоты конъюгатов. Затем мы продемонстрировать, что насыщенные жирные кислоты может вызвать гибель клеток макрофагального и такие смерти клетки положительно связаны с сотовой накопления Церамид уровней.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Насыщенные жирные кислоты вызывают Церамид связанные макрофагов клеточной смерти
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Макрофаги высоко Экспресс эпидермальный белок, связывающий жирные кислоты и жировой белок, связывающий жирные кислоты. Они активно усвоение насыщенных и ненасыщенных жирных кислот, которые могут играть важную роль в регулировании их иммунных функций. Многочисленные исследования показали, что различные жирные кислоты, насыщенные или ненасыщенные, может иметь различное воздействие на рост клеток и функции. Однако различаются подходы, используемые для подготовки жирных кислот, которые могут привести к не физиологические результаты. Сывороточного альбумина, естественный перевозчиком жирных кислот в периферической крови млекопитающих, рекомендуется для формирования конъюгата комплекс с натриевой соли жирных кислот для изучения функции жирных кислот в клетках млекопитающих, таким образом минимизируя токсичность мыла жирных кислот. Таким образом простой, относительно быстро, Отопление и sonicating метод разработан и представлен здесь BSA-жирные кислоты конъюгата формирования. Мы описываем протокол, с помощью насыщенных жирных кислот, особенно стеариновой кислоты побудить тяжелой клеточной гибели в мыши костного производные макрофагов. Мы далее продемонстрировать положительно связаны с уровнями накопленные сотовой Церамид насыщенных жирных кислот индуцированной клеточную смерть. Этот метод может быть продлено исследования о влиянии жирных кислот на других клеток млекопитающих.
Введение
Жирные кислоты играют важную роль в метаболизме энергии и синтеза мембранных фосфолипидов в различных видов клеток. Жирные кислоты имеют низкую растворимость водный. Соответствующей подготовки жирные кислоты имеет решающее значение для изучения биологических функций жирных кислот в клетках млекопитающих. Когда жирные кислоты готовятся с этанолом, многие жирные кислоты могут показать их токсичных мыло (детергент) влияние на клеточной мембраны, даже при относительно низких концентрациях1. Естественно, основных транспортер для свободные жирные кислоты в сыворотке крови сывороточного альбумина считается хорошим носителем для жирных кислот доставки ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
протокол был одобрен институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из Университета Луисвилл.
1. мыши костного производные макрофагов (BMDMs)
- Euthanize 6 - до 8-недельных, здоровые дикого типа мыши, с помощью CO 2. Контактный его вниз доска пены и распылить его с 70% этанол до тех пор, пока она пропитана. Удалите бедра/голени кости с щипцы и ножницы. Положите в чашку Петри с 5 мл 1 x фосфат амортизированное saline (PBS). Выполнить все процедуры в стерильных условиях. Оба конца большеберцовой кости/бедренной кости с ножницами в стерильных культуры ткани капюшоном разрезали
- . Сбросить кость с ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Ожирение увеличивает концентрации свободных жирных кислот в сыворотке. Как профессиональные фагоциты макрофаги активно занимают жирных кислот для поддержания гомеостаза хост. В ходе этих процессов перегруженных липидами может вызвать гибель клеток макрофагального. С этой целью мы культивировали BMDMs в пробирке с ожирением уровни пищевых жирных кислот и гибели клеток измеренных макрофагов с помощью потока гранулярных пятнать. По сравнению с контролем BSA, насыщенных жирных кислот.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Надлежащей подготовки жирные кислоты раствор имеет решающее значение для изучения биологической функции жирных кислот. Нейтрализация жирные кислоты увеличивает его растворимости в водном растворе. Однако натриевые соли жирных кислот, особенно насыщенных жирных кислот, по-прежнему низкой растворимостью в воде или PBS как мы наблюдали. Одним из методов является использование этанола 95-100% чтобы помочь распустить жирные кислоты1. С помощью этого метода, более высокой токсичностью для клеток может н.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют нет финансовых конфликтов интересов.
Благодарности
Эта работа была частично поддерживается фондами начальный Луисвиллский университет и Национальный институт рака (Бетесда, MD) предоставляет R01CA177679, R01CA180986.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Ультразвуковая ванна CPX | Брэнсоник | Модель 2800 | |
| Пальмитат натрия (PA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1109 | M.W. 278 |
| Стеарат натрия (SA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1111 | M.W. 306 |
| Бычий сывороточный альбумин (БСА), без жирных кислот | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Мышиный макрофагальный колониестимулирующий фактор (mM-CSF) | Технология клеточной сигнализации, Inc. | 5228 | |
| RPMI 1640 | VWR International | 71002-878 | |
| Аннексин V, Alexa Fluor 488 конъюгат | Fisher Scientific | A13201 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Моноклональные антикерамидные антитела (мышиный IgM) | Sigma | C8104-50TST | Клон: MID 15B4 |
| Козье антимышиное антитело IgM, и микроцепь, FITC конъюгат | Sigma | AP128F | |
| Фиксирующий буфер | Biolegend | 420801 | |
| Пермеабилизационный буфер | Ebioscience | 4307693 | |
| Буфер для лизиса эритроцитов | Сигма | 11814389001 | |
| Аннексин V связывающий буфер | BD Biosciences | 556454 | |
| L929 клетки | ATCC | CCL-1 | |
| Corning Клеточный лифтер | Fisher Scientific | 07-200-364 | |
| Примечание: M.W. относится к молекулярной массе. |
Ссылки
- Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774). Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).
- Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
