Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Насыщенные жирные кислоты вызывают Церамид связанные макрофагов клеточной смерти

8.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56535

⸱

31 октября 2017 г.

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Louisville

В этой статье

Краткое содержание

Мы иллюстрируем прямой метод для получения мышиных первичной макрофагов из клеток костного мозга и простой метод для подготовки BSA-жирные кислоты конъюгатов. Затем мы продемонстрировать, что насыщенные жирные кислоты может вызвать гибель клеток макрофагального и такие смерти клетки положительно связаны с сотовой накопления Церамид уровней.

Аннотация

Макрофаги высоко Экспресс эпидермальный белок, связывающий жирные кислоты и жировой белок, связывающий жирные кислоты. Они активно усвоение насыщенных и ненасыщенных жирных кислот, которые могут играть важную роль в регулировании их иммунных функций. Многочисленные исследования показали, что различные жирные кислоты, насыщенные или ненасыщенные, может иметь различное воздействие на рост клеток и функции. Однако различаются подходы, используемые для подготовки жирных кислот, которые могут привести к не физиологические результаты. Сывороточного альбумина, естественный перевозчиком жирных кислот в периферической крови млекопитающих, рекомендуется для формирования конъюгата комплекс с натриевой соли жирных кислот для изучения функции жирных кислот в клетках млекопитающих, таким образом минимизируя токсичность мыла жирных кислот. Таким образом простой, относительно быстро, Отопление и sonicating метод разработан и представлен здесь BSA-жирные кислоты конъюгата формирования. Мы описываем протокол, с помощью насыщенных жирных кислот, особенно стеариновой кислоты побудить тяжелой клеточной гибели в мыши костного производные макрофагов. Мы далее продемонстрировать положительно связаны с уровнями накопленные сотовой Церамид насыщенных жирных кислот индуцированной клеточную смерть. Этот метод может быть продлено исследования о влиянии жирных кислот на других клеток млекопитающих.

Введение

Жирные кислоты играют важную роль в метаболизме энергии и синтеза мембранных фосфолипидов в различных видов клеток. Жирные кислоты имеют низкую растворимость водный. Соответствующей подготовки жирные кислоты имеет решающее значение для изучения биологических функций жирных кислот в клетках млекопитающих. Когда жирные кислоты готовятся с этанолом, многие жирные кислоты могут показать их токсичных мыло (детергент) влияние на клеточной мембраны, даже при относительно низких концентрациях1. Естественно, основных транспортер для свободные жирные кислоты в сыворотке крови сывороточного альбумина считается хорошим носителем для жирных кислот доставки в vitro для жирных кислот функция анализы2,,34. Однако детали подготовки жирных кислот и сывороточного альбумина конъюгата обычно не доступны хотя были опубликованы много научных работ с использованием жирных кислот.

Макрофаги высоко Экспресс эпидермальный белок, связывающий жирные кислоты и жировой связывающий жирные кислоты белка5,6,,78. Они активно усвоение насыщенных и ненасыщенных жирных кислот, которые могут регулировать иммунные функции. Для изучения влияния жирных кислот на другие клетки и макрофаги, различные методы подготовки жирных кислот были прикладной1,7,9. С помощью надлежащим образом подготовленных жирных кислот/сыворотка альбумина конъюгатов для изучения последствий жирных кислот, функции макрофагов имеет решающее значение в получении биологически значимых данных. Исследования о влиянии жирных кислот на функцию макрофагов может обеспечить базовые знания и потенциальных терапевтических целей, касающихся метаболизма жирных кислот в Макрофаг участие заболеваний.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

протокол был одобрен институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из Университета Луисвилл.

1. мыши костного производные макрофагов (BMDMs)

  1. Euthanize 6 - до 8-недельных, здоровые дикого типа мыши, с помощью CO 2. Контактный его вниз доска пены и распылить его с 70% этанол до тех пор, пока она пропитана. Удалите бедра/голени кости с щипцы и ножницы. Положите в чашку Петри с 5 мл 1 x фосфат амортизированное saline (PBS). Выполнить все процедуры в стерильных условиях.
    2. Оба конца большеберцовой кости/бедренной кости с ножницами в стерильных культуры ткани капюшоном разрезали
  2. . Сбросить кость с 25 G иглой с PBS + 2% плода бычьим сывороточным (ФБС) в 15 мл трубку.
  3. Центрифуга для клеток костного мозга в 500 x g, 4 ° C за 5 мин.
  4. Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл буфера lysis красных кровяных клеток в лизируют эритроцитов (РБК) для менее 1 мин развести сразу с ПБС 9 мл. Центрифуга снова, как в шаге 1.3. Декант supernatants.
  5. Ресуспензируйте Пелле клеток в 10 мл ПБС, фильтрации суспензии клеток через стерильную 40 мкм нейлона сетку в другую трубу 15 мл для удаления мусора/скопления клеток. Центрифуга снова, как и 1.3. Декант supernatants.
  6. Ресуспензируйте Пелле клеток в 15 мл Розуэлл парк Мемориальный институт средних FBS (RPMI) 1640 с 5% и 10 мкг/мл гентамицин, плита клетки культуры ткани 100-мм блюдо на 37 o C инкубатор для 60 минут аккуратно водоворот блюдо, вывезти плавающей клетки и считать их.
  7. Пластина 6 x 10 6 клеток в 100-мм блюдо с 12 мл макрофагов, дифференцируя СМИ (RPMI 1640 с 5% FBS и гентамицин 10 мкг/мл, смешанного с 30% L929 кондиционером СМИ 10) с 10 нг/мл рекомбинантных мыши макрофагов колониестимулирующий фактор (M-CSF) за 2 дня.
  8. После культивирования для 2 дней с 5% CO 2 в инкубаторе 37 ° C, кормить каждое блюдо с 6 мл свежего макрофагов, дифференцируя СМИ с 10 нг/мл M-CSF.
  9. На 5 день, взять 8 мл старые средства массовой информации, не нарушая клетки и добавить 10 мл свежего макрофагов, дифференцируя СМИ с 10 нг/мл M-CSF.
  10. На 7 день, урожай костного мозга-производные макрофагов (BMDMs) с использованием клеток стеклоподъёмника.
    Примечание: Прилагаемый макрофаги можно также отделить с 5 мл 1 мм ЭДТА в PBS 1 x 5-10 мин после удаления клеток поплавок и мойки плита дважды с 5 мл ПБС. Центрифуга клетки как в шаге 1.3., Ресуспензируйте их в свежих макрофагов, дифференцируя СМИ и считать их с Горяева.
    1. Подтверждение BMDMs ' фенотип подачей cytometry как описано 5. Подготовить производного мыши макрофагов в определенной концентрации для следующих исследований.

2. BSA-жирные кислоты конъюгат подготовка

  1. Подготовка 2 мм BSA в стерильных PBS. Например, весят 6.65 г BSA, добавить PBS 1 x 30 мл развести, затем добавить больше PBS до 50 мл, масштабирование компонентов сделать 2 мм BSA в однократном ПБС.
  2. Подготовка 5 мм отдельных натриевой соли жирных кислот в 2 мм BSA. Нагрейте до 37 ° C или выше, при необходимости и sonicate смесь 2 мм BSA и натриевой соли жирных кислот, до тех пор, пока получено четкое решение.
    Примечание: По сравнению с ненасыщенные жирные кислоты, насыщенные жирные кислоты нужна более высокую температуру и более sonication время для растворения.
  3. Фильтр-BSA жирные кислоты раствор через 0,22 мкм фильтр, Алиготе его в 1,5 мл стерильного microcentrifuge трубы и хранить их на 4 ° C для краткосрочного использования или при-20 ° C для долгосрочного хранения. После хранения при температуре 4 ° C в холодильнике должно соблюдаться без осадков.

3. Насыщенные жирные кислоты побудить клеток смерть от мыши костного производные макрофаги

  1. тарелка BMDMs в пластине 24-ну тканевые культуры с 0,4 х 10 6/мл в макрофагов, дифференцируя СМИ.
  2. Лечения клетки с 0,4 мм пальмитиновая и стеариновая кислоты для 16-24 ч при 37 ° C инкубатор с 5% CO 2. Используйте BSA как отрицательный контроль.
  3. Урожай клетки с ячейки стеклоподъёмника после лечения и спин вниз клетки на 500 x g, 4 ° C за 5 мин.
  4. Пятно клетки с Annexin V-Alexa 488 и 7-aminoactinomycin D (7-AAD) в 100 мкл annexin V привязки буфер для 15 мин при комнатной температуре.
  5. Развести образца с 200 мкл буфера annexin привязки, осторожно перемешать, а затем сохранить образцы на льду после инкубационного периода.
  6. Анализировать поток цитометрии 5 окрашенных клеток как можно скорее. Annexin V-Alexa 488 обнаруживается в канале FITC и 7-AAD обнаруживается в PerCP/PerCP-Cy5.5 каналом.

4. Внутриклеточные Церамид окрашивание

  1. после лечения жирной кислоты, урожай клетки как шаг 3.3. Тогда исправить ячейки в параформальдегида 4% на 30 мин
  2. Мыть образца с 1 мл ПБС, спина вниз как шаг в 3.3 и сцеживаться супернатант.
  3. Запятнать клетки с анти Церамид основное антитело (разбавления 1: 200) в буфер permeabilization 1 x 100 мкл на 30 мин
  4. Стирки и отжима вниз клетки снова, как в шаге 4.2.
  5. Запятнать клетки с анти мыши IgM вторичное антитело (разбавления 1: 500) в буфер permeabilization 1 x 100 мкл на 30 мин
  6. Стирки и отжима вниз клетки снова, как в шаге 4.2. Добавить 250 мкл ПБС и анализировать окрашенных клеток, поток цитометрии 5.
    Примечание: Список подробных реагента в таблице оборудования и реагентов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Ожирение увеличивает концентрации свободных жирных кислот в сыворотке. Как профессиональные фагоциты макрофаги активно занимают жирных кислот для поддержания гомеостаза хост. В ходе этих процессов перегруженных липидами может вызвать гибель клеток макрофагального. С этой целью мы культивировали BMDMs в пробирке с ожирением уровни пищевых жирных кислот и гибели клеток измеренных макрофагов с помощью потока гранулярных пятнать. По сравнению с контролем BSA, насыщенных жирных кислот...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Надлежащей подготовки жирные кислоты раствор имеет решающее значение для изучения биологической функции жирных кислот. Нейтрализация жирные кислоты увеличивает его растворимости в водном растворе. Однако натриевые соли жирных кислот, особенно насыщенных жирных кислот, по-прежнему низкой растворимостью в воде или PBS как мы наблюдали. Одним из методов является использование этанола 95-100% чтобы помочь распустить жирные кислоты1. С помощью этого метода, более высокой токсичностью для клеток может н...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют нет финансовых конфликтов интересов.

Благодарности

Эта работа была частично поддерживается фондами начальный Луисвиллский университет и Национальный институт рака (Бетесда, MD) предоставляет R01CA177679, R01CA180986.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ультразвуковая ванна CPX БрэнсоникМодель 2800
Пальмитат натрия (PA)Nu-Chek Prep, Inc.S-1109M.W. 278
Стеарат натрия (SA)Nu-Chek Prep, Inc.S-1111M.W. 306
Бычий сывороточный альбумин (БСА), без жирных кислотFisher Scientific9048-46-8
Мышиный макрофагальный колониестимулирующий фактор (mM-CSF) Технология клеточной сигнализации,  Inc.5228
RPMI 1640VWR International71002-878
Аннексин V, Alexa Fluor 488 конъюгатFisher ScientificA13201
7-AADBD Biosciences559925
Моноклональные антикерамидные антитела (мышиный IgM)SigmaC8104-50TSTКлон: MID 15B4
Козье антимышиное антитело IgM, и микроцепь, FITC конъюгатSigmaAP128F
Фиксирующий буферBiolegend420801
Пермеабилизационный буферEbioscience4307693
Буфер для лизиса эритроцитов Сигма11814389001
Аннексин V связывающий буферBD Biosciences556454
L929 клеткиATCCCCL-1
Corning  Клеточный лифтер Fisher Scientific07-200-364
Примечание: M.W. относится к молекулярной массе.

Ссылки

  1. Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774). Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).
  2. Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis. J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).
  3. Penn, A. H., Dubick, M. A., Torres Filho, I. P. Fatty Acid Saturation of Albumin Used in Resuscitation Fluids Modulates Cell Damage in Shock: In Vitro Results Using a Novel Technique to Measure Fatty Acid Binding Capacity. Shock. , (2017).
  4. Vusse, G. J. Albumin as fatty acid transporter. Drug Metab Pharmacokinet. 24 (4), 300-307 (2009).
  5. Zhang, Y., et al. Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production. J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).
  6. Zhang, Y., et al. Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet. Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).
  7. Wen, H., et al. Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling. Nat Immunol. 12 (5), 408-415 (2011).
  8. Zhang, Y., et al. Fatty acid-binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFN-beta responses in tumor-associated macrophages. Cancer Res. 74 (11), 2986-2998 (2014).
  9. Ulloth, J. E., Casiano, C. A., De Leon, M. Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells. J Neurochem. 84 (4), 655-668 (2003).
  10. Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. , (2008).
  11. Dansen, T. B., et al. High-affinity binding of very-long-chain fatty acyl-CoA esters to the peroxisomal non-specific lipid-transfer protein (sterol carrier protein-2). Biochem J. 339 (Pt 1), 193-199 (1999).
  12. Ulloth, J. E., et al. Characterization of methyl-beta-cyclodextrin toxicity in NGF-differentiated PC12 cell death. Neurotoxicology. 28 (3), 613-621 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

BSAV
Насыщенные жирные кислоты вызывают Церамид связанные макрофагов клеточной смерти
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.