Методическая статья

Улучшение 3D гидрогеля культур первичных глиальных клеток In Vitro моделирования Neuroinflammation

15.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56615

⸱

8 декабря 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Psychiatry, University of Alberta, 2Alberta Innovates-Health Solutions Interdisciplinary Team in Smart Neural Prostheses (Project SMART), University of Alberta, 3Department of Chemical and Materials Engineering, University of Alberta, 4Division of Physical Medicine and Rehabilitation, University of Alberta, 5Centre for Neuroscience, University of Alberta

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол для 3D культуре крысы клеток мозга, полученных глии, включая астроциты, Микроглия и олигодендроциты. Мы демонстрируем культуры главной ячейки, гидрогеля синтез methacrylated гиалуроновой кислоты (HAMA), HAMAphoto полимеризации и ячейки инкапсуляции и образец обработки для конфокальных и сканирования электрона микроскопических изображений.

Аннотация

В центральной нервной системе, многочисленные острые травмы и нейродегенеративных расстройств, а также имплантированных устройств или биоматериалов инженерии для повышения функции результат в тот же результат: избыточное воспаление приводит к глиоза, цитотоксичность, и/или формирование глиальных шрам, коллективно усугубляют травмы или предотвратить здоровое восстановление. С целью создания системы для моделирования глиальный рубец образование и исследование воспалительных процессов, мы породили 3D клеток леску вмещать первичной культивировали глиальные клетки: микроглии, регулировать инородного тела ответа и инициировать воспалительные событие, астроциты, которые отвечают сформировать волокнистых шрам и олигодендроциты, которые обычно уязвимы к воспалительным травмы. Настоящая работа обеспечивает подробный пошаговый метод для изготовления, культуры и микроскопическая характеристика леску на основе гиалуроновой кислоты 3D гидрогеля с инкапсулированным крыса мозга производные глиальных клеток. Кроме того демонстрируются протоколы для характеризации клеток инкапсуляции и гидрогеля леса конфокальный иммунофлюоресценции и сканирующей электронной микроскопии, а также способность изменить на эшафот с биоактивными субстратов, с учет коммерческих базальной пластинки смесь Улучшенная ячейка интеграции.

Введение

Воспаление центральной нервной системы (ЦНС) уже давно считается признаком острого (например, ишемического инсульта, черепно-мозговой и травмы спинного мозга) и хронические (например болезнь Альцгеймера, Паркинсона и болезни Хантингтона) травмы ЦНС, Однако все шире признается как причинная вклад нейродегенеративных и нервно-психиатрическими расстройствами. Устойчивый или неуместным воспаление может вызвать нейронных травмы и демиелинизации (например рассеянный склероз) и негативно повлиять на развитие мозга (например, шизофрения, аутизм) и настроения государств (например, депрессии, тревоги Биполярное расстройство). Кроме того, Роман терапевтические стратегии, с помощью имплантируемых устройств (например., мозг компьютер интерфейсы1,2,3, глубокие мозга стимуляции4,5, межпозвонковые microstimulation6,,78,9,10) создания предсказуемой воспалительной реакции на стыке между устройством и ЦНС, что приводит к ответ защитной ткани, что может привести к потере эффективности или устройство отказа в течение имплантат11. Воспаления в ЦНС инициируется обычно микроглии, который функционировать в качестве резидентов иммунные клетки ЦНС, ответственных за наблюдение ткани и монтаж инородного тела ответа (обзор12). В зависимости от тяжести оскорбления, микроглии сигнал и набирать дополнительные ячейки типы сайт травмы. В частности микроглии активировать астроциты, которые в свою очередь выступают в качестве вторичных воспалительных клеток и формы плотный защитный барьер содержать травмы сайт13,14. Микроглии может также инициировать деятельность Каскад в клетках периферической иммунной системы, которая может привести к срыву BBB разрешить иммунной инфильтрат (обзор в ссылка15).

В случае устройства имплантируется в ЦНС ткани, ущерб от вставки устройства, а также продолжающееся присутствие иностранных устройства может инициировать процесс называют глиальных рубцов. В этом процессе микроглии мигрировать и размножаться на месте травмы. Они также инициировать освобождение воспалительных факторов для нейтрализации потенциальных угроз и набирать дополнительные глиальных клеток. Впоследствии активированные астроциты стать гипертрофических и начать инкапсуляции имплантированный сформировать непрерывный волокнистых барьер16. Воспалительные сигнализации также служит для поощрения вывода нейрональные процессы из окрестностей имплантата и в конечном итоге новобранцев фибробласты для укрепления развивающихся глиальный рубец17. Олигодендроциты, ответственных за обрешетки нейронов в миелина повышения проводимости, не пережить этот процесс и дальних клетки разделены от имплантата шрам18. Глиальные рубцов значительно уменьшает функции и жизни имплантированных устройств, особенно для записи электродов и в конечном счете служит для ограничения функциональности нейронных интерфейсы19.

Чтобы увеличить биосовместимость и действие интерфейса имплантированных устройств в ЦНС20,21,,2223использовались несколько подходов. Обширный обзор доступен на биосовместимых дизайн эти нейронные интерфейсы24. Наиболее известные стратегии включают в себя окружающие электрод с совместимыми покрытий, таких как polyelthyleneglycol (PEG), polylactic-co гликолевой кислоты (PLGA)25, или повышение электрод с электропроводящие полимеры, такие как поли (этилена dioxythiophene) (PEDOT) и политиофен (PPy)26,27,28,,2930,31. Биоактивные покрытия также были использованы для предоставления подсказок для роста нервной ткани, используя лигандов, производный от внеклеточной матрицы, включая коллагены, fibronectins и гиалуроновой кислоты32,33,34 ,35,,3637. Биологическую этих покрытий была изучена далее с фактором роста выпуска систем для имитации природных клеток выделениями30,,3839,40,41 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50. одновременно, некоторые исследовательские группы решили переделывать геометрия электрода, гибкость и композиции для уменьшения механического несоответствия между устройством и ткани51,52,53 ,54,55,56,57. В целом эти стратегии привели к множество многообещающих улучшений в нейронных межфазного устройств следующего поколения, однако долгосрочные совместимость является вопросом продолжается, и прогресс может сдерживаться сложным и длительным в vivo модели .

Животных подходы, основанные на модели можно ограничить экспериментальной пропускную способность и увеличить стоимость тестирования биосовместимость электрода. В vitro подходы с использованием обычных клеточной культуры техники предлагают более экономически эффективные альтернативы, но не резюмировать большую сложность взаимодействия между устройством и ткани58. В частности тестирование поверхности покрытий с использованием 2D клетки культуры ограничения моделирования геометрии электрода и влияние механического несоответствия и micromotion мысли способствовать генерации хоста ответ, способствуя устройство отказа59 , 60.

Преодолеть проблемы, связанные с 2D клеточной культуры, гидрогеля культур нервные клетки были разработаны для широкого спектра приложений, фармакологические исследования61, направлять нейронных клеток дифференциации62, чтобы понять болезнь пути63,64, или слоистых в совместное культуры с другими типами клеток модели миграции клеток, нейропротекторного эффекта, или модель ткани микросреды61. Гидрогели легко образуются в разных размеров и геометрии может включать многочисленные типы первичных или увековечен клеточных культур и очень поддаются анализа часто используемые методы, такие как конфокальный флуоресцентной микроскопии. Для создания модели процесса глиальных рубцов, мы недавно разработали и охарактеризовала систему гиалуроновой кислоты на основе гидрогеля 3D для высокой пропускной способности тестирования глиальных реакции имплантированных электродов (рис. 1)65. Эта система имеет ряд отличительных преимуществ: 1) первичных глиальных клеток (микроглии астроциты и Олигодендроциты), инкапсулированным в 3D-матрицы состоит из полимеров гиалуроновой кислоты, которая является компонентом эндогенного внеклеточная матрица; 2 матрицы жесткости можно «настроить» воссоздать механические свойства головного или спинного тканей; и 3) клетки может быть инкапсулирована в матрице в быстрый настольное подход с использованием фотополимеризации с зеленым светом, ограничение токсичности при инкапсуляции. Эта система позволяет ключевые особенности в vivo биосовместимость: устройств вставляются в гидрогеля на основе сопоставимых ткани, и клеточный ответ на имплантированного устройства контролируются для широкого спектра параметров65. К ним относятся механические несоответствие между устройствами и гидрогеля покрытий различных структур и электрическая стимуляция импульсами. Эта система также включает в себя Олигодендроциты и связанной с прекурсорами, которые часто присутствующих и набранных в глиальных шрамы. Их повреждение, смерть и фагоцитоз, микроглии весьма показательны воспалительных повреждений и как модель уменьшить рубцы или восстановления, они имеют способность продемонстрировать ре миелинизации нейронов66.

Здесь мы описываем метод синтеза и формирование гибридных гидрогели гиалуроновой кислоты в сочетании с коммерчески доступных базальной мембраны составов для улучшения ячейки инкорпорации. Кроме того мы покажем включения первичных культивировали глиальных клеток (микроглии, астроциты и Олигодендроциты) и анализ роста культуры с использованием иммуноцитохимии и confocal микроскопии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Протокол для извлечения ткани мозга от 1 день Sprague-Dawley крыса щенков, умерщвлены, обезглавливание, был одобрен животное уход и использование Комитетом в университете Альберты.

1. Микроглия и экзоцитоз изоляции67,68

Примечание: Все средства массовой информации для изоляции и культуры клеток подогревается до 37 ° C на водяной бане. Хэнк сбалансированного солевого раствора (HBSS) имеет 1% пенициллин стрептомицином (PS). Все Дульбекко изменение орла СМИ с ветчиной F12 питательной смеси (DMEM/F12) дополняется плода бычьим сывороточным (ФБС) 10% и 1% пенициллин стрептомицином (PS). Только смеси с трипсином отсутствие FBS. Все материалы в этом протоколе являются стерильные (фильтр, алкоголя, приобретенных и автоклавного твердения) и каждый шаг после шаг номер 1.8 выполняется в области биобезопасности, кабинет с асептической техники.

  1. В мозг Нагрейте 15 мл HBSS и 12,5 мл DMEM/F12 до 37 ° C в 50 мл конические пробирок и примерно 2 мл 0,25% трипсина с 1 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) в 15 мл конические пластиковых пробирок. Тепло еще 25 мл DMEM/F12. Теплый трипсина около 10 мин до использования для предотвращения утраты ферментативную активность.
  2. Налить достаточно теплой HBSS в стерильные, 6 и 10 см культуры блюда для покрытия поверхности. Подготовьте одно блюдо 10 см на каждые два мозги плюс дополнительные 6 см блюдо.
  3. Место до 2 мозги в каждое блюдо2 10 см (рис. 2A).
  4. Под микроскопом, рассечение Используйте щипцы изогнутые и прямой для разделения коре вдоль средней линии и мозжечка с мозга. Это дает три секции ткани в мозг (рис. 2B).
  5. Чистить тонкий, полупрозрачные, слой (мозговых оболочек) ткани, содержащие кровеносных сосудов из каждого раздела ткани и удалить, перевода на остальные ткани в отдельной культуры блюдо. Понять тонкие слои, предоставляемые порезов ткани, с щипцами и осторожно потяните до тех пор, пока основные части «висит у» ткани мозга. Наконец, удалите эту часть, нежно дергая. Посмотреть Рисунок 2 c-2E для представителя изображения до, во время и после этого шага.
  6. В области биобезопасности кабинета удалите оставшиеся HBSS из культуры блюдо, тщательно сохраняя ткани. Размачиваем ткани с помощью скальпеля и передачи ткани к подогретым 15 мл пробке трипсином.
  7. Инкубируйте этой трубки 25 мин в ванне с 37 ° C ферментативно переваривать ткани.
  8. Центрифуга трубку вниз на 500 x g на 2 мин при комнатной температуре и вылейте супернатант.
  9. С помощью Пипетки серологические 10 мл, добавьте 10 мл теплой среде DMEM/F12 инактивирует трипсина и нарезанных решение 5 раз с распадаются на ткани.
  10. Центрифуга трубку вниз на 500 x g на 2 мин при комнатной температуре и вылейте супернатант.
  11. С помощью Пипетки серологические 10 мл, вновь приостановить Пелле в 10 мл теплой среде DMEM/F12 и решение передать 50 мл конические пластиковых пробирок.
  12. С помощью 10 мл шприц с иглой 18 калибр, нарезанных решение 3 раза.
  13. Распространите это решение в с шагом 12,5 мл теплой среде DMEM/F12 в мозг.
  14. Пипетка с шагом 1 мл раствора порошкового в 12 хорошо плиту (1 в мозг).
  15. Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO2в инкубатор культуры увлажненные клеток. Заменить СМИ после трех дней и обновить СМИ каждые последующие три дня. После 2 недель клетки могут быть собраны для экспериментов.

2. Macromer синтез69

  1. Весят 375 мг гиалуроновой кислоты (HA) соли в 50 мл конические пластиковых пробирок и добавьте 37,5 мл дистиллированной воды.
  2. Очистить решение с Вортекс за 1 мин и sonicate смесь до тех пор, пока она появится однородная и теряет свою вязкость гель как. Этот процесс может занять 6 ч.
  3. Решение передачи 100 мл стакан с магнитным перемешать бар (38 мм) и размешивать энергично при комнатной температуре.
  4. Тщательно Титруйте 5.0 M NaOH в HA и измерения рН бумагой, до тех пор, пока pH стабилизирует между 8 и 12.
  5. Соберите 3 мл ангидрида (MA, 94%), свежие метакриловой покрыты азота во время хранения.
    Примечание: Ма подвергается воздействию атмосферы для длительного времени (дней), он будет терять свою реактивности.
    Предупреждение: Использование Ма должно быть сделано в зонта.
  6. Добавьте 200 мкл в смешивая раствор ха ма. Реакция понижает рН раствора ниже 8.
  7. Повторите шаги с 2,4 до 2,6 до 3 мл Ма были добавлены в решение. Этот процесс может занять до 1-2 ч.
  8. Разрешить реакции продолжать на ночь при 4 ° C, без перемешивания.
  9. Передача решения в 400 мл холодного этанола (EtOH) в 500 мл стакан и позволяют осадков для 24-72 ч при 4 ° C. 56
  10. Тщательно сцеживаться основную часть решения в отдельный стакан для утилизации и собрать осадок в 50 мл конические пластиковых пробирок. Это могут быть распределены в 2-4 трубы, при необходимости.
  11. Центрифуга для трубы на 200 x g в центрифуге на 2 мин при комнатной температуре и распоряжаться супернатант.
  12. Топ вверх по трубе с холодной EtOH, mix решение с Вортекс за 1 мин и повторите шаг 2.10-2.11.
  13. Добавить 25 мл стерильного деионизированной воды, перемешать раствор с Вортекс за 1 мин, sonicate (> 20 кГц) за 1 ч и Инкубируйте на 4 ° C на ночь.
  14. Поместите раствор в холодильнике-80 ° C 15 минут или до тех пор, пока заморожен или флэш замораживание в жидком азоте.
    Предупреждение: При использовании жидкого азота, используйте защитные перчатки, щит и фартук.
  15. До тех пор, пока порошок снег как производится заморозить сухой трубки (ниже 0,1 мбар и -30 ° C) для 24-48 ч.
  16. На данный момент Тестирование образца для чистоты через 1H ЯМР, где количество протонов (пики на 6.1 и 5,6 ppm), метакрилат относительно бромистого протонов (1,9 ppm), на HA позвоночника могут быть подтверждены. Минимальный коэффициент метакрилат 95% для протонов метил является приемлемым. 69

3. крем для формирования 3D инкапсуляции65

  1. Coverslip и подготовка плесени
    1. Сделать 50 мл дистиллированной воды раствор 2% 3-(Trimethoxysilyl) метакрилата пропил в 50 мл конические пластиковых пробирок.
    2. Место 18 мм стекла coverslips в растворе и рок за 1 ч при комнатной температуре. До 50 coverslips могут быть добавлены сразу.
    3. Промывайте coverslips серийно окунания в 3 стаканах 100 мл деионизированной воды.
    4. Сухой coverslips в вакууме при 40 ° C на ночь с эксикаторе и духовкой.
    5. Быстро погружать отдельные coverslips в 70% EtOH пинцетом.
    6. Без сушки, падение каждый coverslip в колодец 12 хорошо плиты.
    7. Вымойте и аспирационная каждой скважины с стерильной дейонизированной водой (1 мл на хорошо).
    8. Добавить 1 мл стерильного 2 мкг/мл поли L-лизин (PLL) в каждой скважине и проинкубируйте > 2 ч.
    9. Аспирационная PLL раствор и дайте высохнуть coverslips воздуха.
    10. Погрузите polydimethyl силоксановые (PDMS) формы (см. Рисунок 1) в 70% EtOH и одно место на центр каждого coverslip и дайте высохнуть на воздухе и уплотнение между плесени и стекла.
      1. Подготовьте PDMS формы литья PDMS премикс реагенты в соотношении 10:1 в блюдо плоскодонной полистирола. Количество подготовленных PDMS выбран приносить лист толщиной около 1 мм. Для скважин форме PDMS, разрезать листы с удар круг с внутренним диаметром 10.
  2. Подготовка клетки
    Примечание: Все шаги в протоколе выполняются с стерильных в биобезопасности кабинета. Фосфат буфер солевой раствор (PBS) корректируется рН 7,4 для всех шагов.
    1. за 24 часа до ячейки инкапсуляции в Хаме, обновите среднего для основных культур 2 недели (от шаг 1.15) в 12 хорошо пластины. Добавьте 1 mL DMEM/F12 (10% FBS и 1% PS) средний за хорошо.
    2. Для каждой пластины 12-ну клеток готовят 12,5 мл разбавленной трипсина (0,25% трипсина ЭДТА разбавленный 30% с СМИ в среде DMEM/F12) и 25 мл DMEM/F12 (10% FBS и 1% PS) и тепло при 37 ° C на водяной бане.
    3. Собирать с кондиционерами среднего из плит с помощью Пипетки серологические 10 мл (> 0,5 мл на колодец), тщательно аспирационная оставшуюся жидкость и заменить 1 мл на хорошо разбавляют трипсина (0,075% трипсина ЭДТА) для 20-30 мин в инкубаторе (37 ° C, 5% CO2) до вырожденная клеток слой отсоединяется от пластины.
    4. Восстановление приостановлено клеточный материал с 1 мл пипетки (появляется как единый кусок плавающей) и собирать в 15 мл конические пластиковых пробирок. Разбавляют эквивалентный объем DMEM/F12 (10% FBS и 1% PS) и центрифуги на 200 x g на 2 мин при комнатной температуре, отбрасывая супернатант.
    5. Ресуспензируйте Пелле клеток в 10 мл теплой среде DMEM/F12 (10% FBS и 1% PS), нарезанных клетки 5 раз с 10 мл пипетки и центрифуги на 200 x g на 2 мин.
    6. Декант супернатанта, вновь приостановить клетки в 5 мл теплой среде DMEM/F12 и клетки перехода к 50 мл конические пластиковых пробирок.
    7. Используя шприц 10 мл с иглой 18 калибр, нарезанных ячейки решения 3 раза и фильтр подвеска через сито клеток 40 мкм в новой конические пластиковых пробирок.
    8. Собирать 10 мкл суспензии клеток, разбавьте 1: 100 в теплой среде DMEM/F12 и подсчет количества ячеек с автоматизированной клеток счетчиком
    9. Инкубируйте в ванну воды 37 ° C до инкапсуляции шаг.
  3. Инкапсуляция ячейки
    Примечание: Все шаги в протоколе выполняются с стерильных в биобезопасности кабинета.
    1. Для каждого 12-ну плита 3D гидрогели теплый 12,5 мл DMEM/F12 и 12,5 мл кондиционером DMEM/F12 СМИ, собранных в ходе подготовки клетки.
    2. Взвесить количество methacrylated гиалуроновой кислоты (HAMA), необходимые для окончательного концентрации 0,5% wt/vol. распустить этот Хама в стерильного отфильтрованного PBS в концентрации (wt/vol 2%); концентрация 4 раза выше, чем конечная концентрация используется для размещения дополнительно клеток и других реагентов. Один из 12 хорошо пластины гидрогелей требует ~ 350 мкл PBS с 7 мг Хама.
    3. Sonicate (> 20 кГц) решения пока Хама полностью растворится за 60 мин.
    4. Подготовка индивидуальных 10% растворы триэтаноламин (чай) и 1-Винил-2-pyrrolidinone (НВП) и 1 мм раствор эозина Y (EY) в 1 мл аликвоты стерильных PBS рН 7,4.
    5. Для одного 12 хорошо пластины, сделать окончательный 1.4 мл смесь из 1 x 107 клеток, 0,5% wt/vol Хама 0,1% (350 мкл wt/vol 2%), чай (14 мкл 10%), 0,1% НВП (14 мкл 10%) и 0,01 мм Еу (14 мкл 1 мм) и 20% базальной пластинки смесь (280 мкл акций). Оставшийся объем-PBS.
    6. Аккуратно перемешать раствор и Пипетка 100 мкл в каждом PDMS плесень с наконечником, 1 мл.
    7. Подвергать образцы высокой интенсивности зеленый светодиодный свет (~ 520 Нм, 60 МВт, в закрытых 20 см х 20 см х 20 см коробка) за 5 мин при комнатной температуре.
    8. Добавьте 1 мл на хорошо теплой кондиционером DMEM/F12 12 хорошо пластины.
    9. Понять каждый coverslip между большим и указательным пальцами, медленно слезает PDMS плесень с Изогнутый пинцет, соблюдая осторожность, чтобы не вытеснять гель и поместите его в колодец с кондиционером среднего.
    10. Добавить еще 1 мл теплой среде DMEM/F12 для каждой скважины.
    11. Инкубируйте пластины при 37 ° C с 5% CO2 на 2 недели, освежающий ячейки СМИ каждую неделю дозирования 1 мл СМИ от каждой скважины и заменив 1 мл DMEM/F12.

4. микроскопия

  1. Immunocytochemistry
    Примечание: Перевернутый Конфокальный микроскоп был использован для изображения этих образцов и ImageJ был использован для обработки и отображения изображений. Микроглии, астроциты, олигодендроциты и ядра, будут помечены после 3 недель в культуре Хама.
    1. Разогрейте 10% PBS-амортизированное формалина (рН 7,0) в ванну 37 ° С.
      Предостережение: Хотя формалин может использоваться за пределами Зонта, этот материал реактивной с ткани и следует обрабатывать с заботой и перчатки всегда. Метод dispose следует отдельно.
    2. Тщательно аспирационная СМИ от плиты и Пипетка 1 мл формалина 10% для каждой скважины.
    3. Инкубируйте пластины при 37 ° C в 5% CO2 на 20 мин.
    4. Аспирационная жидкости из каждой пластины, Пипетка 2 мл PBS (рН 7,4) в каждой скважине и Инкубируйте 15 мин.
    5. Повторите шаг 4.1.4 дважды.
    6. Аспирационная жидкости из тарелки, добавить 1 мл на хорошо PBS с 10% нормальной лошадь сыворотки (ГСЗ) и 0,5% Тритон X-100 и осторожно покачайте на минимальной скорости) за 1 ч.
    7. Повторите шаг 4.1.4 три раза.
    8. Аспирационная жидкости и добавить 1 мл на хорошо следующей смеси в PBS: кролик ионизированного кальция привязки адаптера молекулы (Iba1) 1:1, 000, курица глиальных фибриллово белка (СВМС) 1:5, 000, мышь 2', 3'-циклический nucelotide 3'-phophodiesterase (CNPase) 1:1, 000, 1% ГСЗ , и 0.1% клеточной перфорации ПАВ. Инкубируйте на 4 ° C на ночь, как можно осторожно тряся пластину.
    9. Повторите шаг 4.1.4 три раза с 1 h инкубаций между ними.
    10. Аспирационная жидкости и добавить 1 мл на хорошо следующей смеси в PBS: 647 Нм возбужденных осла анти кролик антител 1: 200, 546 Нм возбужденных коза антитела анти курица 1: 200, 488 нм возбужденных осла антитела анти мыши 1: 200, 1% ГСЗ, 1:1,000 синий ядерных пятно. Инкубации при комнатной температуре за 1 ч, осторожно тряся пластину.
    11. Повторите шаг 4 три раза с 1 h инкубаций между ними.
    12. Чтобы сохранить гидрогели, аспирационная буфер и погрузить их в 0,5 мл клетки монтажа средних за 1 мин пипетку из монтажа средних и осторожно поместите coverslip поверх геля, создание слоя между стеклом. Добавьте небольшое количество монтажа средне открытые стороны coverslips для предотвращения высыхания гидрогеля.
      Примечание: Для устранения неполадок, гели могут отражаться на шаге 4.1.11. чтобы увидеть надлежащей маркировки перед дальнейшей обработкой.
  2. Сканирующая электронная микроскопия (SEM)
    Примечание: Чтобы визуализировать гидрогеля, сканирующий электронный микроскоп был использован для изображения этих образцов.
    1. Нагрейте смесь фиксирующие параформальдегида глютаральдегид и 2%-2,5% в PBS (0,1 М) в ванну воды 37 ° C.
      Предупреждение: Эти реагенты высокой реакционной способностью с тканями и должны быть обработаны с осторожностью и перчатки. Они должны быть обрабатываются в Зонта максимально и утилизировать отдельно.
    2. Аспирационная среднего из плит культуры клеток и добавьте 1 mL подогретую фиксирующие смеси.
    3. Инкубируйте пластины при 37 ° C в 5% CO2 на 20 мин.
    4. Поместите пластины в 4 ° C (холодильник/охладитель) на ночь.
    5. Аспирационная фиксирующие решение из скважин и добавьте 1 mL PBS.
    6. Аспирационная жидкость от каждой плиты, добавить 2 мл PBS в каждой скважине и Инкубируйте 15 мин.
    7. Повторите шаг 4.2.6 еще два раза.
    8. Аспирационная PBS и добавить 1 мл 1% tetraoxide осмий буферизуются в PBS для каждой скважины.
      Примечание: Пока образцы высушиваются, этот шаг и все последующие шаги выполняются в зонта.
    9. Разрешить фиксация происходит за 30 мин осмий паров от жидкости может исправить другие образцы в том же пластины; Таким образом, раздел образцы соответственно перед этот шаг.
      Предупреждение: Осмий tetraoxide высоко реактивной с ткани и летучих. Это опасно и обрабатываться в Зонта с перчатками. Это и любой немедленно промывают должен быть удален отдельно.
    10. Повторите шаг 4.2.6 три раза.
    11. Аспирационная жидкости и добавить обезвоживания смеси в списке ниже, в порядке и проинкубируйте указанное время (комнатной температуры). Начнем постепенно добавляя этанола (EtOH), а затем нажмите Гексаметилдисилазан (ГМДО). См таблицу 2 для каждого приращения.
      Примечание: При добавлении HMDS, coverslips может решительно придерживаться пластика и стать очень трудно удалить. Это может быть предотвращено путем размещения небольшой пластиковой платформы под стекло скольжения после первого применения HMDS. После инкубации второй EtOH образец можно вынимать и закаленных в жидком азоте за несколько секунд, чтобы заморозить разрушения образца.
    12. Осторожно удалите высушенных образцов и подключить образцы на сканирующий электронный микроскоп заглушки с двухсторонней проводящие ленты.
    13. Распыления покрытия образцы с минимальным количеством золота. Поместите образцы в держатель и привестись в действие машину за 2 мин в 15 мА.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

К модели ответа хоста нервной ткани и глиальный рубец в высокой пропускной способности, в пробирке система требует 3D ячейки леску с матрицы материалом, который биосовместимых, не нести цитотоксических событий во время формирования в situ и изменяемые с биоактивными компонентами для руководства благожелательной реакции. С этой целью мы создали систему эшафот 3D ячейки на основе гиалуроновой кислоты и инкапсулируются первичной смешанные глиальных клеток населения для изуч...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

К цели создания 3D культуры системы модель глиальных bioreactivity и глиальных рубцов процесса мы разработали систему, которая может поддерживать основной культурный микроглии, астроциты и Олигодендроциты и обеспечивает надежную характеристику ячейки Морфология и ячеек взаимодействий. От показывает микроскопии морфология каждого типа клеток был совершенно разные с 2D, 3D-Хама и 3D Хама-базальной пластинки смесь платформ. В системе 2D морфология явно предвзятым вдоль плоскости поверхности, но по сравнению с 3D Хама, Микро...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Авторы признательны за финансовую поддержку от Сенти, CFI, AIHS, служб здравоохранения Альберты и Дэви дар для исследования мозга.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильный>1. Материалы для синтеза и фотополимеризации HAMA
Гиалуроновая кислота (HA)Sigma-Aldrich53747-10GStreptococcus equi, MW: 1,5 - 1,8 X 10^6
Метакриловый ангидрид (MA)Sigma-Aldrich275585-100ML
Гидроксид натрия (NaOH)Sigma-Aldrich221465-25G
Этанол (EtOH)Коммерческие спирты Инк.Безводный
фосфат буферный физиологический раствор (pH 7,4) таблеткиFisher Scientific18912014
триэтаноламин (TEA)Sigma-Aldrich90279-100ML
1-винил-2пирролидинон (NVP)Sigma-AldrichV3409-5G
EosinY (EY)Sigma-AldrichE6003-25G
Полидиметилсилоксан (PDMS) Силгард 184 Силикон Набор эластомеровDow Corning
3-(Триметоксисилил)пропилметакрилатSigma-Aldrich440159-100ML
Стакан (100 мл)Стакан Corning1000-100
(500 мл)Corning1000-600
pH бумага (Labstick)Sigma-Aldrich9580
Name< strong>Companyномер в каталогеКомментарии
2. Материалы для выделения глиальных клеток и клеточной культуры
P1-2 Sprague Dawley ratpups Charles RiverCD Sprague Dawley rat код штамма 001
Dissector ножницы - тонкие лезвия (маленькие)Fine Science Tools14081-09
Хирургические ножницы toughcut (большие)Fine Science Tools14130-17
Тонкие щипцы (Dumont #5)Fine Science Tools11521-10
Изогнутые тонкие щипцы (Dumont #7)Fine Science Tools11271-30
Сбалансированный раствор соли Хэнка (HBSS)Gibco14170-112
Модифицированная Дульбекко среда Eagle's и питательная смесь Ham's F-12 (DMEM/F12)Gibco11320-033
Пенициллин-стрептомицин (PS)Gibco15140-122
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Gibco12483-020
0,25% Трипсин-этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)Gibco25200-072
Поли-L-лизин (PLL)Sigma-AldrichP-6282
50 мл коническая центрифужная пробиркаFisher Scientific05-539-13
15 мл коническая центрифужная пробиркаFisher Scientific05-539-5
12 лунок Тарелки для обработки культуры тканей (Cellstar)Greiner Bio-One665 108
10 мл серологическая пипеткаFisher Scientific13-676-10F
25 мл серологическая пипеткаFisher Scientific12-676-10K
чашка Петри (60 мм X 15 мм)Чашка Петри Fisher ScientificFB0875713A
( 100 мм X 15 мм)Fisher Scientific
(18 мм)Fisher Scientific12-545-100 18CIR
Name<strong>CompanyНомер в каталогеКомментарии
3. Материалы для микроскопии (конфокальная и сканирующая электронная микроскопия)
Мышиная моноклональная анти-CNPaseabcam ab6319
Rabbit anti-Iba1Wako Laboratory Chemicals019-17741
Курица анти-GFAPabcamab4674
Hoechst 33342Fisher Scientific62249
Fluoromount-GFisher Scientific00-4958-02
ФормалинSigma AldrichHT501128-4LБуферный (10%)
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
Сыворотка для лошадейGibco16050-122
ПараформальдегидЭлектронная микроскопия науки157-8Буферный (8%)
ГутеральдегидElecton Microscopy Sciences16019Buffered (8%)
Тетраоксид осмияElecton Microscopy Sciences19152Buffered (2%)
Hexamethyldilazan (HMDS)Electon Microscopy Sciences16700
Этанол (EtOH)Electon Microscopy Sciences15055Предметное стекло безводного
микроскопа (25 x 75 x 1 мм)VWR International48311-703
Покровное стекло для микроскопа FB0875712

Ссылки

  1. Shih, J. J., Krusienski, D. J., Wolpaw, J. R. Brain-Computer Interfaces in Medicine. Mayo Clin. Proc. 87, 268-279 (2012).
  2. Kennedy, P. R., Bakay, R. A. Restoration of neural output from a paralyzed patient by a direct brain connection. Neuroreport. 9, 1707-1711 (1998).
  3. Kennedy, P. R., Bakay, R. A., Moore, M. M., Adams, K., Goldwaithe, J. Direct control of a computer from the human central nervous system. IEEE Trans. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 8, 198-202 (2000).
  4. Mayberg, H. S., et al. Deep Brain Stimulation for Treatment-Resistant Depression. Neuron. 45, 651-660 (2005).
  5. Dougherty, D. D., et al. A Randomized Sham-Controlled Trial of Deep Brain Stimulation of the Ventral Capsule/Ventral Striatum for Chronic Treatment-Resistant Depression. Biol. Psychiatry. 78, 240-248 (2015).
  6. Bamford, J. A., Marc Lebel, R., Parseyan, K., Mushahwar, V. K. The Fabrication, Implantation, and Stability of Intraspinal Microwire Arrays in the Spinal Cord of Cat and Rat. IEEE Trans. Neural Syst. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 25, 287-296 (2017).
  7. Holinski, B. J., et al. Intraspinal microstimulation produces over-ground walking in anesthetized cats. J. Neural Eng. 13, 056016(2016).
  8. Toossi, A., Everaert, D. G., Azar, A., Dennison, C. R., Mushahwar, V. K. Mechanically Stable Intraspinal Microstimulation Implants for Human Translation. Ann. Biomed. Eng. 45, 681-694 (2017).
  9. Saigal, R., Renzi, C., Mushahwar, V. K. Intraspinal microstimulation generates functional movements after spinal-cord injury. IEEE Trans. Neural Syst. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 12, 430-440 (2004).
  10. Lau, B., Guevremont, L., Mushahwar, V. K. Strategies for generating prolonged functional standing using intramuscular stimulation or intraspinal microstimulation. IEEE Trans. Neural Syst. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 15, 273-285 (2007).
  11. Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. J. Neurosci. Methods. 148, 1-18 (2005).
  12. Sierra, A., et al. Surveillance, phagocytosis, and inflammation: how never-resting microglia influence adult hippocampal neurogenesis. Neural Plast. 2014, 610343(2014).
  13. Holm, T. H., Draeby, D., Owens, T. Microglia are required for astroglial Toll-like receptor 4 response and for optimal TLR2 and TLR3 response. Glia. 60, 630-638 (2012).
  14. Gao, Z., et al. Reciprocal modulation between microglia and astrocyte in reactive gliosis following the CNS injury. Mol. Neurobiol. 48, 690-701 (2013).
  15. Jin, X., Yamashita, T. Microglia in central nervous system repair after injury. J. Biochem. (Tokyo). 159, 491-496 (2016).
  16. Griffith, R. W., Humphrey, D. R. Long-term gliosis around chronically implanted platinum electrodes in the Rhesus macaque motor cortex. Neurosci. Lett. 406, 81-86 (2006).
  17. Biran, R., Martin, D. C., Tresco, P. A. Neuronal cell loss accompanies the brain tissue response to chronically implanted silicon microelectrode arrays. Exp. Neurol. 195, 115-126 (2005).
  18. Fawcett, J. W., Asher, R. A. The glial scar and central nervous system repair. Brain Res. Bull. 49, 377-391 (1999).
  19. Szarowski, D. H., et al. Brain responses to micro-machined silicon devices. Brain Res. 983, 23-35 (2003).
  20. Park, D. -W., et al. Graphene-based carbon-layered electrode array technology for neural imaging and optogenetic applications. Nat. Commun. 5, 5258(2014).
  21. McAllister, J. P., et al. Biocompatibility of Penetrating Recording Electrode Arrays Implanted Chronically in the Feline Visual Cortex. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 1528(2005).
  22. Schmid, C. D., et al. Differential gene expression in LPS/IFNgamma activated microglia and macrophages: in vitro versus in vivo. J. Neurochem. 109, 117-125 (2009).
  23. Chung, H., et al. In vivo Biocompatibility and Stability of Polyimide Microelectrode Array for Retinal Stimulation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 5072(2003).
  24. Aregueta-Robles, U. A., Woolley, A. J., Poole-Warren, L. A., Lovell, N. H., Green, R. A. Organic electrode coatings for next-generation neural interfaces. Front. Neuroengineering. 7, (2014).
  25. Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24, 4337-4351 (2003).
  26. Yang, J., et al. Ordered surfactant-templated poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) conducting polymer on microfabricated neural probes. Acta Biomater. 1, 125-136 (2005).
  27. Ludwig, K. A., et al. Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) polymer coatings facilitate smaller neural recording electrodes. J. Neural Eng. 8, 014001(2011).
  28. Kim, D. -H., Abidian, M., Martin, D. C. Conducting polymers grown in hydrogel scaffolds coated on neural prosthetic devices. J. Biomed. Mater. Res. A. 71, 577-585 (2004).
  29. George, P. M., et al. Fabrication and biocompatibility of polypyrrole implants suitable for neural prosthetics. Biomaterials. 26, 3511-3519 (2005).
  30. Stauffer, W. R., Cui, X. T. Polypyrrole doped with 2 peptide sequences from laminin. Biomaterials. 27, 2405-2413 (2006).
  31. Green, R. A., Lovell, N. H., Wallace, G. G., Poole-Warren, L. A. Conducting polymers for neural interfaces: challenges in developing an effective long-term implant. Biomaterials. 29, 3393-3399 (2008).
  32. Gumbiner, B. M. Cell adhesion: the molecular basis of tissue architecture and morphogenesis. Cell. 84, 345-357 (1996).
  33. Chan, G., Mooney, D. J. New materials for tissue engineering: towards greater control over the biological response. Trends Biotechnol. 26, 382-392 (2008).
  34. Green, R. A., Lovell, N. H., Poole-Warren, L. A. Impact of co-incorporating laminin peptide dopants and neurotrophic growth factors on conducting polymer properties. Acta Biomater. 6, 63-71 (2010).
  35. Green, R. A., Lovell, N. H., Poole-Warren, L. A. Cell attachment functionality of bioactive conducting polymers for neural interfaces. Biomaterials. 30, 3637-3644 (2009).
  36. Koss, K. M., Unsworth, L. D. Neural tissue engineering: Bioresponsive nanoscaffolds using engineered self-assembling peptides. Acta Biomater. 44, 2-15 (2016).
  37. Koss, K. M., et al. Brain biocompatibility and microglia response towards engineered self-assembling (RADA)4 nanoscaffolds. Acta Biomater. 35, 127-137 (2016).
  38. Evans, A. J., et al. Promoting neurite outgrowth from spiral ganglion neuron explants using polypyrrole/BDNF-coated electrodes. J. Biomed. Mater. Res. A. 91, 241-250 (2009).
  39. Yu, X., Bellamkonda, R. V. Tissue-engineered scaffolds are effective alternatives to autografts for bridging peripheral nerve gaps. Tissue Eng. 9, 421-430 (2003).
  40. Houweling, D. A., Lankhorst, A. J., Gispen, W. H., Bär, P. R., Joosten, E. A. Collagen containing neurotrophin-3 (NT-3) attracts regrowing injured corticospinal axons in the adult rat spinal cord and promotes partial functional recovery. Exp. Neurol. 153, 49-59 (1998).
  41. Wells, M. R., et al. Gel matrix vehicles for growth factor application in nerve gap injuries repaired with tubes: a comparison of biomatrix, collagen, and methylcellulose. Exp. Neurol. 146, 395-402 (1997).
  42. Barras, F. M., Pasche, P., Bouche, N., Aebischer, P., Zurn, A. D. Glial cell line-derived neurotrophic factor released by synthetic guidance channels promotes facial nerve regeneration in the rat. J. Neurosci. Res. 70, 746-755 (2002).
  43. Fine, E. G., Decosterd, I., Papaloïzos, M., Zurn, A. D., Aebischer, P. GDNF and NGF released by synthetic guidance channels support sciatic nerve regeneration across a long gap. Eur. J. Neurosci. 15, 589-601 (2002).
  44. Burdick, J. A., Ward, M., Liang, E., Young, M. J., Langer, R. Stimulation of neurite outgrowth by neurotrophins delivered from degradable hydrogels. Biomaterials. 27, 452-459 (2006).
  45. Piantino, J., Burdick, J. A., Goldberg, D., Langer, R., Benowitz, L. I. An injectable, biodegradable hydrogel for trophic factor delivery enhances axonal rewiring and improves performance after spinal cord injury. Exp. Neurol. 201, 359-367 (2006).
  46. Jain, A., Kim, Y. -T., McKeon, R. J., Bellamkonda, R. V. In situ gelling hydrogels for conformal repair of spinal cord defects, and local delivery of BDNF after spinal cord injury. Biomaterials. 27, 497-504 (2006).
  47. Taylor, S. J., Sakiyama-Elbert, S. E. Effect of controlled delivery of neurotrophin-3 from fibrin on spinal cord injury in a long term model. J. Control. Release Off. J. Control. Release Soc. 116, 204-210 (2006).
  48. Jhaveri, S. J., et al. Release of nerve growth factor from HEMA hydrogel-coated substrates and its effect on the differentiation of neural cells. Biomacromolecules. 10, 174-183 (2009).
  49. Lee, A. C., et al. Controlled release of nerve growth factor enhances sciatic nerve regeneration. Exp. Neurol. 184, 295-303 (2003).
  50. Matsumoto, K., et al. Neurite outgrowths of neurons with neurotrophin-coated carbon nanotubes. J. Biosci. Bioeng. 103, 216-220 (2007).
  51. Khaled, I., et al. A Flexible Base Electrode Array for Intraspinal Microstimulation. IEEE Trans. Biomed. Eng. 60, 2904(2013).
  52. David-Pur, M., Bareket-Keren, L., Beit-Yaakov, G., Raz-Prag, D., Hanein, Y. All-carbon-nanotube flexible multi-electrode array for neuronal recording and stimulation. Biomed. Microdevices. 16, 43-53 (2014).
  53. Hsu, H. -L., et al. Flexible UV-ozone-modified carbon nanotube electrodes for neuronal recording. Adv. Mater. Deerfield Beach Fla. 22, 2177-2181 (2010).
  54. Lacour, S. P., et al. Flexible and stretchable micro-electrodes for in vitro and in vivo neural interfaces. Med. Biol. Eng. Comput. 48, 945-954 (2010).
  55. Lin, C. -M., Lee, Y. -T., Yeh, S. -R., Fang, W. Flexible carbon nanotubes electrode for neural recording. Biosens. Bioelectron. 24, 2791-2797 (2009).
  56. Richter, A., et al. A simple implantation method for flexible, multisite microelectrodes into rat brains. Front. Neuroengineering. 6, 6(2013).
  57. Rousche, P. J., et al. Flexible polyimide-based intracortical electrode arrays with bioactive capability. IEEE Trans. Biomed. Eng. 48, 361-371 (2001).
  58. Polikov, V. S., Block, M. L., Fellous, J. -M., Hong, J. -S., Reichert, W. M. In vitro model of glial scarring around neuroelectrodes chronically implanted in the CNS. Biomaterials. 27, 5368-5376 (2006).
  59. Sohal, H. S., Clowry, G. J., Jackson, A., O'Neill, A., Baker, S. N. Mechanical Flexibility Reduces the Foreign Body Response to Long-Term Implanted Microelectrodes in Rabbit Cortex. PloS One. 11, e0165606(2016).
  60. Moshayedi, P., et al. The relationship between glial cell mechanosensitivity and foreign body reactions in the central nervous system. Biomaterials. 35, 3919-3925 (2014).
  61. Hopkins, A. M., DeSimone, E., Chwalek, K., Kaplan, D. L. 3D in vitro modeling of the central nervous system. Prog. Neurobiol. 125, 1-25 (2015).
  62. Pöttler, M., Zierler, S., Kerschbaum, H. H. An artificial three-dimensional matrix promotes ramification in the microglial cell-line, BV-2. Neurosci. Lett. 410, 137-140 (2006).
  63. Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. 0, 42-51 (2014).
  64. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. Assay Drug Dev Technol. 12, 207-218 (2014).
  65. Jeffery, A. F., Churchward, M. A., Mushahwar, V. K., Todd, K. G., Elias, A. L. Hyaluronic acid-based 3D culture model for in vitro testing of electrode biocompatibility. Biomacromolecules. 15, 2157-2165 (2014).
  66. Fitch, M. T., Silver, J. CNS Injury, Glial Scars, and Inflammation. Exp. Neurol. 209, 294-301 (2008).
  67. Churchward, M. A., Todd, K. G. Statin treatment affects cytokine release and phagocytic activity in primary cultured microglia through two separable mechanisms. Mol. Brain. 7, 85(2014).
  68. Lai, A. Y., Todd, K. G. Differential regulation of trophic and proinflammatory microglial effectors is dependent on severity of neuronal injury. Glia. 56, 259-270 (2008).
  69. Hachet, E., Van Den Berghe, H., Bayma, E., Block, M. R., Auzély-Velty, R. Design of biomimetic cell-interactive substrates using hyaluronic acid hydrogels with tunable mechanical properties. Biomacromolecules. 13, 1818-1827 (2012).
  70. Eslami, M., Javadi, G., Agdami, N., Shokrgozar, M. A. Expression of COLLAGEN 1 and ELASTIN Genes in Mitral Valvular Interstitial Cells within Microfiber Reinforced Hydrogel. Cell J (Yakhteh). , (2015).
  71. Shaltouki, A., Peng, J., Liu, Q., Rao, M. S., Zeng, X. Efficient Generation of Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells in Defined Conditions. STEM CELLS. 31, 941-952 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи