Сайт направлен иммобилизации костных морфогенетических белка 2 для твердых поверхностей по химии нажмите

Краткое содержание

Биоматериалов, легированного костных морфогенетических белков 2 (БМП2) использовали как новые терапевтические стратегии для лечения переломов костей не входящих в союз. Для преодоления побочных эффектов в результате неконтролируемого высвобождения фактора, мы предлагаем новую стратегию на сайт-непосредственно иммобилизации фактор, создавая тем самым с расширенными возможностями Остеогенные материалы.

Аннотация

Интенсивно исследуются различные терапевтические стратегии для лечения незаживающих дефектов длинной кости. В настоящее время используется настоящее лечение несколько ограничений, которые привели к использованию биоматериалов в сочетании с Остеогенные факторы роста, такие как костных морфогенетических белков (БМП). Часто используемые методы поглощения или инкапсуляция требуют выше физиологические количество БМП2, что обычно приводит к эффект релиз так называемый первоначальный всплеск, который провоцирует несколько тяжелых побочных эффектов. Возможная стратегия преодоления этих проблем бы ковалентно пара белка на эшафот. Кроме того муфты должны выполняться на основе конкретных для того чтобы гарантировать воспроизводимость продукции результат. Таким образом мы создали БМП2 вариант, в котором искусственного аминокислота (Пропаргиловый L-лизин) было введено в зрелой части белка БМП2 кодон использования расширения (БМП2-K3Plk). БМП2-K3Plk был соединен функционализированных бусины через медные катализируемой азид алкины циклоприсоединения (CuAAC). Биологическая активность спаренных БМП2-K3Plk была доказана в пробирке и Остеогенные активности БМП2-K3Plk-функционализированных бусины было доказано в ячейке на основе анализов. Функционализированных бусы при контакте с C2C12 клетки смогли побудить щелочной фосфатазы (ALP) выражение в локально ограниченных близости из бисера. Таким образом, в этой технике, может производиться функционализированных подмостей, может вызвать дифференцировки клеток к Остеогенные линии. Кроме того более низкие дозы БМП2 достаточно за счет контролируемой ориентации сайта направленных спаренных БМП2. С помощью этого метода БМП, всегда подвергаются их рецепторами на поверхности клеток в соответствующей ориентации, которая не в случае, если факторы соединены через сайт направлен муфты методов. Итоги продукт очень управляемым, и, таким образом, результаты в материалах с однородными свойствами, улучшение их применимость для ремонта критического размера костных дефектов.

Введение

Конечная цель костной ткани инженерии и костной регенерации является преодолеть недостатки и ограничения, возникающие во время общего лечения переломов не входящих в союз. Авто - или Алло трансплантация преимущественно используются в качестве текущей стратегии терапии, хотя они оба имеют несколько недостатков. Идеальный костного трансплантата должно побудить Остеогенез osteoinduction, а также osteoconduction, ведущих к остеоинтеграции имплантата в кость. В настоящее время только Авто трансплантации рассматривается как «золотой стандарт», так как она обеспечивает все характеристики идеального костного трансплантата. К сожалению он также представляет важные негативные аспекты, такие как длинные операции раз и второй сайт травмы, что обычно влечет за собой больше осложнений (например, хронической боли, гематома образований, инфекции, косметических дефектов и т.д.). Аллогенной графтов, с другой стороны имеют субоптимальные характеристики для всех общие аспекты¹. Альтернативные костного трансплантата технологии улучшились за последние несколько лет, с тем чтобы производить строительные леса, которые являются osteoinductive, остеокондуктивных, биологически и салфетка. Поскольку многие биоматериалов не показывают все эти Остеогенные характеристики, различные факторы роста, главным образом БМП2 и BMP7, были включены с целью улучшения Остеогенные потенциал конкретного леса².

Как важным критерием такие системы доставки фактор роста должны обеспечивать контролируемые дозы выпуска со временем облегчить основные события, как набор ячеек и привязанности, врастание клеток и ангиогенеза. Однако БМП также, как другие Остеогенные факторы роста были обычно прикол non-covalently³. Провокация и адсорбции методы требуют использования выше физиологические количество белка из-за первоначальный всплеск-релиз, который приводит к серьезные недостатки в естественных условиях, обычно влияющих на окружающих тканей, вызывая разрастание костной ткани, ⁴остеолиза, отек и воспаление. Таким образом сохранение факторов роста на сайте доставки для более длительных периодов времени может быть достиган ковалентной иммобилизации методами. Химически изменены БМП2 (succinylated⁵, ацетилированный⁶ или⁷биотинилированным), инженерии гетеродимерами⁸или БМП2 производных Олигопептиды⁹ были разработаны и использованы для преодоления ограничений, связанных с поглощение. Однако био деятельность этих конструкций не является предсказуемым, поскольку соглашение потенциально препятствует привязки иммобилизованных лигандом клеточных рецепторов. Как показано ранее важно, что все четыре цепи рецептора участвует в формировании активированного лиганд рецептор комплексов взаимодействуют с иммобилизованными БМП2 для того, чтобы полностью активировать все ниже по течению сигнальные каскады¹⁰.

Для преодоления проблем исход неоднородных продукт с ограничениями с точки зрения биологическую, стабильность и биодоступность подвижности фактора, мы разработали BMP вариант, способный ковалентно привязки подмостей образом ориентированные на сайт. Этот вариант, называется БМП2-K3Plk, состоит из искусственного аминокислоты, который был представлен генетические кодон расширения¹¹. Этот вариант был успешно связаны с подмостей, используя стратегию ковалентная связь при сохранении своей биологической активности.

Протокол

1. Производство вариант БМП2 БМП2 K3Plk

1. Клонирование из БМП2-K3Plk на сайт направленного мутагенеза, используя PCR ¹²
   1. Усиливают человека зрелого БМП2 (hmBMP2) от вектора p25N-hmBMP2 (см. Таблицу материалы) с вперед грунт (5' GACCAGGACATATGGCTCAAGCCTAGCACAAACAGC 3') и обратный грунт (5' CCAGGAGGATCCTTAGCGACACCCACAACCCT 3') представляя янтаря стоп кодон ( ТЕГ) на позиции первого лизина BMP2´s Пожилая часть. Выполнять с использованием 33.5 мкл H₂O, 10 мкл смеси реакции PCR, 1.5 мкл 10 мкм dNTP раствор, 1.5 мкл вперед праймера (10 пмоль/мкл), 1,5 мкл обратного праймера (10 пмоль/мкл), 1 мкл p25N-hmBMP2 (10 нг/мкл) реакции PCR и 1 мкл ДНК-полимеразы (см. Таблицу материалы) в тепловой циклователь (денатурация при 95 ° C за 5 мин, 30 циклов за 1 мин, отжиг при 60 ° C за 1 мин, удлинение 72 ° C за 1 мин и окончательное расширение при 72 ° C для 10 мин денатурации на 95 ° C).
   2. Очистить продукт PCR, использование коммерчески доступных комплект рекомендаций производителя (см. Таблицу материалы).
   3. Дайджест продукт PCR с энзима ограничения NdeI при 37 ° C 45 мин с помощью 16 мкл H₂O 3 мкл буфера пищеварение, 10 мкл ДНК (20 нг/мкл) и 1 мкл энзима ограничения. Тепло инактивирует фермент при 65 ° C за 5 мин дайджест продукт PCR с энзима ограничения BamHI при 37 ° C за 1 ч с помощью 16 мкл H₂O 3 мкл буфера пищеварение, 10 мкл ДНК (20 нг/мкл) и 1 мкл энзима ограничения. Тепло инактивирует фермент при 80 ° C за 5 мин.
   4. Дайджест вектор pET11a-pyrtRNA с NdeI при 37 ° C на 2 ч. и 45 мин с помощью 16 мкл H₂O 3 мкл буфера пищеварение, 10 мкл ДНК (20 нг / мкл) и 1 мкл энзима ограничения. Тепло инактивирует при 65 ° C за 5 мин дайджест вектор pET11a-pyrtRNA с BamHI при 37 ° C за 1 ч с помощью 16 мкл H₂O 3 мкл буфера пищеварение, 10 мкл ДНК (20 нг/мкл) и 1 мкл энзима ограничения. Инактивирует тепла при 80 ° C за 5 мин.
   5. Отделить переваривается вектор от непереваренных вектора и пищеварение остатки от агарозы гель электрофореза (0,8% агарозном, 60 мин 100 V). Перевязать переваривается Вставка БМП2-K3TAG с усваивается pET11a-pyrtRNA позвоночника при комнатной температуре (RT) за 2 ч с использованием 100 нг pET11a-pyrtRNA позвоночника и 34,5 нг БМП2-K3TAG вставки (молярное соотношение 1:3). Реакционную смесь содержит ДНК позвоночника и вставки, 2 мкл буфера лигаза, 1 мкл ДНК лигаза, и H₂O к общим объемом 20 мкл.
   6. Выполните совместное преобразование pET11a-pyrtRNA БМП2-K3Plk и pSRF дуэт pyrtRNAsynth в BL21(DE3) бактерий:
      1. Добавьте 50 нг каждого плазмида бактерий, поместите смесь на льду на 30 мин, теплового шока при 42 ° C 50 s, место на льду на 5 мин, 500 мкл Lysogeny бульон (LB) среды в смеси и погрозит 300 об/мин, 60 мин.
      2. Распространение 100 мкл бактериальной смеси на подогретым канамицин (50 мкг/мл) / пластины ампициллин (100 мкг/мл) и Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
2. Выражение и очистки БМП2 K3Plk ^{13 , 14}
   1. Пропагандировать единую колонию на ночь в 50 мл среды фунтов с 50 мкг/мл канамицин и 100 мкг/мл ампициллина при 37 ° C.
   2. Разбавить ночь культуры 1:20 в 800 мл среды потрясающий бульон (ТБ), дополнена канамицин 50 мкг/мл и 100 мкг/мл ампициллина и растут при 37 ° C, пока не будет достигнуто ОД₆₀₀ 0,7. Добавьте Пропаргиловый L-лизин в конечной концентрации 10 мм. Соберите 100 мкл пример от культуры до изопропиловый β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) индукции.
   3. Побудить экспрессии генов путем добавления IPTG до конечной концентрации 1 мм. Растут культуры при 37 ° C для 16 h в орбитальный шейкер на 180 об/мин. Соберите 100 мкл пример от культуры.
   4. Центрифуга целая культура на 9000 x g 30 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте бактериальных гранулы в 30 мл TBSE буфера (10 мм трис, 150 мм NaCl, 1 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)) с 1: 1000 (v/v) 2-меркаптоэтанол (свеже добавлено).
      Предупреждение: Ручка 2-меркаптоэтанол под зонт. Избегайте контакта с кожей и глазами. Избегайте вдыхания паров или туман. Выполните все шаги ресуспендирования с буферов, содержащих 2-меркаптоэтанол под зонт.
   5. Вес пустой центрифуги стакан и передачи ресуспензированы гранулы в пустой стакан. Центрифуга на 6,360 g x 20 мин удалить супернатант и весят стакан с Пелле. Вычтите вес пустой стакан для расчета веса таблетки.
      Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. Заморозить гранул при-20 ° C в краткосрочной перспективе или на-80 ° C в долгосрочной перспективе. После возобновления протокол, оттепель гранул на RT.
   6. Ресуспензируйте гранулы в буфере STE (10 мм трис рН 8,0; 150 мм NaCl; 1 мм ЭДТА, 375 мм сахарозы; 1: 1000 (v/v) 2-меркаптоэтанол (свеже добавил)). Использование 200 мл буфера STE для каждые 10 г гранул.
   7. Sonicate подвеска на льду (10 мин с 40 s пульс, 20 s тормоза и 30% амплитуды). Центрифуга на 6,360 g x 20 мин удалить супернатант и весят гранулы. Повторите шаги, sonication и центрифугирования 4 раза.
   8. Ресуспензируйте гранулы в 100 мл TBS буфера (10 мм трис, 150 NaCl). Центрифуга на 6,360 g x 20 мин удалить супернатант и весят Пелле.
   9. Ресуспензируйте Пелле нуклеиназы буфера (100 мм трис, 1 ЭДТА, 3 мм MgCl₂) с свежезаваренным добавлен нуклеиназы 80 ед/мл (например, Benzonase) с использованием 10 мл/г гранул. Инкубируйте подвеска на ночь на RT на перемешивание пластины (30 об/мин).
   10. Добавьте буфер Тритон (60 мм ЭДТА, 1,5 М NaCl, 6% (v/v) 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl) фенил-полиэтиленгликоль) к приостановлению. Объем буфера Тритон добавить соответствует 0,5 объема часть подвески. Проинкубируйте втечение 10 мин на RT (без перемешивания). Центрифуга на 6,360 g x 20 мин удалить супернатант и весят гранулы.
   11. Ресуспензируйте гранулы в буфере TE (100 мм трис, 20 мм ЭДТА) с использованием 8 мл/г гранул. Центрифуга на 6,360 g x 20 мин удалить супернатант и весят гранулы.
   12. Ресуспензируйте гранулы путем добавления 4 мл/г 25 мм NaAc рН 5,0 и 5 мл/г из 6 M GuCl с 1 мм Дитиотреитол (DTT) (свеже добавлено). Инкубируйте подвеска на ночь при 4 ° C на перемешивание пластины (30 об/мин).
   13. Центрифуга на 75,500 g x 20 мин. Супернатант теперь содержит развернулось мономерных БМП2 белка. Собирайте супернатант и концентрат, этот экстракт 20 ОД/мл с помощью мембраны 3 кДа молекулярный вес отсечения (MWCO) в концентрации клеток (см. Таблицу материалы).
   14. Добавьте концентрации мономеров в одной капли в буфере выемка (2 M LiCl, 50 мм трис, главы 25 мм, 5 мм ЭДТА, дисульфид глутатиона 1 мм (GSSG), 2 мм глутатиона (GSH)) помешивая (30 об/мин). Инкубируйте на RT для 120 h в темноте.
       Примечание: этот период инкубации, складывая мигающих. Решение от этого шага начиная содержит сложенном димерной БМП2-K3Plk.
   15. Отрегулируйте рН раствора до 3.0 с использованием концентрированной HCl. Dialyze решение против 1 мм HCl. концентрат dialyzed решения с помощью мембраны 10 кДа молекулярный вес производства (MWCO) в концентрации клеток.
   16. Сбалансировать решение, добавляя буфера (20 мм, NaAc, 30% изопропиловый спирт). Добавьте объем буфера A соответствует 30% объема раствора. Центрифуга решение на 4700 x g за 15 мин.
   17. Сбалансировать столбце для ионного обмена на быстрый протеин жидкостной хроматографии (ПСОК) системы¹⁵ с 150 мл буфера A. Load раствор белка на столбце уравновешенной. Элюировать фракций, используя линейный градиент буфера B (20 мм NaAc, 30% изопропиловый спирт, 2 M NaCl) с использованием 100 мл буфера B. собирать 2 мл фракций.
       Примечание: Концентрат белка перед загрузкой в столбце по объему всего столбца. Окончательный белка объем должен быть < 5% от объема всего столбца.
   18. Анализ 20 мкл каждой фракции полиакриламида SDS гель (12%) электрофорез (SDS-PAGE) ¹⁶ и Окрашивание Кумасси синим¹⁷ (см. Таблицу материалы).
       Примечание: Кумасси синим витражи гель SDS-PAGE шоу фракций, содержащих димеров (26 кДа) и фракций, содержащих мономеров (13 кДа).
   19. Бассейн димер содержащие фракции. Dialyze пул димер, содержащие фракции на ночь при 4 ° C против 1 мм HCl (объем 5 литров). Концентрат конечного продукта с помощью 10 кДа, концентрируя центробежный фильтр (см. Таблицу материалы). Анализируйте конечного продукта путем электрофореза геля полиакриламида SDS (12%) (SDS-PAGE) и Окрашивание Кумасси синим.
       Примечание: Группы на Кумасси синим окрашенных SDS-PAGE гель должен показать только одна полоса на 26 кДа. Это конечный продукт БМП2-K3Plk.

2. Оптимизация меди (I)-катализированное алкины азид циклоприсоединения (CuAAC) условия

1. Аскорбат натрия (NaAsc) и меди (II) сульфат ( ₄ CuSO) _{на дикого типа БМП2 (БМП2-WT)}
   1. Инкубировать 20 мкм БМП2-WT с различным соотношением NaAsc CuSO₄. Использовать 0,5 мм NaAsc и 0,5 мм CuSO₄ (начиная концентрации) в объеме 50 мкл. Продолжить с следующие соотношения NaAsc CuSO₄: (1:1), (1.7:1), (10:1), (20: 1), сохраняя постоянной концентрации₄ CuSO на 0,5 мм и регулировка концентрации NaAsc соответственно. Выполните реакции в H₂O на вращающейся смеситель (20 мин) на ночь на RT.
   2. Подготовка сокращенных проб путем добавления загрузки буфера, содержащего 5% 2-меркаптоэтанол и инкубировать образца при 95 ° C, 6 минут анализ сокращены и гель-снижение образцы полиакриламида SDS (12%) электрофорез (SDS-PAGE) и Окрашивание Кумасси синим. Витражные Гели SDS-PAGE Coomasie Показать полосы в диапазоне 13 кДа (снижение conditons) 26 кДа и выше молекулярный вес (не снижение условия).
2. Эффект Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl) Амин (THPTA) на CuAAC реакции
   1. Инкубировать 20 мкм БМП2-K3Plk с различным соотношением THPTA CuSO₄. Используйте 5 мм NaAsc и 200 мкм 3-Azido-7-hydroxycoumarin (сохранить NaAsc и 3-Azido-7-hydroxycoumarin, постоянный). Используйте в качестве отправной концентрации 50 мкм THPTA и 0,5 мм CuSO₄ . Использовать различные соотношения THPTA CuSO₄: (7:1); (10:1); (12:1); (15:1); (20:1). выполнять реакции в H₂O (общий объем 50 мкл) для 24 h на RT на вращающейся смеситель (20 мин).
   2. 3-Azido-7-hydroxycoumarin, после сцепки, становится Люминесцентную краску. Подготовить образцы в условиях ограниченной и не уменьшена и анализировать их на SDS-PAGE. Визуализировать гелей под возбуждения канал с определенной длины волны для 3-Azido-7-hydroxycoumarin (λ_abs = 404 Нм;_ет λ = 477 Нм).

3. ковалентная связь техника БМП2 K3Plk для азид функционализированных агарозы бусины

1. Проинкубируйте 2 ч в РТ на rotati 20 мкм БМП2-K3Plk или БМП2-WT (используется как отрицательный контроль) с 20 мкл азид активированный агарозы бисера в общем объеме 500 мкл буфера реакции (0,1 М HEPES pH 7.0, 3,9 М мочевиной, 50 мкм CuSO₄, 250 мкм THPTA, Аскорбат натрия 5 мм) микшер нг (20 мин). Остановите реакции, добавив 5 мм ЭДТА (конечная концентрация).
2. Инкубируйте на RT 15 мин на вращающейся смеситель (20 мин). Центрифугуйте образцы на 20000 x g 1 мин на RT. собирать supernatants.
3. Помыть лепешка, содержащие бусины три раза с 1000 мкл буфера HBS₅₀₀ (50 мм HEPES, 500 мм NaCl), три раза с 1000 мкл MgCl 4 M₂и два раза с 1000 мкл-фосфатный буфер (PBS). На каждом этапе стирки центрифуги на 20000 x г за 1 мин на RT и собирать supernatants. Магазин в сочетании бисер в 1000 мкл PBS на 4 ° C.
   Предупреждение: Не беспокоить Пелле шарик при удалении супернатант.

4. Проверка присутствия и биологической активности иммобилизованные БМП2 K3Plk с помощью Техас красной надписью BMP рецептор я Ectodomain ( _EC BMPR-IA)

1. Инкубировать 50 мкл БМП2-K3Plk функционализированных бусы с 1 мкм Техас Красного помечены BMPR-IA_EC с 150 мкл буфера HBS₅₀₀ (50 мм HEPES, 500 мм NaCl) на RT 1 h на вращающейся смеситель (20 мин).
2. Центрифуга бусы на 20000 x g 1 мин на RT. удалить супернатант. Вымойте бусины с 1000 мкл буфера₅₀₀ HBS. Повторите шаг Стиральная еще 3 раза. Центрифуга на 20000 x g 1 мин на RT после каждого мытья шаг.
3. Ресуспензируйте бисер в 500 мкл PBS и Пипетка 50 мкл на слайд крышка стекла. Установите фильтр Микроскоп между 561 или 594 Нм. Обнаруживать Техас красный – BMPR-IA_EC-БМП2-K3Plk функционализированных бусины с помощью флуоресцентной микроскопии и принимать фотографии.

5. Измерение щелочной фосфатазы (ALP) выражение, чтобы доказать In Vitro отпорности производства БМП2-K3Plk до и после сцепки реакции.

1. Щелочная фосфатаза (ALP) пробирного
   1. Культура promyoblastic C2C12 клетки (ATCC CRL-172) в средних Дульбекко изменение орла (DMEM) с 10% сыворотки крови плода теленка (FCS), 100 ед/мл пенициллин G и стрептомицина 100 мкг/мл при 37 ° C в атмосфере увлажненные 5% CO₂.
   2. Семенных клетки C2C12 на плотности 3 × 10⁴ клетки/скважины в 96-луночных микропланшетов. Пусть клетки придают на ночь. Удаление средних и инкубации клеток C2C12 присутствии 0,5-200 Нм БМП2-WT или БМП2-K3Plk в 100 мкл/хорошо DMEM (2% FCS, 100 ед/мл пенициллин G и 100 мкг/мл стрептомицина) при 37 ° C в атмосфере увлажненные 5% CO₂ за 72 ч.
   3. Удаление средних и вымыть клетки с 100 мкл PBS в колодец. Лизировать клетки на RT 1 h с 100 мкл/хорошо буфера lysis (1% NP-40, 0,1 М глицин, pH 9.6, MgCl 1 мм₂, 1 мм ZnCl₂) на тряску плите (220/мин).
   4. Добавьте 100 мкл/хорошо ALP буфера (0,1 М глицин, pH 9.6, 1 мм MgCl₂, 1 мм ZnCl₂) с 1 мг/мл p-nitrophenylphosphate (свеже добавлен) в lysate клетки.
   5. Измерение поглощения на 405 нм в многодисковое reader после добавления ALP буфер и каждые 5 минут, до завершения разработки цвет. Генерировать дозы ответ кривых и значения ЭК50, с помощью модели логистической, y = A₂ + (₁A-A₂) / (1 + (x/x₀)^p).
2. Щелочная фосфатаза (ALP) пятнать
   1. Культура promyoblastic C2C12 клетки (ATCC CRL-172) в Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) с 10% сыворотки крови плода теленка (FCS), 100 ед/мл пенициллин G и стрептомицина 100 мкг/мл при 37 ° C в атмосфере увлажненные 5% CO₂.
   2. Семенных клетки C2C12 на плотности 3 × 10⁴ клетки/скважины в 96-луночных микропланшетов. Пусть клетки придают на ночь. Удаление средних и добавить 20 мкл/колодец БМП2-K3Plk сочетании бисера. БМП2-K3Plk сочетании бусины находятся в 1000 мкл суспензии PBS.
   3. Подготовьте раствор 0,4% Температура плавления агарозы в среде DMEM. Растопить в микроволновке (600 Вт 3 мин) и дайте ему остыть в водяной бане при 37 ° C до использования.
   4. 20 мкл агарозы температура плавления 0,4%, в каждой скважине (покрытие бисера и клетки). Центрифуга на 2000 x g 5 мин при 20 ° C. 80 мкл DMEM (2% FCS, 100 ед/мл пенициллин G и 100 мкг/мл стрептомицина) и инкубировать при 37 ° C в атмосфере увлажненные 5% CO₂ за 72 ч.
   5. Удаление среды, стараясь не отсоединить затвердевших агарозы 0,4%. Добавить 100 мкл/скважина 1-шаг НБТ/раствора субстрата ПКВП (нитро голубой tetrazolium хлорид, 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate-толуидином соли).
   6. Анализируйте, щелочной фосфатазы окрашивание с помощью световой микроскопии, сразу же после того, как фиолетовый окрашивание становится очевидной. Используйте светлые области микроскопии и принимать фотографии.

Результаты

В этой статье мы описываем метод ковалентно пара новый вариант БМП2, БМП2-K3Plk, коммерчески доступных азид функционализированных агарозы бисером (рис. 1). Биологическую производства БМП2-K3Plk вариант был подтвержден индукции щелочной фосфатазы (ALP) экспрессии генов в клетках C2C12. В vitro тест показывает аналогичные уровни выражения ALP, вызванных дикого типа БМП2 (БМП2-WT) и БМП2-K3Plk (рис. 2).

Обсуждение

Генерации протеин тегами вариантов расширения генетических кодон позволяет введение различных ненатуральных аминокислоты аналогов главным образом в любом месте основного белка последовательности. В случае БМП как БМП2, общей теги, такие как тег 6-гистидин (его) может быть только представил N-неизлечимо, так как конец protein´s C-терминала похоронен в структуре высшего белка и таким образом не доступны извне. На других позициях размер тег представлен весьма вероятно может вызвать структурные изменения, которые соответстве...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Material
1-Step NBT/BCIP	Thermo Fisher	34042	Добавить раствор в клетки
3-Azido-7-гидроксикумарин	BaseClick	BCFA-047-1	Химическое вещество, используемое для клик-реакции
Агароза с низкой температурой плавления	Biozym	840101	Агароза для анализа ALP
Азидные агарозные бусины	Jena Bioscience	CLK-1038-2	Бусины, используемые для реакции
BamHI (Fast Digest enzyme)	Thermo Fisher Scientific	FD0054	Фермент рестрикции
BMP рецептор IA (BMPR-IAEC)	--	-	Произведено в нашей лаборатории
Coomassie Brilliant Blue G-250 Dye	Thermo Fisher Scientific	20279	Химическое вещество, используемое для окрашивания Кумасси в бриллиантовый синий цвет SDS PAGE
Сульфат меди (II) безводный (CuSO4)	Alfa Aesar A13986		Химический состав, используемый для клик-реакции
ДНК-полимераза и реакционный буфер	Kapabiosystems	KK2102	KAPA HiFi PCR Kit
Dulbecco' s модифицированный Eagle' s среда (DMEM) GlutaMAX	Gibco	61965-026	Среды для культивирования клеток
этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)	Sigma Aldrich GmbH	E5134-1kg	Химическое вещество, используемое для остановки клик-реакции
Изопропил ß-D-1-тиогалактопиранизид (IPTG)	Carl Roth GmbH	2316.5	Индукция бактерий (конечная концентрация 1 мМ)
NdeI (фермент быстрого усвоения)	Thermo Fisher Scientific	ER0581	Фермент рестрикции
NHS-активированный Texas Red	Life technologies	T6134	Соединен с рецептором
P-нитрофенилфосфата	Sigma Aldrich GmbH	N4645-1G	Щелочная фосфатаза
p25N-hmBMP2	--	--	Плазмида любезно предоставлена Уолтером Зебальдом Й. Никелю
pET11a-pyrtRNA-Предоставлено			кафедрой фармацевтики и биофармацевтики Университета Вюрцбурга
пропаргил-L-лизин (Plk)		---Предоставлено	кафедрой фармацевтики и биофармацевтики Университета Вюрцбурга
pSRFduet-pyrtRNAsynth	--	---	Предоставлено кафедрой фармацевтики и биофармации, Университет Вюрцбурга
Qiagen Набор для экстракции геля	Qiagen	28704	Очистка геля
Qiagen PCR Набор для очистки ПЦР	Qiagen	28104	Очистка ПЦР
L-аскорбат натрия	Sigma Aldrich GmbH	A7631-100G	Химический используется для клик-реакции
T4 DNA Ligase	ThermoScientific	EL0011	Ligation
трис(3-гидроксипропилтриазолилметил)амин (THPTA)	BaseClick	BCMI-006-100	Химическое вещество, используемое для клик-реакции
4-(1,1,3,3-тетраметилбутил)фенил-полиэтиленгликоль	Sigma Aldrich GmbH	X100-1L	Triton X 100
Название<	strong>Company	Каталожный номер	Комментарии
>Оборудование
Amicon концентраторная ячейка 400 мл	Центробежная установка	Merck KGaA	UFSC40001
Центробежные фильтрующие установки Amicon Ultra-15 Центробежная	Merck KGaA	UFC901024	Центробежная установка
Ä KTA avant FPLC	Ä KTA	--	FPLC машина
Avanti J-26XP	Beckman Coulter	393124	Центрифуга для бактериальной культуры
Бактериальный встряхивающий инкубатор	Infors HT		Встряхивающий инкубатор для бактериальной культуры
FluorChem Q system	proteinsimple	--	Система визуализации и анализа для SDS-PAGE
Флуоресцентный мискроскоп	Keyence	BZ-9000 (BIOREVO)
Fractogel® EMD SO3- (M)	Merck KGaA	116882	материал колонки для ионообменной хроматографии
Greiner CELLSTAR®   96-луночные планшеты	Sigma	M5811-40EA	96-луночные планшеты для клеточных культур (анализ ALP)
Heraeus Multifuge X1R	ThermoScientific	--	Центрифуга
M-20 Микропланшет качающийся ротор ведра	ThermoScientific	75003624	Ротор для микроцентрифуги для планшета во время окрашивания ALP
Микроцентрифуга - 5417R	Eppendorf	--	Centrifuge
OriginPro 9.1 G	OriginLab	-	программное обеспечение для статического анализа данных анализа ЩФ
Polysine Slides	ThermoScientific	10143265	предметные стекла микроскопа
Rotor JA-10	Beckman Coulter	--	ротор для центрифуги Avanti J-26XP
Ротор JLA 8.1	Beckman Coulter	--ротор	для центрифуги Avanti J-26XP
Ротор JA 25.50	Beckman Coulter	--	ротор для центрифуги Avanti J-26XP
многопланшетный считыватель Tecan infinite M200	Tecan Deutschland GmbH	--	многопланшетный считыватель для анализа ЩФ
Термоамплификатор - Labcycler Gradient	SensoQuest GmbH	--	PCR
TxRed - фильтр для микроскопа	Keyence		Filter для флуоресцентного микроскопа
Ультрафильтрационные регенерированные целлюлозные диски 3 кДа	Merck KGaA	PLBC04310	используются с концентрационной ячейкой amicon 400 мл
Ультрафильтрация регенерированных целлюлозных дисков 10 kDa	Merck KGaA	PLGC04310	используются с концентрационной ячейкой amicon 400 мл