Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Хирургическая процедура для администрации лекарства для внутреннего уха в Non-Human приматов общие игрунка (Callithrix jacchus)

8.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56574

⸱

27 февраля 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Regenerative Medicine, Jikei University School of Medicine, 2Department of Otorhinolaryngology, Jikei University School of Medicine, 3Department of Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery, Keio University School of Medicine, 4Laboratory Animal Facilities, Jikei University School of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Мы приводим хирургический метод для администрирования лекарства для внутреннего уха нечеловеческих приматов, общие игрунка (Callithrix jacchus), через круглое окно мембраны.

Аннотация

Услышав исследований давно способствовало грызунов модели, хотя в некоторых заболеваний, не изъятый человека симптомы. Общие игрунка (Callithrix jacchus) является небольшой, легкий к ручка Широконосые обезьяны, которая имеет аналогичные Анатомирование височной кости, включая среднего уха ossicular цепи и внутреннего уха к людям, чем по сравнению с грызунами. Здесь мы доклад воспроизводимость, безопасных и рациональных хирургический подход улитковый круглое окно ниша для доставки лекарств для внутреннего уха общей игрунка. Мы приняли задняя tympanotomy, процедура, используемая клинически в человека хирургии, чтобы избежать манипуляций барабанной перепонки, что может привести к Проводящая потеря слуха. Эта хирургическая процедура не привело к потере каких-либо значительных слуха. Этот подход стало возможным благодаря большой буллы структура общих Мармосет, хотя следует тщательно рассмотреть бокового канала и вертикальной части лицевого нерва. Этот метод позволяет нам выполнить безопасной и точной отправления наркотиков без потери слуха, который имеет большое значение в получении доклинические доказательство концепции для трансляционного исследования.

Введение

Сенсоневральная потеря слуха (SNHL) возникает преимущественно от повреждения или дефицит в улитке. Распространенные причины SNHL старения (например presbycusis), генетические дефекты, воздействие громкого шума, инфекции и ототоксических препаратов1. По оценкам Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), что более 360 миллионов человек, составляет 5,3% населения мира, страдают от слуха потери2. Предполагается также, что 1 в 900-1 в 2500 новорожденных имеют умеренный, тяжелая, и глубоких врожденных постоянной потере слуха и примерно одна из трех взрослых старше 65 лет имеют некоторую степень потери слуха3. Однако не существует эффективного клинического лечения потери слуха для этих пациентов.

Давно проведено исследование слуха с помощью грызунов или модели морской свинки, и многие подходы, такие как генной терапии и восстановительной терапии, были предложены как новый метод лечения потери слуха. Однако существует большая разница между человеком и грызунов с точки зрения слуховой системы, и это очень трудно перевести животных моделей для человека приложений. Общие игрунка (C. jacchus), Широконосые обезьяны, возникая от Amazon, стала модель привлекательной нечеловеческих приматов для различных базовых исследований по нескольким причинам. Во-первых ее анатомии и физиологии больше похожи на тех людей, а не грызунов. Во-вторых основные биологические сведения о этого вида, включая заболевания, нейронные сети, поведение и геном, хорошо характеризуется. Слуховые и вокальные обработки, корковых кодирования периодичности, представление тангажа и слуховой вокал взаимодействия общих мартышек были также сообщения о4,5,6,7 , 8 , 9 , 10. в недавних гистологические исследования, исследователи выявлены отличительные выражение модели 20 генов глухоты и аниониты в улитке общей игрунка и обнаружил, что пять генов, которые причинных прогрессивного глухотой, и три Аниониты, имели различные выражения шаблоны от тех грызунов11,12. Эти профили заставить нас поверить, что общие игрунка является мощным инструментом для исследования слуха.

Наиболее заметные атрибуты общего игрунка как экспериментальное животное заключаются в следующем:

  • Управляемость с небольшим телом размер по сравнению с некоторых видов старого мира обезьян: Взрослый мартышек весят 300-400 г и являются около 60 см в высоту, которая похожа на крыс.
  • Весьма репродуктивного приматов: мартышек достигают половой зрелости в возрасте 18 месяцев и способны нести два раза в год и ежегодно производят потомство 4-6.
  • Генетические изменения доступны: Сасаки E et al. преуспел в создании трансгенных13 и нокаут-14 приматов, с помощью мартышек, генетической модификации, причастны неврологические расстройства (например, Паркинсона болезни и болезни Альцгеймера).
  • Как эмбриональных стволовых (ES) и индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клетки были установленным15,16. Хотя это довольно трудно сохранить одинаковое количество мартышек, по сравнению с грызунами, наличие стволовые клетки или клетки iPS обеспечивает в vitro анализов, которые позволят сократить количество необходимых анализов в естественных условиях .

Для облегчения лучше трансляционного исследования в области глухота и его потенциальной терапии, мы создали изображений протокол исследования, с помощью КТ и МРТ, общий наркоз и слуха с помощью слуховых мозга ответов (ABR). Эти экспериментальные системы может предоставить нам более широкие возможности для получения доклинические доказательство концепции исследования, которые необходимы для преодоления разрыва между грызунов исследования и клинические испытания. Здесь мы приводим хирургический метод для администрирования лекарства для внутреннего уха общей игрунка через мембрану круглое окно. Чтобы получить четкое представление вокруг круглое окно без манипулирования барабанной перепонки, которая может привести к потере Кондуктивная слуха, это полезно для подхода из полости сосцевидного. Клинически этот подход, именуемый «задняя tympanotomy» прочно и обычно используется для кохлеарной имплантации и Холестеатома хирургии. Мы считаем, что задняя tympanotomy позволяет нам выполнять точные отправления наркотиков не вызывая потери слуха.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все экспериментальные процедуры проводились в университете Jikei, Токио. Животных обработки и экспериментальной процедуры были одобрены институциональные животное уход и использовать Комитет Jikei университета (утверждение не: 26-060) и осуществляется в соответствии с институциональных руководящих принципов для использования лабораторных животных на Jikei Университет, который согласен с руководящими принципами для надлежащего поведения животных экспериментов науки Совета Японии (2006). Уход за животными было проведено в соответствии с рекомендациями руководства для ухода и использования лабораторных животных (Институт лабораторных животных ресурсов, 1996).

1. предоперационное обследование

  1. Возьмите головы компьютерная томография (КТ) сканирования животных (общие мартышек) для того, чтобы облегчить идентификацию отдельных анатомических структур по крайней мере один месяц до операции.
  2. Осуществляют аудиометрических тестах по крайней мере за один месяц до операции.
    Примечание: Здесь, мы использовали ABR для оценки состояния слуха. Кратко положительного электрода подкожно был помещен на вершины и отрицательный электрод сравнения на базе спинной стимулировали уха. Электрод земли подкожно помещался в спинной части шеи. 17 , 18 abr были evoked с всплеск тон (1,0 мс тон лопнул продолжительность с 0,1 мс подъем и падение время). Затем в 10 дБ от его максимальной амплитуды был сокращен уровень звука. На каждом уровне звука 512 ответы были среднем (с стимул полярности чередовались). ABR порог был определен как низкий уровень звукового давления (SPL) на которой любой волны могут быть обнаружены.

2. анестезия

  1. Быстрый животных от ночи до операции под общим наркозом.
  2. Администрирование изофлюрановая 4% и окружающего воздуха в 5-6 мл/мин с вентиляцией маски к лицу или в камеру индукции для медленных индукции (рис. 1A). Подтвердите, что животное не реагирует на болезненные стимулы, такие как щепотка мыс.
  3. Anesthestize общие мартышек с внутримышечной инъекции (в бедренных мышц) комбинации medetomidine (0,04 мг/кг), мидазоламом (0,4 мг/кг) и Буторфанол (0,4 мг/кг).
  4. Подкожно вводить ампициллин (0,08 мг/г) 30 мин или более до разрез кожи как дооперационном антибиотик.
  5. Месте Мармосет в лежачем положении с головой к верхней и расширить головы и шеи. Исправить верхней челюсти в таблицу с капроновая нить и потяните вверх язык, чтобы получить хороший вид или использовать Ларингоскоп визуализировать надгортанник и вступление гортани альтернативно (рис. 1B).
  6. Вставьте эндотрахеальную трубку вдоль поверхности гортани надгортанник.
    Примечание: Можно использовать 16-го калибра внутривенного катетера, или 6-французский датчика питания трубки, как эндотрахеальную трубку (рис. 1 c).
  7. Проверьте EtCO2 с эндотрахеальной трубки для того, чтобы подтвердить, что он был правильно помещен в трахею. После того, как расположены трубки и дыхательных газовых движение был проверен, исправьте эндотрахеальной трубки игрунка лицо с лентой.
  8. Поддержание анестезии между 1-3% изофлюрановая во время операции.
  9. Мониторинга SpO2, EtCO2, температуры тела и ректальной температуры во время операций. Выполните все процедуры на нагревательный мат для предотвращения снижения температуры тела.

3. предоперационная подготовка

  1. Подготовить игрунка в лежачем положении и наклонить голову до 30-45 градусов в сторону non оперативная (рис. 2A).
  2. Бриться после аурикулярных региона постановляющей части.
  3. Дезинфекция хирургические области с алкоголем и повидон йод, как в регионе после аурикулярной и внешний слуховой канал.
  4. Поместите лист хирургической портьера с круглым отверстием на игрунка (рис. 2B).

4. хирургические процедуры

  1. Придать 1% раствора лидокаина гидрохлорида (с картирование эпинефрина, 0,1-0,2 мл) подкожно в сайт разрез кожи. Сделать надрез в заушной кожи с лезвием №15-округлой формы.
  2. Для гемостаза приложите давление к области кровотечения, с помощью Марли, пропитанной разбавленным 1:5,000 адреналина. Биполярное прижигания является также эффективным (рис. 2 c).
  3. Откройте мягких тканей после аурикулярных региона так что ушной хрящ (c) и пост ушная мышца (m) может быть признан. Разоблачить внешний слуховой канал кости, которая должна быть видимой в глубине хряща (рис. 3A).
  4. Чтобы подтвердить глубину барабанной перепонки, разоблачить костной части барабанные обод, который может быть признан адгезии кожи и костей в самой глубокой части заднего канала уха.
    Примечание: Этот шаг позволяет нам признать, насколько глубоко в боковой части полости среднего уха (рис. 3A).
  5. Пил после аурикулярных мышцы (ключично мышц, ременная мышца головы и задняя живот двубрюшной мышцы) к хвостовой аспект, отделены от височной кости. Затем подвергайте боковой поверхности височной кости (звездочка на рисунке 3B).
  6. Сделайте отверстие около 5 мм за внешний слуховой канал с там алмаз 1,0 мм (рис. 3 c). Используйте дрель скорость 1000-8000 об/мин в зависимости от буровой.
    Примечание: Медленная скорость является достаточным для деликатные манипуляции вблизи полукружных канала или лицевого нерва. Капать физиологического раствора в процессе бурения сайта правильно, чтобы предотвратить тепловой травмы.
  7. Увеличить отверстие, бурения и подтвердить позицию горизонтальных полукружных канала (HSC), который выпуклости к полости сосцевидного (рис. 3D).
  8. Подтвердите позицию лицевого нерва, вертикальная часть которого проходит передней HSC. Дрель и удалите все кости септы, если они существуют, чтобы получить четкое представление о лица перерыва, который расположен в центре треугольной площади между лицевого нерва и хорда барабанная.
  9. Сделать небольшое отверстие, бурение между вертикальной части лицевого нерва и барабанные ОПРАВЫ (звездочка в рисунке 4A) с 0,6 мм диаметр алмазного бора при 1000 об/мин.
  10. Переместите bur параллельно стене заднего канала для предотвращения повреждения лицевого нерва, который можно рассматривать как розовая линия через разбавлять кость. Остановите бурение непосредственно перед нерв подвергается как структура белой линией (рис. 4В).
  11. Убедитесь, что круглое окно ниши могут быть визуализированы через отверстие (рис. 4 c). Затем администрировать наркотики в нишу с 25-го калибра или тонкие иглы. Чтобы сохранить наркотиков в нише круглое окно, место вязкий раствор на нишу (рис. 4 d).
  12. После подтверждения, что гемостаза является надежно контролируемых, закройте слоя (слоя эпидермиса и дермы слой) с простой Прерванный швом с использованием абсорбирующего нити 6-0.
  13. Fix марлю на хирургической раны и наложить повязку.

5. послеоперационный уход

  1. Администрировать Атипамезола гидрохлорид (0,15 мг/кг) внутримышечно в бедренной мышцы, чтобы раздражать medetomidine.
  2. Когда спонтанное дыхание начинается, удалите эндотрахеальной трубки.
  3. Поддержание общей игрунка в отделении интенсивной терапии на 30% O2, 29 ℃ до анестезии прекратит завершить возбуждение.
  4. Подтверждают, что существует никаких выводов наводящий вестибулярной дисфункции, такие как нистагм и возвращение животное в клетке размножения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Задняя tympanotomy была выполнена без каких-либо осложнений, таких как хирургический сайт инфекции, кровотечение с сосудистых повреждений или вестибулярной дисфункции, которая иногда происходит с среднего уха манипуляции. Мы выступали задняя tympanotomy на правом ухе общих игрунка 7-год старое и ведении 1 мкл фосфатный буфер для нишу круглое окно. Abr были измерены до и через два месяца после операции (рис. 5A-B). Волны и пороги ABR, были соп...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Объем потока улитковый крови крайне мала, по оценкам, составляют порядка 1/1000000 всего сердечного выброса в организме человека, и доступ ограничивается наличием барьер крови улитки, которая отделяет внутреннее ухо от общей циркуляции19 ,20. По этим причинам наркотиков или вирусный вектор администрации в внутреннего уха благоприятна, не через системного администрирования путём прямого управления. В мыши и морской свинки экспериментов, были отмечены различные по...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Работа выполнена при поддержке грантов м.ф. от правительства Японии МПКСНТ KAKENHI (24592560, 15 H 04991 и 15 K 15624) и Такэда научный фонд для м.ф. и Jikei университет стратегических приоритетов Фонд исследований в H.J.O.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
обыкновенная мартышкаCLEA ЯпонияEDM:C.Marmoset(Jic)
изофлуранPhizer
медетомидинZENOAQ
мидазоламастеллас
буторфанолMeiji Seika
ампициллинMeiji Seika
лидокаина гидрохлоридАстраЗенека
  6-0 абсорбирующая нитьETHICONRD-1
атипамезола гидрохлоридZENOAQ
фосфат буферный солевой растворWako045-29795
Surge WaveMoritaTR-900-OR
Алмазный брусок 006Morita14070057
алмазный брусок 010Morita14070081
Отделение интенсивной терапииMenixP-100

Ссылки

  1. Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Cochlear synaptopathy in acquired sensorineural hearing loss: Manifestations and mechanisms. Hear Res. 349, 138-147 (2017).
  2. World Health Organization. Deafness and hearing loss (Fact sheet N8300). , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs300/en/ (2015).
  3. Thompson, D. C., et al. Universal newborn hearing screening: summary of evidence. JAMA. 286 (16), 2000-2010 (2001).
  4. Wang, X. Neural coding strategies in auditory cortex. Hear Res. 229 (1-2), 81-93 (2007).
  5. Wang, X. On cortical coding of vocal communication sounds in primates. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (22), 11843-11849 (2000).
  6. Bendor, D., Wang, X. The neuronal representation of pitch in primate auditory cortex. Nature. 436 (7054), 1161-1165 (2005).
  7. Bendor, D., Wang, X. Neural coding of periodicity in marmoset auditory cortex. J Neurophysiol. 103 (4), 1809-1822 (2010).
  8. Eliades, S. J., Wang, X. Sensory-motor interaction in the primate auditory cortex during self-initiated vocalizations. J Neurophysiol. 89 (4), 2194-2207 (2003).
  9. Eliades, S. J., Wang, X. Dynamics of auditory-vocal interaction in monkey auditory cortex. Cereb Cortex. 15 (10), 1510-1523 (2005).
  10. Eliades, S. J., Wang, X. Neural substrates of vocalization feedback monitoring in primate auditory cortex. Nature. 453 (7198), 1102-1106 (2008).
  11. Hosoya, M., Fujioka, M., Ogawa, K., Okano, H. Distinct Expression Patterns Of Causative Genes Responsible For Hereditary Progressive Hearing Loss In Non-Human Primate Cochlea. Sci Rep. 6, 22250(2016).
  12. Hosoya, M., Fujioka, M., Kobayashi, R., Okano, H., Ogawa, K. Overlapping expression of anion exchangers in the cochlea of a non-human primate suggests functional compensation. Neurosci Res. 110, 1-10 (2016).
  13. Sasaki, E., et al. Generation of transgenic non-human primates with germline transmission. Nature. 459 (7246), 523-527 (2009).
  14. Sato, K., et al. Generation of a Nonhuman Primate Model of Severe Combined Immunodeficiency Using Highly Efficient Genome Editing. Cell Stem Cell. 19 (1), 127-138 (2016).
  15. Sasaki, E., et al. Establishment of novel embryonic stem cell lines derived from the common marmoset (Callithrix jacchus). Stem Cells. 23 (9), 1304-1313 (2005).
  16. Tomioka, I., et al. Generating induced pluripotent stem cells from common marmoset (Callithrix jacchus) fetal liver cells using defined factors, including Lin28. Genes Cells. 15 (9), 959-969 (2010).
  17. Harada, T., Tokuriki, M. Effects of click intensity and frequency on the brain-stem auditory evoked potentials in the common marmoset (Callithrix jacchus). J Vet Med Sci. 59 (7), 561-567 (1997).
  18. Harada, T., Tokuriki, M., Tanioka, Y. Age-related changes in the brainstem auditory evoked potentials of the marmoset. Hear Res. 128 (1-2), 119-124 (1999).
  19. Juhn, S. K., Hunter, B. A., Odland, R. M. Blood-labyrinth barrier and fluid dynamics of the inner ear. Int Tinnitus J. 7 (2), 72-83 (2001).
  20. Nakashima, T., et al. Disorders of cochlear blood flow. Brain Res Brain Res Rev. 43 (1), 17-28 (2003).
  21. Akil, O., Rouse, S. L., Chan, D. K., Lustig, L. R. Surgical method for virally mediated gene delivery to the mouse inner ear through the round window membrane. J Vis Exp. (97), (2015).
  22. Jero, J., Tseng, C. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. A surgical approach appropriate for targeted cochlear gene therapy in the mouse. Hear Res. 151 (1-2), 106-114 (2001).
  23. Iizuka, T., et al. Noninvasive in vivo delivery of transgene via adeno-associated virus into supporting cells of the neonatal mouse cochlea. Hum Gene Ther. 19 (4), 384-390 (2008).
  24. Kilpatrick, L. A., et al. Adeno-associated virus-mediated gene delivery into the scala media of the normal and deafened adult mouse ear. Gene Ther. 18 (6), 569-578 (2011).
  25. Yamasoba, T., Yagi, M., Roessler, B. J., Miller, J. M., Raphael, Y. Inner ear transgene expression after adenoviral vector inoculation in the endolymphatic sac. Hum Gene Ther. 10 (5), 769-774 (1999).
  26. Kawamoto, K., Oh, S. H., Kanzaki, S., Brown, N., Raphael, Y. The functional and structural outcome of inner ear gene transfer via the vestibular and cochlear fluids in mice. Mol Ther. 4 (6), 575-585 (2001).
  27. Praetorius, M., Baker, K., Weich, C. M., Plinkert, P. K., Staecker, H. Hearing preservation after inner ear gene therapy: the effect of vector and surgical approach. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 65 (4), 211-214 (2003).
  28. Nakagawa, T., et al. Topical insulin-like growth factor 1 treatment using gelatin hydrogels for glucocorticoid-resistant sudden sensorineural hearing loss: a prospective clinical trial. BMC Med. 8, 76(2010).
  29. Piu, F., et al. OTO-104: a sustained-release dexamethasone hydrogel for the treatment of otic disorders. Otol Neurotol. 32 (1), 171-179 (2011).
  30. Plontke, S. K., et al. double blind, placebo controlled trial on the safety and efficacy of continuous intratympanic dexamethasone delivered via a round window catheter for severe to profound sudden idiopathic sensorineural hearing loss after failure of systemic therapy. Laryngoscope. 119 (2), 359-369 (2009).
  31. Wenzel, G. I., Warnecke, A., Stover, T., Lenarz, T. Effects of extracochlear gacyclidine perfusion on tinnitus in humans: a case series. Eur Arch Otorhinolaryngol. 267 (5), 691-699 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Доставка лекарственных средствзадняя тимпанотомияниша круглого окнавызванные слуховые потенциалы ствола мозгалицевой нервцепь слуховых косточеквисочная кость
Хирургическая процедура для администрации лекарства для внутреннего уха в Non-Human приматов общие игрунка (Callithrix jacchus)
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.