Методическая статья

Перемещение вверх: Простая и гибкая в Vitro трехмерной вторжения протокол Assay

5.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56568

⸱

12 марта 2018 г.

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Minnesota - Twin Cities, 2Stem Cell Institute, University of Minnesota - Twin Cities, 3Masonic Cancer Center, University of Minnesota - Twin Cities, 4Lillehei Heart Institute, University of Minnesota - Twin Cities, 5Institute for Engineering in Medicine, University of Minnesota - Twin Cities, 6Department of Biology, Jackson State University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает пробирного Перевернутый вертикальных вторжения, которые могут использоваться для количественного определения миграции и вторжения возможности клеток в трехмерное обстановке при сохранении микроокружения клеток. Этот assay подходит для редких и/или чувствительных клеток.

Аннотация

Хотя были разработаны 3D вторжения анализов, задача по-прежнему изучать клетки без ущерба целостности их микроокружения. Традиционные 3D assays, такие как Бойден камеры требуют что клетки являются перемещенными лицами из исходного местоположения культуры и переехал в новую среду. Не только делает это нарушить клеточные процессы, которые являются неотъемлемыми для микроокружения, но это часто приводит к потере клеток. Эти проблемы особенно сложным, при работе с ячейками, которые являются редкими, либо чрезвычайно чувствительны к их микроокружения. Здесь мы описывают развитие assay 3D вторжения, который избегает обеих проблем. В этот assay клетки покрыты в рамках небольшой хорошо и ECM матрицы, содержащие хемотаксического укладывается поверх клетки. Это требует перемещения не ячейки и позволяет клеткам вверх вторгнуться в матрицу. В этот assay клетки вторжения, а также морфология клеток может быть оценена внутри гель коллагена. С помощью этого анализа, мы характеризуют инвазивного потенциала редких и чувствительных клеток; гибридных клеток результате сплавливание между клетками рака молочной железы MCF7 и мезенхимальных/Multipotent с стволовых/стромы клеток (Майкрософт) (MSCs).

Введение

Подвижности клеток это нормальный процесс развития и физиологических клеток. Однако изменения в структуре и способность клеток к миграции и вторгнуться связаны с патологических состояний, включая воспалительных заболеваний и рака метастазы1,2,3. Метастазирование является вероятно наиболее плохо понимали аспектом в рак. Метастазировать, раковые клетки должны ухудшить дополнительных клеточных матриц (ECM), вторгнуться местные ткани и intravasate. Однажды в обращении раковые клетки будет распространять на дальних сайт, extravasate и формируют вторичные опухоли. Таким образом, способность клеток к разложению ECM, мигрировать и вторгнуться связано с их метастатическим потенциалом. Были разработаны различные подходы для анализа и количественной оценки миграции и вторжения возможности клеток. Наиболее часто используемые подходы включают ранозаживляющее пробирного, покадровой микроскопии и Бойден Пробирной палаты. Рану исцеления пробирного4 и время перерыва микроскопии являются простой и удобный анализов, которые дали бы предварительное представление о миграции клеток. Однако оба являются 2D анализов, которые не отражают 3D окружающей среды, в которой клетки существуют в естественных условиях. Исследования показали, что клетки реагируют по-разному в 3D среде, по сравнению с 2D5,6. Кроме того трудно воспроизвести и давать количественные результаты7,8,9анализов заживления раны. Assay клетки запретной зоны, который является 3D модификация ранозаживляющее пробирного, является более физиологически соответствующим методом, но это не подходит для ячеек низкого числа таких гибридных клеток результате клетки фьюжн события10,11 .

Пробирная палата Бойден является 3-мерной assay, который предоставляет соответствующие микросреды для сотовых исследования. Однако он требует клетки быть удалены от их первоначального микроокружения и зачислены на верхней палаты Бойден пробирного системы для миграции и вторгнуться вниз к хемотаксического содержащие среднего. Этот 3D подход не подходит для анализа миграции и вторжения способность клеток подвержены их микроокружения и/или ограниченные в число11,10,12. Новые подход для анализа миграции клеток и вторжение является microfluidic градиента палате пробирного13. Хотя подходящих и надежных исследований в миграции и вторжения, этот assay является более дорогостоящим и может быть технически сложных для типичной лаборатории. Мы опишем здесь простой Перевернутый вертикальных вторжения assay, который совместим со многими типами клеток, включая клетки, чувствительные к их микроокружения и/или ограниченного числа. Этот assay был адаптирован от протокола, предложенный Hooper et al. 14. в этот assay клетки остаются в их оригинальной микроокружения и их миграции и вторжения контролируется как они перемещаются вверх в гель коллагена, содержащий хемотаксического11. Этот assay воспроизводимость и был оптимизирован и проверены в 35-мм культуры блюдо. Это могут быть адаптированы к условиям различных пробирного, включая различные клетки культуры размеров, различные матрицы или прочность адгезии и различные chemoattractants. Этот assay может служить в качестве платформы в пробирке для первоначальной проверки в процессе обнаружения наркотиков.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: Этот Протокол описан в Макардл и др. 11. График приводится на рисунке 1.

1. Подготовка пластину культуры

  1. Вымойте 35-мм культуры блюдо, содержащий 10-мм стекло дно с 1 мл раствора 1 М соляной кислоты (HCl) за 15 мин до снижения гидрофобность стекло дно.
  2. Вымойте пластину культуры дважды с 1 мл фосфатный буфер (PBS) избавиться от всех HCl.
  3. Вымойте пластину культуры дважды с 1 мл 70% этанола.
  4. Промойте пластины культуры с 1 мл среды конкретной культуры клеток (здесь, использование α-MEM дополнена 10% тепла инактивированная FBS и несущественные аминокислот, 1%).
    Примечание: Пластину обработанных культуры, содержащий питательной среды могут храниться в CO2 инкубатора с увлажнитель при 37 ° C до следующего дня.
  5. Вырасти клетки (MSCs и MCF-7 совместно культура) обработанного стекла-внизу хорошо 35-мм культуры блюдо до 100% confluency. Совместное культуры 35000 MSC клетки и 75000 клеток MCF7 за 24 часа.

2. Подготовка гель коллагена

  1. Храните микропипеткой советы, используется для пипетирования гель коллагена в морозильник, чтобы предотвратить полимеризации коллагена при контакте.
    Примечание: Это наиболее важный шаг.
  2. Определить объем крысы хвост коллагена я использоваться основанные на концентрации запас коллагена. Подготовка 100 мкл гель коллагена для этот assay.
    Примечание: Высокая концентрация крысы хвост коллагена, который я фондовых работает лучше. Определите объем 10 x Дульбекко изменение орла средних и использоваться для разбавления коллаген соответственно.
  3. Объединить на льду крысы хвост коллаген I (3.8 акций мкг/мл), 10 x Дульбекко изменение орла среднего и 1 x клетки культуры средних дополнена плода бычьим сывороточным 2% и соответствующие хемотаксического до конечной концентрации коллагена 2,4 мг/мл.
  4. Добавьте в смесь 4,5% раствора бикарбоната натрия для нейтрализации гель коллагена.
    Примечание: Объем раствора бикарбоната натрия добавил может меняться в зависимости от точного pH других реагентов. Лучше всего проверить в смеси с рН полоски для обеспечения нейтрального раствора, или использовать показатель рН в среде культуры.
  5. Положите 80 мкл коллаген смеси над клеток в стекло дно хорошо культуре тарелки.
  6. Разрешить гель коллагена для полимеризации 30 мин в CO2 инкубатор с увлажнитель при 37 ° C.
  7. Покрытие гель коллагена с 2 мл среды клеток с сокращение сыворотке (2%) и инкубации клеток при 37 ° C в CO2 инкубатора с увлажнителем, 24, 48 или 72 ч.
    Осторожностью: Пластины должны рассматриваться с осторожностью для предотвращения отсоединения от дна стекло гель коллагена.

3. пример составления коллагена гель с помощью запас коллагена хвост крысы 3.8 мкг/мл

  1. На льду объединить 114.5 мкл крысы хвост коллагена, 16.6 мкл 10 x DMEM и 33,1 мкл питательной среды, содержащие хемотаксического.
  2. Нейтрализовать коллаген смесь с 14.0 мкл бикарбоната натрия.
  3. Продолжить как шаг 2,5.

4. imaging клеток

  1. Осторожно извлеките из блюдо.
  2. Аккуратно промойте гель с 1 мл раствора PBS.
  3. Исправьте клетки с 1 мл раствора параформальдегида 4% за 15 мин.
  4. Вымойте клетки дважды с 1 мл раствора PBS.
  5. Пятно клетки с DAPI решение (100 нг/мл) для 20 мин при комнатной температуре.
  6. Изображение клетки с помощью конфокального микроскопа в разных местах и принимая 400 мкм z стек изображений каждого местоположения в 16 мкм шагов. Микроскоп используется имеет диск сканирование блок, который позволяет конфокальная томография с использованием белый свет, источник возбуждения дуги. Используйте 20 X объектив используется с числовой апертуры 0,75.
  7. Преобразовать изображения.
    1. Откройте изображения для данного геля (примерно 25 изображений) и создать стек изображений, щелкнув изображение → стеки → изображения в стек. Первое изображение соответствует нижней части геля (z = 0 мкм), второе изображение соответствует первый шаг в направлении оси z (z = 16 мкм), третье изображение соответствует второй шаг в направлении оси z (z = 32 мкм). Оценивать каждое ядро на каждой глубине изображение и определить глубину, на которой ядро был в наиболее резкого фокуса как глубина вторжения для этой конкретной ячейки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы использовали 35-мм культуры блюдо с стекла дно и крысы хвост коллаген я развивать и оптимизировать в пробирке с 3D вторжения анализа протокола. С помощью этого анализа, мы показали, что груди раковые клетки MCF7 и MSC клетки могут вторгнуться в гель коллагена в среднем расстоянии 0,04 мкм ± 1,8 и 41,3 ± 76.0 мкм соответственно после 48 ч при IGF1 (18,6 нг/мл) был использован в качестве хемотаксического (рис. 2). Что еще более важно мы показали, чт...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы описываем пробирного простой Перевернутый вертикальных вторжения, который удобен для различных типов клеток, включая клетки, которые являются редкими и/или зависит от их микроокружения. В этой 3D вторжения assay клетки остаются в их оригинальной микроокружения и покрыты гель коллагена, содержащий хемотаксического. Клетки затем мигрируют и вторгнуться в коллагена. В этот assay клетки можно витражи и легко контролировать в гель. Простота и воспроизводимость этот assay делает его удобным инструментом для изучения м...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявили, что существует не конкурирующих интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана национальных институтов здравоохранения (NIMHD-G12MD007581) через RCMI-центр для санитарного состояния окружающей среды в Джексон государственного университета и министерства обороны, идея премии 11-1-0205 США.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
MatTek P35G-1.5-10CMatTek Corporation, Ашленд, МассачусетсP35G-1.5-10-CМаттековые стеклянные донные тарелки
Коллаген крысиного хвоста ICorning, Corning, Нью-Йорк, США354236 Коллагеновый гель
Соляная кислотаSigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури 63178 СШАH1758HCl
Фосфат буферизованный физиологический растворThermo Fisher Scientific Inc., Уолтхэм, Массачусетс, США10010023ПБС
10X Dulbecco's Modified Eagle's MediumSigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури 63178 СШАD242910X DMEM
Бикарбонат натрияSigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури 63178 СШАS5761NaHCO3Confocal
Флуоресцентный микроскопOlympus America, Center Valley, PA, СШАOlympus IX81Confocal  микроскоп
Определенная фетальная сывороткабычьего скотаGE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Юта, СШАSH30070.03FBS
Ti:Сапфировый многофотонный лазерный сканирующий микроскопPrarie Technologies, Су-Фолс, Южная Дакота, США40x NA 0.8 объективMPLSM
Программное обеспечение ImarisBitplane Inc. Zurich, CHImaris 7.5.2Программное обеспечение Imaris
DAPISigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури 63178, СШАD9542DAPI
ПараформальдегидThermo Fisher Scientific Inc., Уолтхэм, Массачусетс, США 50980487PFA&
альфа;-минимальную эфирную средуSigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури 63178, СШАM0894
MDA-MB-231ATCC; Манассас, Вирджиния, СШАHBT-22
MSCTrivedi and Hematti, 2007
20X объектив UPLAPOOlympus America, Center Valley, PA, США36-064Olympus UPLSAPO 20X Объектив

Ссылки

  1. Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matric. Cell Mol Life Sci. 57, 41-64 (2000).
  2. Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).
  3. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3, 362-374 (2003).
  4. Yarrow, J. C., Perlman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparison of image-based readout methods. BMC Biotechnol. 4, 21(2004).
  5. Wolf, K., et al. Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. J Cell Biol. 160, 267-277 (2003).
  6. Sahai, E., Marshall, C. J. Differing modes of tumour cell invasion have distinct requirements for Rho/ROCK signalling and extracellular proteolysis. Nat Cell Biol. 5, 711-719 (2003).
  7. Kam, Y., Guess, C., Estrada, L., Weidow, B., Quaranta, V. A novel circular invasion assay mimics in vivo invasive behavior of cancer cell lines and distinguishes single-cell motility in vitro. BMC Cancer. 8, 198(2008).
  8. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90, 195-221 (2009).
  9. Poujade, M., et al. Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 15988-15993 (2007).
  10. Noubissi, F. K., Harkness, T., Alexander, C. M., Ogle, B. M. Apoptosis-induced cancer cell fusion: a mechanism of breast cancer metastasis. FASEB J. 29, 4036-4045 (2015).
  11. McArdle, T. J., Ogle, B. M., Noubissi, F. K. An In Vitro Inverted Vertical Invasion Assay to Avoid Manipulation of Rare or Sensitive Cell Types. J Cancer. 7, 2333-2340 (2016).
  12. Noubissi, F. K., Ogle, B. M. Cancer Cell Fusion: Mechanisms Slowly Unravel. Int J Mol Sci. 17, (2016).
  13. Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annu Rev Anal Chem. 1, 423-449 (2008).
  14. Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Methods In Enzymol. 406, 625-643 (2006).
  15. Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. Mechanical memory and dosing influence stem cell fate. Nat Materials. 13, 645-652 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

3D

Похожие статьи