Method Article

Одновременное отображение и количественный Ribonucleotides в митохондриальной ДНК человека

DOI:

10.3791/56551

⸱

November 14th, 2017

 ,  , 
1Department for Medical Biochemistry and Cell Biology, University of Gothenburg, 2Department of Biology and Biological Engineering, Chalmers University of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем метод поддаются одновременно quantitate и карты генома всей ribonucleotides в высоко нетронутыми ДНК в резолюции единого нуклеотидом, сочетая ферментативного расщепления геномной ДНК с щелочной гидролиз и последующего 5´ конец последовательности.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Установленные подходы к оценить количество ribonucleotides в геноме ограничиваются количественный включены ribonucleotides с использованием коротких синтетических фрагментов ДНК или плазмиды как шаблоны и затем экстраполировать результаты в целом геном. Кроме того количество ribonucleotides в геном может быть определена с помощью щелочной гели или Южные помарки. Более недавние подходы в естественных условиях используют следующего поколения виртуализации, позволяя Картирование генома широкий ribonucleotides, обеспечивая положение и личность встроенных ribonucleotides. Однако они не позволяют количественный количество ribonucleotides, которые включены в геноме. Здесь мы опишем, как одновременно карта и quantitate количество ribonucleotides, которые включены в человека митохондриальной ДНК в естественных условиях путем sequencing следующего поколения. Мы используем очень нетронутыми ДНК и ввести последовательность конкретных двойной нити перерывы, переваривание с эндонуклеазы, впоследствии гидроизолирующей включены ribonucleotides щелочью. Сгенерированный концы лигируют с адаптерами и эти концы виртуализируются на компьютере виртуализации нового поколения. Абсолютное количество ribonucleotides может быть рассчитана как количество операций чтения за пределами сайта признание за среднее количество операций чтения на сайте признание для конкретных эндонуклеазы последовательности. Этот протокол может также использоваться для сопоставления и quantitate бесплатные Никс в ДНК и позволяет адаптации для сопоставления других повреждений ДНК, которые могут быть обработаны 5´-OH концы или 5´ фосфат заканчивается. Кроме того этот метод может применяться к любой организм, учитывая, что подходящую ссылку генома доступен. Таким образом, этот протокол обеспечивает важным инструментом для изучения репликации ДНК, 5´ конец обработки, повреждение ДНК и репарации ДНК.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В эукариотической клетке концентрация ribonucleotides (rNTPs) намного выше, чем концентрация deoxyribonucleotides (дНТФ)1. Полимераз дискриминировать ribonucleotides, но эта дискриминация не является совершенным, и, как следствие, ribonucleotides вместо deoxyribonucleotides могут быть включены в геномах во время репликации ДНК. Ribonucleotides может быть наиболее распространенных неканонических нуклеотидов, включены в геноме2. Большинство из этих ribonucleotides удаляются во время созревания фрагмент Окадзаки РНКазы H2 начатый рибонуклеотид иссечение ремонт (RER) или топоизомеразы 1 (обзор в ссылку3). Ribonucleotides, которые не могут быть удалены остаются стабильно включены в ДНК2,4 и может повлиять на его вредных и полезных способов (обзор обзор5). Помимо возможности действовать в качестве позитивных сигналов, например в спаривания тип переключения в делящиеся pombe6 и маркировки зарождающейся стренге дна во время несоответствие ремонт (MMR)7,8, ribonucleotides влияет на Структура9 и стабильность окружающих ДНК из-за 2´ гидроксильные группы их рибозы10привело репликативной стресс и геном нестабильность11. Обилие ribonucleotides в геномной ДНК (геномная ДНК) и их актуальности в репликации и ремонту механизмов, а также последствия для стабильности генома, дают основания для расследования их точное вхождение и частоты в геном всей манере.

РНКазы H2 деятельности не были найдены в человека митохондрии и ribonucleotides, поэтому не эффективно удаляются в митохондриальной ДНК (мтДНК). Несколько путей участвуют в поставках нуклеотидов в человека митохондрий и расследовать ли беспорядков в бассейне митохондриальной нуклеотидов вызывают повышенное количество ribonucleotides в митохондриальной ДНК человека, мы разработали протокол к карте и quantitate Эти ribonucleotides в человека мтДНК, изолированных от фибробласты, клетки HeLa и пациента клеток линии12.

Большинство в vitro подходы (обзор обзор13) для определения ДНК полимеразы избирательности против rNTPs основаны на одной рибонуклеотид вставки или праймер расширение экспериментов, где конкурирующие rNTPs включаются в реакции микс, позволяя идентификации или относительное количественный рибонуклеотид инкорпорации в нескольких шаблонах ДНК. Количественные подходы на коротких последовательностей могут не отражать dNTP и rNTP бассейны в концентрациях, сотовой и поэтому обеспечивают понимание полимеразы избирательности, не ограниченное значение относительно всей геномов. Было показано, что относительное количество ribonucleotides, включены во время репликации шаблон больше ДНК, например плазмида, могут быть визуализированы на геле виртуализации с помощью radiolabeled дНТФ и гидроизолирующей ДНК в щелочной среде14. Кроме того был проведен анализ геномная ДНК на Южные помарки после щелочной гидролиз, позволяя стренги зондирующего и определение абсолютного ставок рибонуклеотид инкорпорации в vivo15. Эти подходы позволяют относительное сравнение частоты включения, но доставить не понимание позиции или личность включены ribonucleotides. Более недавние подходы для анализа содержимого рибонуклеотид геномная ДНК в естественных условиях, как Хайден-Seq16, рибозы-Seq17, пу-Seq18или19emRiboSeq, воспользоваться преимуществами встроенного ribonucleotides чувствительность к щелочной или H2 РНКазы лечение, соответственно и использовать секвенирование нового поколения для выявления ribonucleotides генома общесистемной. Эти методы не обеспечивают понимание абсолютного включение частота обнаруженных ribonucleotides. Путем добавления шаг последовательности конкретных ферментативного расщепления Хайден seq протокол, метод, мы описали здесь удобно расширяет информацию, полученную от последовательности подхода, что позволяет одновременное отображение и количественный встроенных ribonucleotides12. Этот метод применим к практически любой организм, учитывая, что высоко нетронутыми ДНК экстракты могут быть созданы и подходящую ссылку генома доступен. Метод может быть адаптирована к quantitate и определить местонахождение любого поражение, которое может быть усваивается нуклеиназы и оставляет 5´ фосфат или 5´-OH-конец.

Карта и quantitate ribonucleotides в геномной ДНК, метод сочетает расщепления по последовательности конкретных эндонуклеазы и щелочной гидролиз генерации 5´ фосфат заканчивается на участках, где находится конкретное признание последовательности для эндонуклеазы и 5´- OH заканчивается в позиции, где находились ribonucleotides. Так как создаваемый свободные концы впоследствии лигируют с адаптерами и виртуализации с помощью виртуализации нового поколения, это важно использовать весьма нетронутыми ДНК и избежать случайных фрагментации во время подготовки ДНК добычи и библиотека. Оценки этих чтений, нормированный читает на участках расщепления эндонуклеазы позволяет одновременное количественный и сопоставление обнаруженных ribonucleotides. Бесплатные 5´ концы обнаруживаются в управления экспериментов, где щелочной гидролиз ДНК заменяется на лечение с KCl. Полученные данные дают представление о рибонуклеотид расположение и количество и позволяет анализ относительно содержания и включение частоты рибонуклеотид.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

этот протокол приводится на рисунке 1 и включает в себя изоляцию геномная ДНК, пищеварение с энзимами ограничения для того чтобы quantitate количество ribonucleotides, лечение щелочью для гидролизуют Фосфодиэфирная облигации ribonucleotides включены в геномная ДНК, фосфорилирование заканчивается свободной 5´-OH, лигирование ssDNA адаптеры, второй стренги синтеза и амплификации PCR до виртуализации.

1. Адаптеры и индекс праймеры

  1. получить ARC49, ARC140 олигонуклеотиды, ARC76/77, адаптер и ARC78-ARC107 индекс грунтовки (см. таблицу 1).
    Примечание: Олигонуклеотиды следует ВЭЖХ очищается. ARC76/77 отсортированы как дуплекс.
  2. Подготовить 100 мкм акций решения каждого олигонуклеотида в буфер Tris-ЭДТА (TE) (см. Таблицу материалы) и хранить при -20 ° с.
  3. Решения подготовить 10 мкм ARC67/77 и 2 мкм решения праймеров ARC49 и индекс путем разбавления в Элюирующий буфер (EB; см. Таблицу материалов). Хранить при температуре от-20 ° C.

2. Рост и урожай клетки

  1. растут НеЬа клетки в 70 мл Дульбекко ' s Modified Eagle среднего (DMEM) с 10% плода бычьим сывороточным в колбе Spinner 250 мл при 37 ° C.
  2. Подсчитать количество ячеек и собирать 5 х 10 6 клеток в 50-мл, центрифуги для 5 минут при 200 x g и отбросить супернатант.
  3. Мыть ячейки с 20 мл 1 x PBS, центрифуги для 5 минут при 200 x g и отбросить супернатант.
  4. Заморозить гранул при-20 ° C или продолжить Очищение дна.

3. Очищение дна и количественный

  1. очистить геномная ДНК с помощью фенола хлороформ добычи, как описано ниже.
    1. Ресуспензируйте клетки 2 мл литического буфера (см. Таблицу материалы) и инкубировать в течение 30 мин при 42 ° C на Отопление блока и.
      Предупреждение: Литического буфера содержит опасные компоненты. SDS решение является раздражающим, протеиназы K ознакомление, раздражает и токсичных. Носите защитную одежду и перчатки.
    2. Сплит образца в двух 2 мл пробирок и добавить 1 объем (V) фенол хлороформ изоамилового спирта (25:24:1).
      Предупреждение: Фенол хлороформ изоамилового спирта токсичных, мутагенным, агрессивных и опасных для водной среды. Использовать в Зонта, носить защитную одежду и перчатки и утилизация отходов специального фенол хлороформ.
    3. Смесь инверсии для 30-60 s и центрифуги для 5 мин на 15000 x g при комнатной температуре.
      Примечание: Не Вихревые ДНК, чтобы избежать случайных стренги перерывы, которые бы исказить результаты у.
    4. Верхняя, водная фаза передать новый 2-мл пробирку и добавить 1 V фенол хлороформ изоамилового спирта (25:24:1).
    5. Смесь инверсии и центрифуги для 5 мин на 15000 x g на 4 ° C.
    6. Передачи верхняя, водный фазу новой 2 мл трубки и 20 мкл NaCl (5 М) и 1 V холодной изопропанола.
      Предупреждение: Изопропиловый спирт легковоспламеняющиеся, раздражает и токсичных. Хранить его в вентилируемых, носить защитную одежду и перчатки и держите его вдали от пламени.
    7. Микс от инверсии и инкубировать в течение по крайней мере 1 ч при -20 ° с.
    8. Центрифуги для 20 минут, 15000 x g, 4 ° C и удалить супернатант.
    9. Мыть ДНК лепешка с 200 мкл холодный 70% этанол, центрифуги для 20 мин на 15000 x g при 4 ° C и удалить супернатант.
      Предупреждение: 70% этанол легковоспламеняющихся и раздражает. Сохранить рабочий раствор при-20 ° C, в противном случае хранилище в вентилируемых, носите защитную одежду и перчатки и держать его вдали от пламени.
    10. Сухие гранулы ДНК при комнатной температуре 20-25 мин
    11. Гранулы растворить ДНК в 100 мкл TE буфер и бассейн образцов в одной тубе.
  2. Концентрация quantitate ДНК с помощью реагента количественный dsDNA согласно данным производителя ' s спецификации (см. Таблицу материалы).
    Примечание: Используйте dsDNA количественный реагента, потому что спектрофотометрические количественный ДНК могут быть затронуты остаточного фенола.
  3. Магазин ДНК при-20 ° C или продолжить лечение HincII.

4. HincII лечение и щелочной гидролиз

  1. дайджест 1 мкг ДНК в реакции смеси, содержащие 5 мкл 10 x буфер 3.1, 1 мкл (10 ед) HincII и свободной от нуклеиназы H 2 O в окончательный объем 50 мкл.
    Примечание: Для достижения оптимальных условий для перевязки, второй стренги синтеза и амплификации PCR, это может быть необходимо увеличить количество входных ДНК, если предполагается, что ДНК содержит очень небольшое количество ribonucleotides. Аналогичным образом, это может быть необходимо уменьшить ввода ДНК, если количество ribonucleotides очень высок.
  2. Инкубируйте 30 мин при температуре 37 ° C.
  3. Очистить HincII лечить ДНК с парамагнитными бусины.
    Примечание: Держите трубку, крышки, открытые в следующие шаги, чтобы не беспокоить окатышей, открыв трубы.
    1. Добавить 1.8 V парамагнитных бусы для каждого образца, тщательно перемешивают, дозирование и инкубации при комнатной температуре на 10 мин
    2. Использовать магнитные стойки для пеллет Бусины для 5 минут, затем снимите и выбросьте супернатант.
    3. Помыть лепешка с 150 мкл 70% этанола (комнатной температуры) для около 30 s затем удалить и удалить супернатант.
    4. Мыть лепешка с 200 мкл 70% этанола (комнатной температуры) около 30 s затем снимите и выбросьте супернатант.
      Примечание: Остаточные этанола могут быть удалены с 10 мкл пипетки. Капельки могут вращаться вниз кратко заранее.
    5. Сухой образцы при комнатной температуре около 15-20 мин
      Примечание: Точное время зависит от объема бусы и форма гранул, поэтому гранулы должны быть проверены визуально.
    6. Удалить трубы из магнитные стойки и элюировать Пелле в 45 мкл EB, микс, тщательно закупорить.
    7. Инкубировать на 5 мин, затем Пелле бусы на магнитные стойки и использовать 45 мкл очищенная ДНК в шаге 4.4.
  4. Добавить 5 мкл Кох (3 М) или хлористого калия (3 М) для ДНК, создавая общий объем 50 мкл.
    Предупреждение: 3 M Кох решение вызывает коррозию. Носите защитную одежду и перчатки.
    5. Печь
  5. инкубировать втечение 2 ч при температуре 55 ° C в гибридизации следуют 5 мин на льду
    Примечание: Рекомендуется проводить лечение Кох в духовке, вместо того, чтобы Отопление блок поддерживать равномерный нагрев трубы и предотвращения конденсации на крышке.
  6. Осадок ДНК путем добавления ацетата натрия 10 мкл (3 M, pH = 5.2) и 125 мкл холодной 100% этанола. Инкубируйте на льду на 5 мин
    Предупреждение: 100% этанола легковоспламеняющихся и раздражает. Хранить в вентилируемых, носить защитную одежду и перчатки и держаться подальше от пламени.
  7. Гранулы геномная ДНК центрифугированием в 21 000 x g, 4 ° C на 5 мин и удалить супернатант.
  8. Мыть ДНК лепешка с 250 мкл холодный 70% EtOH, центрифуги на 21 000 x g, 4 ° C на 5 мин и отбросить супернатант.
    Примечание: Чтобы удалить капельки, трубка может быть вращаться вниз кратко снова и супернатант могут быть удалены с 10 мкл пипетки.
  9. Пусть Пелле сушат в открытой трубой для около 5-10 мин, пока каких-либо видимых жидкость испарится.
  10. ДНК, пусть гранул растворяют в 20 мкл EB 30 мин при комнатной температуре.

5. 5´ конца фосфорилирование

  1. подготовить смесь реакции для каждого образца заранее минусывизионной 2,5 мкл 10 x буфер реакции киназы полинуклеотид T4, 1 мкл (10 ед) 3´ фосфатазы минус T4 полинуклеотид киназы и 2,5 мкл АТФ (10 мм).
  2. Передачи 19 мкл каждого ДНК образца в новую трубу 200 мкл и денатурировать 3 мин при 85 ° C в термо cycler.
  3. Прохладно ДНК образцов на льду и мкл 6 Реакция Смеси для каждой выборки.
  4. Инкубировать реакция смеси при 37 ° C за 30 мин и остановки реакции по инкубации пробы при 65 ° C для 20 мин
  5. ДНК, очищают, как описано в 4.3, используя 1.8 V парамагнитных бусы, но элюировать в 14 мкл EB.

6. ssDNA лигирование

  1. подготовить смесь реакции для каждого образца, заранее состоящий из 0,5 мкл АТФ (2 мм), 5 мкл 10 x T4 РНК лигаза реакции буфера, 5 мкл CoCl 3 (NH 3) 6 (10 мм), 0.5 мкл ARC140 (100 мкм) и 25% 50 мкл ПЭГ-8000. Смесь хорошо, закупорить.
    Предупреждение: CoCl 3 (NH 3) 6 канцерогенных, повышение осведомленности и опасных для водной среды. Носите защитную одежду и перчатки.
  2. Передачи 13 мкл очищенная ДНК от шаг 5.5 к новой пробке 200 мкл и денатурировать 3 мин при 85 ° C в термо cycler.
  3. Прохладно ДНК на льду и 36 мкл реакция смеси для каждого образца, смешивать, закупорить и спин вниз кратко.
  4. Добавить 1 мкл (10 ед) T4 РНК лигаза для каждой реакции, смешивать, закупорить и спин вниз кратко.
  5. Проинкубируйте образцы при комнатной температуре в темной ночи.

7. Второй стренги синтез

  1. очистить лигируют ДНК, как описано в разделе 4.3, но использовать 0,8 V парамагнитных бусы, Пелле Бусины для 10 мин и элюировать в 20 мкл EB.
    Примечание: Из-за выше вязкость смеси реакции перешнуровки, первый шаг гранулирования затягивается.
  2. Передачи 20 мкл образца ДНК к новой ПЦР-пробирку 200 мкл. Повторите шаг очищение с помощью 0,8 V парамагнитных бусы после производитель ' s спецификации и элюировать в 14 мкл EB.
  3. Подготовить смесь реакции для каждого образца, заранее состоящий из 2 мкл 10 x T7 ДНК-полимеразы реакции буфера, 2 мкл ARC76/77 (2 мкм), 2 мкл дНТФ (2 мм) и 0,8 мкл BSA (1 мг/мл).
  4. Передачи 12,8 мкл очищенная ДНК к новой пробке 200 мкл, денатурировать 3 мин при 85 ° C в термо cycler.
  5. Прохладно ДНК на льду и 6,8 мкл реакция смеси для каждого образца, смешивать, дозирование, спина вниз кратко и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
  6. Добавить 0.4 мкл (4 U) Т7 ДНК-полимеразы в каждой реакции и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
  7. Очистить ДНК как описано в разделе 4.3, используя 0,8 V парамагнитных бусины и элюировать в 11 мкл EB.

8. Амплификации PCR и библиотека Quantitation

трубка
  1. подготовить смесь реакции для каждого образца в новой 200 мкл, заранее состоящая из 7,5 мкл ARC49 (2 мкм), 7,5 мкл индекс грунтовка (2 мкм, уникальный для каждого образца) и 25 мкл 2 x горячий старт Готовая смесь.
  2. Добавить 10 мкл образца ДНК для каждой реакции. Расширить библиотеку с помощью следующих условий: денатурировать на 95 ° C на 45 s, следуют 18 циклов 98 ° c 15 s, 65 ° C для 30 s, 72 ° C для 30 s, заканчивая окончательный Удлинение 72 ° C для удержания образцов 2 мин на 4 ° C после усиления.
  3. Очистить библиотек, как описано в 4.3, используя 0,8 V парамагнитных бусы и элюировать 20 мкл буфера TE.
  4. Quantitate библиотек с помощью dsDNA количественный реагента, по словам производителя ' s спецификации (см. Таблицу материалы).
  5. Хранить образцы при-20 ° C или продолжить анализ библиотеки.

9. Анализ библиотеки и объединение

  1. определить качество каждой библиотеки и оценить размер средняя фрагмента, используя систему цифровой электрофорез.
    Примечание: Размер средняя фрагментов оценивается путем оценки, где площадь под кривой electropherogram вдвое, игнорируя пики от маркеров. Представитель результаты подходящих библиотека профилей после Кох или KCl лечения приведены в рисунке 2A.
  2. Рассчитать концентрацию (Нм) библиотек в виде:
    (c/10 3) /(p*650)] * 10 9
    где c-концентрация библиотеки в нг/мкл и p является размер средняя фрагментов в bp, как примерно в 9.1.
  3. Бассейн равные Молярная суммы до 24 библиотек, усиленный с различными индекс праймерами для виртуализации. Добавьте буфер TE окончательный объем 25 мкл и концентрацией 10 Нм.
    Примечание: В зависимости от количество библиотек, чтобы объединить, регулируется количество ДНК от каждой библиотеки. Если Димеры праймера были обнаружены в шаге 9.1 как собственный пик около 130 bp, окончательный объем библиотека бассейн может превышать 25 мкл, потому что шаг очистки повторяется, как описано в 4.3, используя 0,8 V парамагнитных бусы, и ДНК этого eluted в 25 мкл TE БАФ ТЭР.
    1. Определить новые библиотеки бассейн концентрации с использованием реагента количественный dsDNA согласно данным производителя ' s спецификации и среднем пиковый размер, как описано выше. Перейти к последовательности и анализ данных (разделы 10 и 11).

10. Последовательность

  1. выполнять 75-база в паре конец последовательности на пуле библиотек 12.

11. анализ данных

  1. обрезать все читает удалить адаптер последовательностей, фильтр для качества и читать длина.
    Примечание: Это может быть сделано cutadapt 1.2.1 20 с помощью команды ' cutadapt -f fastq--матч читать-подстановочных знаков--тихо -м 15 - q 10 - СС < файла >', где СС заменяется фактическим адаптер последовательности и < файл > является заменены на имя файла fastq.
  2. Удаление сопряжений чтений, которые были удалены на предыдущем шаге, с помощью пользовательских сценариев.
  3. Выровнять мат 1 из оставшихся пар в индекс, содержащий последовательность всех олигонуклеотиды, используемых в подготовке библиотеки (например, с помощью Боути 0.12.8 21 и в командной строке параметры - m1-v2). Отменить все пары с успешным выравниваний.
  4. Выравнивание оставшиеся пары в геном организма ссылку с помощью Боути с командной строки параметры - v2 -X 10000--лучшее.
  5. Карта читает этот промежуток между митохондриальной молекулы начала и конца, совместив мат 1 из всех невыровненных пар (с помощью Боути с командной строкой опции - v2).
  6. Определяет количество 5´ концы для всех рядов одиночные и парные конца. Сдвиг позиции этих на одну базу вверх по течению в позицию, где были гидролизованный ribonucleotides.
  7. Экспорт данных из файла Боути формат формат файла bedgraph с помощью пользовательских скриптов для визуализации в общих браузеров генома. Нормализовать читает для каждой стренги читает за миллион.
  8. Используя позицию и графов из файла bedgraph, ссылка последовательности генома организма для определения личности аудитв ribonucleotides.
    Примечание: Для митохондриального генома человека считывает из регионов 16 200-300 и 5,747-5,847 для каждой стренги должны быть исключены, поскольку эти регионы содержат много свободного 5´ концы несвязанные рибонуклеотид включения по ДНК полимеразы γ.
  9. Делят всего читает, не включая читает на одиннадцать HincII сайтов, с среднее количество операций чтения на сайт HincII, чтобы получить количество ribonucleotides в одиночной стренги перерыв, (т.е. количество ribonucleotides на митохондриальной молекулу).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Иллюстрируя методология, которую представитель, описанные выше данных были созданы Анализ митохондриальной ДНК человека от НеЬа клетки12. Рисунок 2B показывает резюме гласит на всех HincII сайтов в тяжелых (СС) и легких strand (LS) человека митохондриальной ДНК после лечения KCl (левой панели). Около 70% всех обнаруженных 5´ концы локализовать вырезать-сайты, демонстрируя высокую эффективность HincII пищеварение. Лечение библиотек с Кох гидролизуют ДНК на встраиваемых ribonucleotides уменьшается количество чтений на HincII участках около 40% (Рисунок 2Б, правой панели). Это ожидается, так как большое количество 5´ концы формируются на участках рибонуклеотид инкорпорации и свидетельствует о достаточно высокого качества библиотеки. Рисунок 2 c иллюстрирует локализации и частота 5´ концы (зеленый) после лечения KCl и читает Хайден seq (пурпурный) после лечения Кох, обнаружения свободного 5´ концы и заканчивается, порожденных щелочной гидролиз в ribonucleotides. Бесплатные 5´ концы и ribonucleotides локализации в ГС человека мтДНК отображаются на левой панели и те локализации для LS указаны в правой панели. Относительное количество сырых читает в ribonucleotides (Рисунок 2D, верхняя панель) или HincII сайтах (Нижняя панель) HS и LS митохондриальной ДНК показывают, соответственно, четырнадцатикратное или 31-fold сильнее освещение LS по отношению к СС, в то время как аналогичные уклоном не наблюдалось ядерной ДНК. Это смещение нити могут быть объяснены отчетливая разница в базовый состав из двух нитей и иллюстрирует важность нормализации для чтения на HincII участках.

Нормализующее чтения насчитывает HincII дает количественную оценку числа ribonucleotides за митохондриального генома (рис. 3A). Как показано на рисунке 3B, читает после того, как Кох лечения для каждого рибонуклеотид нормированный последовательность состава каждой пряди показывают отношение отличается от 1, что указывает неслучайное распределение гласит, предлагая собственный рибонуклеотид шаблон и качество высокое библиотеки. Это соотношение не зависит от предыдущих пищеварение с HincII, Проверка специфичности расщепления фермента. Нормализующее читает на участках встраиваемых ribonucleotides на HincII расщепление участках, а также содержание нуклеотидов генома, генерирует количественная мера как многие из каждого рибонуклеотид включены за 1000 дополнительных баз ( Рисунок 3 c).

figure-results-1
Рисунок 1: схема для обработки ДНК и библиотека подготовки. (1) весь геномной ДНК расщепляется по HincII для нормализации в последующих количественный ribonucleotides, генерации тупыми концами на HincII участках (черная стрелка). (2 ДНК обрабатывается Кох гидролизуют на участках рибонуклеотид, приводит к 2´, 3´ циклических фосфат (красный Пентагон) в 3´ концы и бесплатные 5´-OH заканчивается. (3) 5´-OH концы фосфорилированных, T4 Polynucleotide киназы 3´ фосфатазы минус. (4) все 5´ концы, перевозящих фосфатной группы лигируют к ARC140 олигонуклеотида лигаза T4 РНК. (5 второй стренги синтезируется с помощью Т7 ДНК-полимеразы и олигонуклеотидов ARC76-77, содержащий случайные последовательности N6 . (6 Библиотека усиливается ДНК-полимеразы высокой четкости с использованием ARC49 и один из ARC78 к ARC107 индекс грунты, содержащий уникальный штрих-код для мультиплексирования. (7) 5´ концы находятся в паре конец последовательности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2: проверка метода. (A) представитель electropherograms, созданная с помощью электрофореза автоматизированной системы для определения качества созданные библиотеки относились с Кох или KCl. (B) резюме сигнал на HincII участках в тяжелых (СС) и легких strand (LS) человека мтДНК после KCl (левой панели) или лечения Кох (правой панели). (C) Circos рисунок свободной 5´ концы (зеленый) и Хайден-Seq (свободные 5´ концы и ribonucleotides, пурпурный) в HS (левая панель) и человека мтДНК LS (правая панель). Вершины нормализуются к за миллион читает и максимальный пик корректируется максимальное количество чтений Хайден seq библиотеки. (D) резюме сырье читает в ribonucleotides (Верхняя панель) и HincII (Нижняя панель) в тяжелых (H) и свет (L) прядь в человека мтДНК (Mito.) или в обратном порядке (RV) или вперед (FW) прядь в ядерной (КНУ). ДНК. Цифры, B, C и D адаптированы из ссылка12. Планки погрешностей представляют Среднеквадратичная ошибка среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3: результаты представитель. (A) относительное количество ribonucleotides, нормализации гласит на HincII участках для библиотек Кох лечение на тяжелый (H) или прядь свет (L). (B) соотношение рибонуклеотид личности митохондриальной ДНК генома композиции для Кох лечение (KOH) и HincII расщепляется с лечить Кох (HincII + Кох) библиотек на тяжелый (H) или легких (L) стренги митохондриальной ДНК. (C) рибонуклеотид частоты нормированы 1000 дополнительных оснований для HincII и Кох лечение библиотек на тяжелый (H) или свет (L) нити мтДНК. Цифры взяты из ссылка12. Планки погрешностей представляют Среднеквадратичная ошибка среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

ИмяПоследовательность
ARC49AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
ARC76GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNN * N * N
ARC77AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTC * A * C
ARC78CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
ARC84CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
ARC85CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
ARC86CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
ARC87CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA
TCT ARC88 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC89 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC90 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC91 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC93 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC94 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC95 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC96 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGTTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC97 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACGGAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC98 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC99 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC100 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC101 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC102 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGGCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC103 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCCGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC104 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC105 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCCACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC106 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATATCAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC107 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAAGGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC140 / 5AmMC6/ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT

Таблица 1: олигонуклеотидов. Перечислены олигонуклеотиды, используемые для Хайден-след Жирным шрифтом указывает индексации. * Указывает фосфоротиоат Бонд. ARC140 содержит 5´ амино-группы вместо 5´-OH группы, в сочетании с компоновщик C6. Это изменение уменьшает образование ARC140 concatemers во время перевязки.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем технику одновременно карта и количественной оценки ribonucleotides в геномная ДНК и митохондриальной ДНК в частности, на простое введение расщепления ДНК на конкретных участках последовательности в геноме как дополнение к установленным Протоколом Хайден seq. Хотя это исследование фокусируется на митохондриальной ДНК человека, первоначально Хайден seq метод был разработан в Saccharomyces cerevisiae, иллюстрирующие этот метод перевода для других организмов12,16.

Надежные результаты, полученные от этого подхода, следует отметить некоторые важные шаги: (A) поскольку последовательности адаптеры перевязать все доступные 5´-концы, важно работать с высоко нетронутыми ДНК. ДНК, должен быть изолирован и библиотек следует предпочтительно сразу же после изоляции ДНК, или ДНК может храниться при температуре-20 ° C. Не рекомендуется хранить ДНК в холодильнике долгое время или неоднократно замораживать и размораживать его. (B) для создания подходящих библиотек с помощью этого метода, важно выполнять Кох лечения ДНК в духовке инкубации, вместо того чтобы Отопление блока, обеспечивая однородный нагрев всей выборки и количественных гидролиза. (C) Кроме того важно контролировать качество библиотек до объединения и последовательности. ДНК должны быть количественно и анализируются с помощью электрофореза автоматизированной системы для обеспечения достаточного количества библиотеки ДНК, подтвердить соответствующий фрагмент размеров и поискать Димеры праймера.

Для анализа значимых данных важно также отметить, что информационное значение этого метода зависит от надлежащего контроля для оценки графов фон и последовательности или прядь предубеждения. Мы регулярно достичь сопоставления эффективности в пробах KCl около 70%, когда только переваривание с конкретным эндонуклеазы последовательности (рис. 2B, левой панели). Кроме того, важно подтвердить, что лечение эндонуклеазы не затрагивает общего обнаружения включены ribonucleotides, сравнивая HincII лечить и лечить образцы (рисунок 3B). В этих экспериментах мы использовали HincII представить сайт конкретных сокращений, хотя другие высококачественные энзимы ограничения также могут быть использованы.

Протокол может быть адаптирована для изучения других типов повреждения ДНК, которые могут быть обработаны 5´ фосфат или 5´-OH заканчивается. Точность результатов зависит от специфики обработки и требует подходящие элементы управления (например, дикого типа или непереработанных) для проверки. Кроме того при адаптации этот метод для других приложений или для использования с другими организмами, следует учитывать, что метод в своей текущей установки требуется около 1 мкг ДНК, которая обрабатывается в библиотеку. Поскольку количество заканчивается зависит количество встроенных ribonucleotides, которая варьируется в зависимости от организма или мутант, образцы, включая меньшее количество ribonucleotides потребует более входных ДНК, чтобы создать достаточное количество заканчивается в Последующие библиотеки строительство. Аналогично Если образцы ДНК имеют гораздо большее количество ribonucleotides, она также потребует использования менее ввода ДНК для получения оптимальных условий для перевязки, второй стренги синтеза и амплификации PCR. Примечательно, что библиотека конструкции, описанный в настоящем Протоколе также созданных данных, охватывающих ядерного генома (как показано в Рисунок 2D) и только анализа данных было сосредоточено на митохондриальной ДНК. Это показывает, что этот метод также перехватываются больших геномов с умеренно низких частот рибонуклеотид.

При рассмотрении этого метода, следует учитывать определенные ограничения: Хотя этот метод в теории, следует применять к практически любой организм, подходящую ссылку генома необходима для выравнивания читает. Кроме того результаты, полученные от нашего протокола представляют считывает из большого числа клеток. Этот подход не могут быть определены конкретные рибонуклеотид Включение шаблонов подмножества ячеек. Если ribonucleotides сопоставляются в больших геномов, с очень низким количеством ribonucleotides, он может быть сложным различать ribonucleotides от случайных вмятин и поэтому необходимы соответствующие элементы управления.

Метод, мы описали здесь, расширяет имеющиеся в естественных условиях такие методы, как Хайден-Seq16, рибозы-Seq17, пу-Seq18или19emRiboSeq. Эти подходы воспользоваться встраиваемых ribonucleotides чувствительность к щелочной или H2 РНКазы лечение, соответственно, используя последовательность следующего поколения для выявления ribonucleotides всей генома, который позволяет их отображение и сравнение относительно включения. Раскалыванием последовательности ДНК, как описано выше, в дополнение к щелочной гидролиз на встраиваемых ribonucleotides, читает для ribonucleotides могут быть нормированы тех расщепления сайтов, позволяя не только выявление и картирование ribonucleotides, но также их количественный для каждой молекулы ДНК. Применение нашей техники в контексте заболеваний, относящиеся к репликации ДНК, репарации ДНК и TLS может обеспечить более глубокое понимание роли ribonucleotides в основные молекулярные механизмы и целостности генома в целом.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Шведский научно-исследовательский совет (www.vr.se) предоставляет дуги (2014-6466 и шведский фонд стратегических исследований (www.stratresearch.se) к ДУГЕ (ICA14-0060). Чалмерский технологический университет оказывает финансовую поддержку MKME в ходе этой работы. Спонсоры имел никакой роли в дизайн исследования, сбор данных и анализ, решение опубликовать или подготовка рукописи.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x T4 полинуклеотидкиназный реакционный буферNew England BiolabsB0201S
10x T4 реакционный буфер РНК-лигазыNew England BiolabsB0216L
1x PBSMedicago09-9400-100растворить 1 таблетку в H2O до конечного объема 1 л
2-пропанолSigma-Aldrich33539-1L-GL-R
2100 БиоанализаторAgilent TechnologiesG2940CA
50 мл центрифужная пробиркаVWR525-0610
Аденозин 5'-трифосфат (АТФ, 10 мМ)New England BiolabsP0756Sразбавленный EB до 2 мМ
Agilent DNA 1000 KitAgilent Technologies5067-1504
BSA, класс молекулярной биологии (20 мг/мл)New England BiolabsB9000Sдилту с безнуклеазным H<суб>2О до 1 мг/мл
Буфер EBQIAGEN19086именуемый как
EB Парамагнитные шарикиCleanNACPCR-0050
Дезоксинуклеотид (dNTP) Смесь растворов (10 мМ каждая)New England BiolabsN0447Lразбавить EB до 2 мМ
DMEM, высокий уровень глюкозы, добавка GlutaMAX Gibco61965026
DynaMag 96 SideThermo Fisher12331D
Этанол 99,5% аналитический сортSolveco1395разбавить с миллиQ водой до 70%
Этилендиаминтетрауксусная кислота раствор (ЭДТА, 0,5 М)Sigma-Aldrich03690-100ML
Фетальная бычья сывороткаGibco10500056
HEPES буфер pH 8,0 (1 М) стерильный BCAppliChemA6906,0125
Гексамин хлорид кобальта(III) (CoCl3(NH3)6)Sigma-AldrichH7891-5Gрастворяется в безнуклеазном H2O для 10  М раствор, стерильный фильтр. ВНИМАНИЕ: канцерогенный, сенсибилизирующий и опасный для водной среды.
HincIINew England BiolabsR0103SNEBuffer 3.1
HB-1DTechneFHB4DD
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)Kapa BiosystemsKK2602
для лизиса50 мМ ЭДТА, 20 мМ HEPES, NaCl 75 мМ, протеиназа К (200 &; г/мл), 1% SDS
Микропробирка 1,5 млSarstedt72.690.001
Микроцентрифуга 5424REppendorf5404000014
Микроцентрифуга MiniStar silverlineVWR521-2844
Multiply  &микро; StripPro 0,2 мл тубаSarstedt72.991.992
Вода без нуклеазыAmbionAM9937
Фенол – хлороформ – изоамиловый спирт (25:24:1)Sigma-Aldrich77617-500ML
Хлорид калия (KCl)VWR26764.232растворить в нуклеазном H2O для 3  М раствор, стерильный фильтр
гидроксид калия (КОН)VWR26668.296растворить в нуклеазном безнуклеазном H2O для 3  M раствор, стерильный фильтр
Proteinase KAmbionAM2546
Qubit 3.0 ФлуориметрInvitrogenQ33216
Пробирки для анализа кубитовInvitrogenQ32856
Qubit dsDNA BR Assay KitInvitrogenQ32850ВНИМАНИЕ: Содержит легковоспламеняющиеся и токсичные компоненты
Qubit dsDNA HS Assay KitInvitrogenQ32851ВНИМАНИЕ: Содержит легковоспламеняющиеся и токсичные компоненты
Охлаждаемая центрифуга 4K15Sigma Лабораторные центрифугиNo10740
SDS Раствор, 10%Invitrogen15553-035
Ацетат натрия буферный раствор, pH 5,2, 3 M (NaAc)Sigma-AldrichS7899
Sodium chloride (NaCl)VWR27810.295растворяются в безнуклеазном H2O для 5  M раствор, стерильный фильтр
T100 Thermal CyclerBio-Rad1861096
T4 полинуклеотидкиназы (3' фосфатаза минус)New England BiolabsM0236L
T4 РНК-лигаза 1 (ssRNA Ligase)New England BiolabsM0204Lпоставляется с PEG 8000 (50%)
T7 ДНК-полимераза (немодифицированная)New England BiolabsM0274Sпоставляется с 10x T7 DNA Polymerase Reaction Buffer
TE BufferInvitrogen12090015
ThermoMixer F2.0Eppendorf5387000013
, поставляется с гибридизатором буфер

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Traut, T. W. Physiological Concentrations of Purines and Pyrimidines. Mol. Cell. Biochem. 140, 1-22 (1994).
  2. McElhinny, S. A. N., et al. Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 4949-4954 (2010).
  3. Williams, J. S., Lujan, S. A., Kunkel, T. A. Processing ribonucleotides incorporated during eukaryotic DNA replication. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17, 350-363 (2016).
  4. Clausen, A. R., Zhang, S., Burgers, P. M., Lee, M. Y., Kunkel, T. A. Ribonucleotide incorporation, proofreading and bypass by human DNA polymerase delta. DNA Repair. 12, 121-127 (2013).
  5. Potenski, C. J., Klein, H. L. How the misincorporation of ribonucleotides into genomic DNA can be both harmful and helpful to cells. Nucleic Acids Res. 42, 10226(2014).
  6. Vengrova, S., Dalgaard, J. Z. RNase-sensitive DNA modification(s) initiates S. pombe mating-type switching. Gene. Dev. 18, 794-804 (2004).
  7. Lujan, S. A., Williams, J. S., Clausen, A. R., Clark, A. B., Kunkel, T. A. Ribonucleotides Are Signals for Mismatch Repair of Leading-Strand Replication Errors. Mol. Cell. 50, 437-443 (2013).
  8. Ghodgaonkar, M. M., et al. Ribonucleotides Misincorporated into DNA Act as Strand-Discrimination Signals in Eukaryotic Mismatch Repair. Mol. Cell. 50, 323-332 (2013).
  9. DeRose, E. F., Perera, L., Murray, M. S., Kunkel, T. A., London, R. E. Solution Structure of the Dickerson DNA Dodecamer Containing a Single Ribonucleotide. Biochemistry. 51, 2407-2416 (2012).
  10. Li, Y. F., Breaker, R. R. Kinetics of RNA degradation by specific base catalysis of transesterification involving the 2 '-hydroxyl group. J. Am. Chem. Soc. 121, 5364-5372 (1999).
  11. McElhinny, S. A. N., et al. Genome instability due to ribonucleotide incorporation into DNA. Nat. Chem. Biol. 6, 774-781 (2010).
  12. Berglund, A. K., et al. Nucleotide pools dictate the identity and frequency of ribonucleotide incorporation in mitochondrial DNA. Plos Genet. 13, (2017).
  13. Brown, J. A., Suo, Z. C. Unlocking the Sugar "Steric Gate" of DNA Polymerases. Biochemistry. 50, 1135-1142 (2011).
  14. Sparks, J. L., et al. RNase H2-Initiated Ribonucleotide Excision Repair. Mol. Cell. 47, 980-986 (2012).
  15. Miyabe, I., Kunkel, T. A., Carr, A. M. The Major Roles of DNA Polymerases Epsilon and Delta at the Eukaryotic Replication Fork Are Evolutionarily Conserved. Plos Genet. 7, (2011).
  16. Clausen, A. R., et al. Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation. Nat. Struct. Mol. Biol. 22, 185-191 (2015).
  17. Koh, K. D., Balachander, S., Hesselberth, J. R., Storici, F. Ribose-seq: global mapping of ribonucleotides embedded in genomic DNA. Nat. Methods. 12, 251(2015).
  18. Keszthelyi, A., Daigaku, Y., Ptasinska, K., Miyabe, I., Carr, A. M. Mapping ribonucleotides in genomic DNA and exploring replication dynamics by polymerase usage sequencing (Pu-seq). Nat. Protoc. 10, 1786-1801 (2015).
  19. Ding, J., Taylor, M. S., Jackson, A. P., Reijns, M. A. M. Genome-wide mapping of embedded ribonucleotides and other noncanonical nucleotides using emRiboSeq and EndoSeq. Nat. Protoc. 10, 1433-1444 (2015).
  20. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17, 10-12 (2011).
  21. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10, (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Ribonucleotide MappingRibonucleotide QuantitationMitochondrial DNANext Generation SequencingHincII DigestionAlkaline HydrolysisAdapter LigationDNA Library PreparationBioinformatic AnalysisAbsolute Quantification

Related Articles