Анализ иммунокомпетентных клеток в одном седалищного нервов и спинной корень ганглия от одной мыши с помощью проточной цитометрии

Краткое содержание

Количественный анализ содержимого ячейки в пределах мышиных седалищного нерва трудно из-за нехватки ткани. Этот протокол описывает метод для ткани пищеварения и подготовки, которая обеспечивает достаточную клетки для анализа потока цитометрии иммунных клеток населения от нервов отдельных мышей.

Аннотация

Иммунные клетки нерва резидент в периферической нервной системы (ПНС) имеют важное значение для поддержания целостности нейронов в здоровой нерва. Иммунные клетки ПНС страдают от травм и болезней, влияющих на функции нервов и способности к регенерации. Нейрональные клетки иммунной системы обычно анализируются иммунофлюоресценции (если). А если это важное значение для определения местоположения иммунные клетки нерва, если только полуколичественного и метод ограничивается количество маркеров, которые могут быть одновременно исследовано и степень поверхности выражения. В этом исследовании проточной цитометрии был использован для количественного анализа лейкоцитарной инфильтрации в седалищного нервов или спинной корень ганглиев (ДРГ) отдельных мышей. Был проведен анализ одной ячейки, используя DAPI и некоторые белки были проанализированы одновременно для поверхности или внутриклеточных выражения. Обе седалищного нервов от одной мыши, которые рассматривались согласно протоколу созданы ≥ 30.000 один ядерных событий. Количество лейкоцитов в седалищного нервов, определяется выражением CD45, был около 5% от содержания общей ячейки в седалищный нерв и примерно 5-10% в DRG. Хотя этот протокол фокусируется главным образом на иммунных клеток населения в рамках ПНС, гибкость проточной цитометрии измерить количество маркеров одновременно означает, что население клетки, находящиеся в нерва, например Шванновские клетки, pericytes , фибробластов и эндотелиальных клеток, могут также быть проанализированы с помощью этого метода. Поэтому этот метод предоставляет новые средства для изучения системных эффектов на ПНС, таких как neurotoxicology и генетической модели нейропатии или хронических заболеваний, таких как диабет.

Введение

Иммунные клетки, которые заходят ПНС из обращения, как определяется выражением CD45 и CD11b, помогают поддерживать целостность нерва и играть определенную роль в регенерации и дегенерации¹. Макрофаги (определяется их выражение CD68 мыши) может перекос в сторону воспалительных фенотип, выражая больше MHC класса II и CD86 на их поверхности (M1), или к противовоспалительным фенотипа, выражая более внутриклеточных CD206 (м2)² . Наклон макрофагов фенотипа представляет собой динамичный процесс, регулируется через Akt сигнализации³, отражающий различные задачи макрофагов в обороне против патогенов (M1) и роль в регенерации тканей (м2). Регенерация потерпевшего нерва сначала требует фагоцитоза миелина мусора макрофагами в нерв^4,5и противовоспалительными (CD68⁺CD206⁺) м2 макрофагов, было показано, содействовать аксона нарост в ПНС⁶. Сокращение вербовки или макрофагами к ПНС, или нарушение способности для фагоцитоза может привести к нарушения регенерации и поддержание целостности нерва. Воспалительные M1 макрофагов, выражая гистосовместимости, менее способны фагоцитоза чем м2 макрофагов, и нейрональных воспаление вовлечено в патогенезе нескольких нейродегенеративных заболеваний⁷.

Изменения, которые происходят для резидентов иммунной системе нерва вследствие повреждения могут быть количественными, проявляется в потере CD45⁺ лейкоциты (или увеличить проникновение CD45⁺ лейкоциты в случае воспаления), или качественной, такие как изменение фенотипа макрофагов с м2 для M1 фенотип. Иммунные клетки ПНС традиционно были проанализированы с помощью если, использование замороженных секций или парафин врезанных материала⁸. Если требуется для определения локализации клеток интерес. Однако количественная оценка с использованием если часто опирается на подсчет сравнительно небольшое количество клеток в узкой части ткани, делая количественной оценки, ненадежны и подвержены систематическая. Для идентификации конкретных подмножеств иммунных клеток одновременного обнаружения внеклеточные и/или внутриклеточных маркеров требуется, в то время как определение фенотипа макрофагов, требует по крайней мере по крайней мере двух маркеров, специально CD206 и MHC класс II. Как чаще всего доступны Микроскопы ограничены по крайней мере двух цветовых каналов, таких как флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC) и фикоэритрин (PE), квалификация определенных подмножеств иммунных клеток, если может быть ограничительным и неполными, требующих необходимость иметь несколько слайдов, полученные из той же области интереса, которые витражи и проанализированы параллельно. Этот аспект требует много времени, поэтому не необходимости поддается анализу комплектов больших образцов. Кроме того поскольку большинство из маркеров интерес внеклеточная, обнаружения в ткани, который либо встроен в парафин или криоконсервированных, может быть проблематичным из-за нарушения целостности мембраны и маскировки epitopes, а также потери антигены интерес от использования растворителей, например, ацетон и метанола⁹.

В противоположность этому, проточная цитометрия, который измеряет оптических и флуоресценции характеристики единичных клеток в суспензии, как они проходят через луч света, обеспечивает более практическим и комплексным средством для анализа клеточных популяций. Проточной цитометрии, вместо того, чтобы производить цифровое изображение ткани, обеспечивает автоматизированный количественная оценка установленных параметров, которые включают относительный размер ячейки и отражающая индекс, называют вперед точечной (FSC), гранулярность/внутренние сложности или сторона точечной (SSC) и относительной флуоресценции интенсивности, обеспечивая, что ячейки был назван с соответствующей Флюорофор, таких как конъюгированных антител. Типичная проточный цитометр состоит из двух, воздушного охлаждения лазеров; Аргоновый лазер производит синий свет в 488 нм и гелий неоновый лазер производит свет в 633 нм. Эта комбинация позволяет для обнаружения и измерения, одновременно, по крайней мере пять целей на поверхности или внутри внутриклеточного отсек. Более продвинутые цитофлуориметрами поток может состоять из нескольких лазеров, которые позволяют для обнаружения до восьми различных флуорохромов одновременно, обеспечивая, что пик выбросов волн выбранного флуорохромов значительно не перекрываются.

Для анализа подачей cytometry, ткани интерес должны сначала быть ферментативно переваривается, обычно с коллагеназы, чтобы генерировать одну ячейку подвеска. Анализ мышиных седалищного нервов ранее был затруднен из-за небольшого количества ткани, полученные из каждой мыши. Кроме того высокое содержание жира миелина вокруг аксоны препятствует восстановлению клеток и производит большое количество мусора. Метод, описанный здесь для подготовки седалищного нерва и пищеварение было адаптировано из клеток Шванн изоляции протокола заколка et al. ⁷и стремится изолировать достаточно клетки от нервов отдельных мышей для анализа цитометрия потоков, с тем чтобы уменьшить различия между мышей. С помощью DAPI для идентификации одного клеток в сырой ткани дайджест обходит необходимость удаления мусора аксона, который часто приводит к потере клеток. Стиральная несколько раз с моющих средств богатые буфера СПИДом в выпуске клеток в ловушке внутри жирной мусора, тем самым увеличивая урожайности. Пищеварение обеих полнометражного седалищного нервов от одной мыши согласно протоколу генерирует ≥30, 000 одной ядерных событий и по крайней мере 3 раза это число было извлечено от DRG. Доля CD45⁺ лейкоциты был приблизительно 5% из всего содержимого в дайджест седалищного нерва и примерно 5-10% в дайджест DRG. Большинство CD45⁺ клетки в седалищный нерв выразили маркеры макрофагов, CD68 и CD206.

Протокол

Мышей C57BL/6 одичал типа (самцы; 10-12 недель) хранились в стандартных 12 h свет/темно цикла и получили свободный доступ к стандартным Чоу диеты и воды. Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами соответствующих местных животных уход и использование Комитетом и утверждены местных животных уход и использование Комитета на региональной власти в Карлсруэ, Германия (G216/10).

1. перфузии мыши

1. Жертвоприношение мыши (C57BL/6; Мужчины; 10-12weeks) с использованием CO₂ или в соответствии с местными правилами.
   Примечание: Ретро орбиталь кровотечение может быть проведена для получения контроля лейкоцитов, используя ЭДТА покрытием 1.5 мл пробирок. Этот метод кровотечения эффективен только сразу же после жертвоприношения. Кроме того, перитонеальная полость промывание (PCL) может выполняться для получения контроля макрофагов, используя подогретую PBS при 37 ° C, чтобы избежать холодной агглютинации крови, что может помешать перфузии.
2. Продезинфицируйте мыши путем распыления мех на животе обильно с 70% v/v этанола и неоднократно вытирая салфеткой с хлопчатобумажной марли. С помощью тупыми ножницами, разрезали брюшной кожи на продольный разрез.
3. Разоблачить плевральной полости, первый сделав надрез в диафрагму изогнутые, тупыми ножницами, а затем расширение разрез вдоль всей длины грудной клетки. Сделайте же разрез на контралатеральную сторону до тех пор, пока грудины может быть тщательно снят прочь.
4. С четкое представление сердца и крупных сосудов Вставка бабочка 23¾ манометра, подключенных к 50 мл шприц заполняют с ледяной PBS, левого желудочка сердца.
5. Надрезают правого предсердия сердца с помощью Ирис ножницы для создания как большие розетки как можно без ущерба для нисходящей аорты, а затем осторожно отпустите шприц протолкнуть приблизительно 30 мл ФСБ. Экссудат следует установить четкие. Очистка печени или почек может использоваться в качестве показателя хороший перфузии.

2. рассечение седалищного нерва и DRG

Примечание: Для рассечение седалищного нервов кожи выше ягодиц Максимус удаляется и мышь расположены вентральной стороне вниз время протягивая нижних конечностей.

1. На двустороннем уровне вскрыть всю седалищного нервов, разделив мышечной ткани от дорсальной бедро и следить нерв вдоль позвоночника. Вырежьте нерва, где он выходит из позвоночника и сразу же выше колена на другом конце.
   Примечание: Избегайте чрезмерного обработки нерва как дробление или потянув с щипцами.
2. С помощью щипцов, передачи подакцизным nerve(s), приблизительно в 2 см в нерва, до 1,5 мл трубка, содержащая 1 мл ледяной PBS и магазин на льду.
   Примечание: Нерва могут быть сохранены на ночь на льду.
   Примечание: Для DRG рассечение, используя пинцет и скальпеля, снимите кожу от базовой мягких тканей, мягко пилинг покинуть оставшиеся задней кожи подвергать шейного, грудного и поясничного отделов позвоночника регионов. Удалите головы, отрезав у основания черепа, используя пару тупыми ножницами.
3. Вырежьте ребра параллельно с и недалеко от позвоночника с обеих сторон, перед отсоединением внутренностей подключен к передней стороне позвоночника. Вырезать бедра и удалить позвоночник, поперечная, разрезать на уровне бедра. С помощью ножниц Ирис, отрежьте любые мышц, жира и других мягких тканей от позвоночника.
4. Место позвоночного столба спинной стороной вверх и откройте его, начиная с хвостового конца, сдвинув один подсказки ножниц в позвоночного канала в три часа позиции и кости snipped. Повторите процедуру на девять часов.
   Примечание: Важно вырезать точно в центре, чтобы избежать повреждения DRG.
5. Повторите резки из стороны в сторону до тех пор, пока достигнут ростральной конец и спинного мозга, полностью подвергается. С помощью микроскопа рассечение, удалите спинного подвергать спинномозговых нервов, которые могут быть использованы для поиска ДРГ внутри позвоночника.
6. Удалите поясничного ДРГ, нежно дергая на спинной корень тянуть DRG в позвоночный каналов, затем отсечения нервы и соединительной ткани с диафрагмой ножницы, чтобы удалить ГДК.
   Примечание: Это можно ограничить коллекцию в L4-L6 DRG, которые способствуют седалищного нерва.
7. С помощью щипцов, передать 1,5 мл, содержащие примерно 1 мл ледяной PBS ДРГ и хранить на льду.
   Примечание: Нерва могут быть сохранены на ночь на льду.

3. пищеварение седалищного нерва и DRG

1. Подготовьте пищеварение СМИ (DMEM, 10 мм HEPES, 5 мг/мл BSA, коллагеназа 1,6 мг/мл тип 4) дополняется 100 мкг/мл дезоксирибонуклеаза, и магазин на льду.
   Примечание: Количество пищеварения среды требуется на мышь (седалищный нервы + ДРГ)-1 мл. После подготовки аликвоты пищеварение средства массовой информации могут храниться при температуре-20 ° C.
2. Перевести седалищного нервов и ДРГ с одной мыши на отдельные 1,5 мл пробирки, содержащие 500 мкл пищеварение средства массовой информации. Для седалищного нервов нарезать материал на 15-20 штук с помощью ножниц весной и затем инкубировать ткани суспензий в тряску инкубатора при 37 ° C 20 мин с нежным агитации (≤ 450 об/мин).
3. Неоднократно нарезанных суспензию клеток через 1000 мкл наконечник пипетки для механически отделить любой неполностью переваренной ткани.
   Примечание: Если подвеска трудно титровать, затем вырежьте кончик пипетку с ножницами для создания тупой конец. Инкубируйте подвеска ткани при 37 ° C в течение 20 мин с нежным агитации (≤ 450 об/мин).
4. Повторите Тритурация через 1000 мкл наконечник пипетки и инкубировать в течение еще 10 минут при 37 ° C с нежным агитации (≤ 450 об/мин).
5. Подготовьте буфере СУИМ (PBS с ЭДТА 10% FCS и 1 мм) и хранить на льду. Промыть и замочить экран из нержавеющей стали с сетки размером 140 мкм с СУИМ буфера в 60 x 15 мм Петри на льду.
   Примечание: Нейлон фильтры следует избегать, поскольку это приводит к значительной потере урожайности ядерных клеток.
6. Неоднократно пройти суспензий ткани 140 мкм сетчатый фильтр, как она проходит над Петри, с тупым щипцами, на льду. Собирать суспензию клеток от Петри и перенести его на новый 1,5 мл трубки, хранящиеся на льду.
7. Нажмите любой неполностью переваренной ткани, которая остается на фильтр через повторяющиеся Тритурация с кончиком пипетки 1000 мкл. Промойте фильтр экране дважды с 500 мкл буфера СУИМ и собирать результирующий суспензию клеток в Петри сочетать с суспензию клеток из шага 3.6.
   Примечание: Если проточный цитометр используется чувствителен к мусора, суспензию клеток от шага 3.7 могут передаваться через сетчатый фильтр 70 мкм; Однако это может привести к потере урожайности ядерных клеток.
8. Центрифуга для клеточных суспензий на 300 g x 5 мин при 4 ° C. Отменить супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл буфера СУИМ. Повторите этот шаг Стиральная один раз.
9. Ресуспензируйте Пелле клеток в 150-350 мкл буфера СУИМ, зависящ на количество окрашивание, которые требуется (150 мкл СУИМ буфера на окрашивание группа).

4. Окрашивание седалищного нерва и DRG с дневно обозначенные антитела для проточной цитометрии

1. Перевести 100 мкл седалищного нерва или суспензию клеток DRG в V-образный хорошо в 96-луночных пластины на льду.
   Примечание: Сингл окрашенные клетки необходимы для всех антитела, которые используются как они будут предоставлять необходимые элементы управления для настройки проточной цитометрии трубки (ПЛТ) фотоэлектронный умножитель напряжения ГАИНС и компенсации, а также того, чтобы помочь отличить от конкретных без конкретной привязки. Из-за ограниченного материала от седалищного нерва и ДРГ, крови лейкоциты и макрофаги от PCL (шаги 1.1-1.2) могут использоваться как элементы управления сингл витражи, окрашивание для которого должно выполняться параллельно с окрашивание седалищного нерва и ГДК.
2. Бассейн остальные клетки суспензий (примерно 50 мкл на сэмпл) из седалищного нервов или DRG образцы, чтобы служить неокрашенных управления.
3. Центрифуга пластину на 400 g x 5 мин при 4 ° C. Отменить супернатанта, инвертирование пластину за Бен и применяя резким движением запястья и аккуратно коснитесь сухой на бумажные полотенца.
4. Для окрашивания поверхностей, Ресуспензируйте каждой ячейки гранул в 20 мкл буфера СУИМ, содержащий антитела интерес (CD45-A647, CD11b-PerCP/Cy5.5 и MHC класса II-биотин) и инкубировать, защищенном от света, на льду за 30 мин.
   Примечание: (1 оптимальное антитела разрежения должны быть определены до использования, выполнив серию разрежения согласно информации о продукте производителя; (2) неспецифические stainings может быть уменьшена путем инкубации с Fc блок на этот шаг, в соответствии с инструкциями производителя; и (3) изотипа управления stainings, как правило, не требуется при использовании первичного антитела, непосредственно сопряженных с Флюорофор и/или когда производят antigen(s) интересов различных групп населения.
5. 130 мкл буфера СУИМ в каждой скважине и центрифуги пластину на 400 g x 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатанта как описано (шаг 4.3) и мыть ячейки гранулы дважды с 150 мкл буфера СУИМ.
   Примечание: При использовании неконъюгированной основное антитело или основное антитело проспряганное биотина, затем соответствующие вторичные реагент, конъюгированных с Флюорофор, могут быть добавлены в этот момент и повторяются шаги 4.4-4.5. В случае этот протокол стрептавидина PE/Cy7 или стрептавидина-PerCP использовался для выявления MHC класса II в сочетании с CD45-A647/CD11b-PerCP/Cy5.5, или в сочетании с CD68-APC и F4/80-PE/Cy7, соответственно.
6. Для фиксации, после последнего шага Стиральная Ресуспензируйте клетки окатышей в 100 мкл параформальдегида 4% в PBS (рН 7,4). Инкубировать пластину на льду за 10 мин и затем центрифуги на 400 g x 5 мин при 4 ° C. Отбросить супернатанта как описано выше (шаг 4.3) и мыть ячейки окатышей с 150 мкл буфера СУИМ.
   Предупреждение: Параформальдегида токсичен; Носите надлежащей защиты как перчатки и очки, и т.д.
   Примечание: Ресуспензируйте клетки окатышей в 150 мкл буфера СУИМ и защищенное от света, при температуре 4° C на срок до двух дней. Если требуется не внутриклеточных окрашивание, затем перейдите к шагу 4.11 после центрифугирования пластину на 400 x g 5 мин при 4 ° C.
7. Для внутриклеточного пятнать, Ресуспензируйте клетки окатышей в 150 мкл СУИМ buffer+0.5% моющее средство и инкубации при комнатной температуре, защищенный от света на 15 мин центрифуги пластину на 400 x g 5 мин при 4 ° C. Отбросить супернатанта как описано выше (шаг 4.3) и мыть ячейки лепешка однажды с 150 мкл буфера СУИМ + 0,5% моющего средства. Ресуспензируйте Пелле клеток в 20 мкл СУИМ buffer+0.5% моющих средств содержащих антитела интерес (CD68-APC, CD206-PE) и инкубировать, защищенном от света, при комнатной температуре за 30 мин.
8. 130 мкл СУИМ buffer+0.5% моющее средство для каждой скважины и центрифуги пластину на 400 g x 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатанта как описано (шаг 4.3) и мыть ячейки гранулы дважды с 150 мкл буфера СУИМ + 0,5% моющего средства.
   Примечание: При использовании неконъюгированной основное антитело или основное антитело проспряганное биотина, затем соответствующие вторичные реагент, конъюгированных с Флюорофор, могут быть добавлены в этот момент и повторить шаги 4.9-4.10.
9. Ресуспензируйте клетки окатышей в 150 мкл буфера СУИМ + 0,5% моющего средства и магазин, защищенный от света, при температуре 4 ° C на срок до двух дней.
10. Ресуспензируйте клетки окатышей с 150 мкл буфера СУИМ + 0,5% моющего средства, дополнена 5 мкг/мл DAPI и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре, защищенный от света. Центрифуга пластину на 400 g x 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатанта как описано выше (шаг 4.3).
11. Ресуспензируйте клетки окатышей в 150 мкл PBS и передачу соответствующей маркировкой СУИМ трубки. Хранить при комнатной температуре, защищенный от света, пока готовы для анализа.
    Примечание: После взмучивания в PBS, клетки должны быть проанализированы в течение часов, поскольку DAPI будет медленно отмежеваться от ДНК, приводя к потере сигнала.

5. установки проточной цитометрии и запуск образцов

1. Убедитесь, что проточный цитометр оснащен соответствующим лазеры и/или фильтр задает для измерения флуорофоров, используемый для запятнать клетки. Это может быть определено цитометр конфигурация по умолчанию в системе. В случае этот протокол, клетки были проанализированы с помощью проточный цитометр, оснащен тремя лазеры (405 нм, 488 нм и 633 нм) позволяет для обнаружения ≤ 5 флуорофоров.
2. Выберите соответствующие каналы для обнаружения флуорофоров интерес. Лучше всего все флуоресцентные сигналы обнаруживаются с Логарифмические усилители.
3. Выберите соответствующий расход для образцов. Этот параметр может меняться в зависимости от системы, используемой и следует определить эмпирически. В случае этот протокол скорость потока MED-HI (35-60 мкл/мин) был использован для предотвращения засорения иглы.
4. Выберите общее количество событий/клетки, чтобы быть собраны на сэмпл. Минимальное количество событий должно быть 1 000 000.
5. Создание точечной участки под глобальной лист SSC-a по сравнению с FSC-A, а также для каждого Флюорофор интерес по сравнению с FCS-A. Создайте представление статистики, которая будет отображать количество событий и средней интенсивности флуоресценции (МФО) для выбранного флуорофоров.
6. Установите напряжение FSC-A и SSC-A каналов, таким образом, что маленьких клеток вписываются в нижнем левом 10% точечной. Определите, фон флуоресценции и флуоресценции минимальной выборке из неокрашенных элементов управления из седалищного нервов или ДРГ. Определение родительского (P1) ворота основанные на разброс участок от DAPI-только окрашивание элементов управления.
   Примечание: Это не коллекции ворот, из-за частично, неоднородный характер населения DAPI + в ПНС.
7. Использование точечной FSC участков для каждого из флуорофоров интерес, отрегулировать напряжение, так что клетки неокрашенных управления входят в нижней четверти их разброс соответствующих участков. Выше этого региона определить те клетки, которые являются позитивными для каждого из соответствующих маркеров/флуорофоров затем создаются ворота. Размещение ворот подтверждается запуска сингл окрашенных управления (шаг 4.1).
   Примечание: Компенсация за перекрывающиеся спектры выбросов может быть выполнена на данный момент или применяется ретроспективно с программным обеспечением надлежащего анализа.
8. После того, как был создан проточный цитометр, как описано, можно запустить образцы.
9. После запуска оставшиеся образец материала может быть отброшен и ФТС файлы могут быть экспортированы для дальнейшего анализа.

Результаты

Клеточных суспензий из полнометражных седалищного нервов и всех основных DRG были подготовлены, согласно протоколу, от шести здоровых мышей C57BL/6 и разделен на три равных аликвоты для окрашивания. Счетчик, окрашивание с DAPI, который пятна ДНК, позволяет для обнаружения населения одну ячейку (рис. 1A–B, верхняя группа). Вымывание DAPI до анализа подачей cytometry, уменьшилась до такой степени интенсивности флуоресценции мус...

Обсуждение

Седалищный нервы содержат большое количество липидов, таких как холестерин, благодаря содержанию миелина вокруг аксоны. Поскольку с температуры изменяются свойства липидов, различные результаты могут быть получены при разных температурах. Для обеспечения сохранения клеток, на льду были выполнены все действия в этом протоколе после переваривания. Хотя согласованности рекомендуется ради воспроизводимость результатов, это может быть возможным увеличить урожайность, выполнив шаги, 3,6 и 3,7 при комнатной температуре. Если не...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
C57BL/6 Мышь	Чарльз Ривер	C57BL/6NCrl
DMEM (+1 г/л глюкозы, глутамин, пируват)	Термо	31885023	Источником этого материала не является
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Бычий сывороточный альбумин (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Коллагеназа типа 4	Worthington Biochemical Corp., США
Дезоксирибонуклеаза (ДНКаза) I из поджелудочной железы крупного рогатого скота I	Sigma-Aldrich	DN25-1g
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)	Sigma-Aldrich	E6758
Эмбриональная сыворотка теленка (FCS), инактивированное при нагревании	Sigma-Aldrich	F4135
против CD11b-PerCP/Cy5.5	Biolegend	101228	клоне M1/70
Антитело против MHC класса II, биотинилированное	Biolegend	107603	Клон M5/114.15.2
Антитело против CD45-A647	Biolegend	107603	Клон 30-F11
Антитело против CD68-APC	Biolegend	137007	Клон FA/11
Антитело против CD206-PE	Biolegend	141706	Клон C068C2
Антитело против F4/80-PE/Cy7	Biolegend	123113	Клон BM8
Streptavidin-PE/Cy7	Biolegend	405206	Используется для обнаружения MHCII-биотина с CD45-A647 и CDllb-PerCP/Cy5.5
Streptavidin-PerCP	Biolegend	405213	Используется для обнаружения MHCII-биотина с CD68-APC и F4/80-PE/Cy7
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-1MG	Разбавьте в PBS до 50x и храните при 4° C in the dark
Сито для диссоциации клеток - набор для измельчения тканей	Sigma-Aldrich	CD1
V-образный, 96-луночные планшеты	Greiner/Sigma	M8185
5мл полистриеновая трубка с круглым дном, 12x75 мм	BD Biosciences	352008
60x15 мм чашка	Петри Greiner/Sigma	Z643084
BD LSR II Проточный цитометр	BD Biosciences