Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Иммунофлуоресценции γH2AX и 53BP1 для анализа формирования и ремонт двухнитевые разрывы ДНК

16.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56617

⸱

3 ноября 2017 г.

 ,  ,  , 
1Department of Hematology and Oncology, Medical Faculty Mannheim of the Heidelberg University

В этой статье

Краткое содержание

Эта рукопись обеспечивает протокол для анализа двухнитевые разрывы ДНК, иммунофлуоресценции γH2AX и 53BP1.

Аннотация

Двухнитевые разрывы ДНК (DSB) являются серьезные повреждения ДНК. Анализ формирования и ремонт DSB актуальна в широком спектре областей исследований, включая целостности генома, генотоксичности, радиационной биологии, старение, рак и разработки лекарственных средств. В ответ на DSB гистон H2AX фосфорилированных 139 Серина в регионе несколько пар megabase, образуя дискретных ядерной очагов обнаружено в иммунофлуоресценции. Кроме того, 53BP1 (белок p53 привязки 1) является другим важным DSB-отзывчивым белком, поощрение ремонт DSB nonhomologous конце-присоединиться к предотвращая гомологичная рекомбинация. Согласно конкретных функций γH2AX и 53BP1 совокупный анализ γH2AX и 53BP1, иммунофлуоресценции может быть разумный подход для детального анализа DSB. Эта рукопись предоставляет пошаговые протокол дополнена Методические заметки для выполнения метода. В частности влияние клеточный цикл на γH2AX очагов модели проявляется в нормальной фибробласты клетки линии NHDF. Кроме того значение очагов γH2AX качестве биомаркера изображен в рентгеновских облученных лимфоцитах здорового человека. Наконец генетическая нестабильность в CD34 + клеток у пациентов с острой миелоидной лейкемии расследуется иммунофлуоресценции γH2AX и 53BP1.

Введение

ДНК постоянно разрушен эндогенных (например, стресс репликации, реактивнооксигенных видов, внутренняя нестабильность ДНК) и внешних (например, химических радикалов, облучение) источников (рис. 1)1,2 ,3,4. Среди повреждения ДНК двухнитевые разрывы ДНК (DSB) являются особенно серьезных поражений и может вызвать смерть клетки или канцерогенеза. Около 50 ОУС могут возникнуть за5клеток и клеточного цикла. В клетках млекопитающих гомологичная рекомбинация (HR) и nonhomologous конце присоединение (NHEJ) разработан как основных путей для ремонта ДГЖД (рис. 2). HR происходит в конце S/G2 фазе и использует нетронутыми сестра хроматиды как шаблон для ремонта потенциально без ошибок. В сравнении NHEJ активным на протяжении клеточного цикла и потенциально мутагенных как пар могут быть добавлены или резецируется перед лигирование сломанной заканчивается. Кроме того альтернативные присоединения конца могут привлекаться в качестве механизма медленно мутагенных резервного восстановления в случае NHEJ дефицит6,7.

DSB побудить фосфорилирование гистон H2AX 139 Серина в регионе несколько пар megabase вокруг каждого DSB. Формируя ядерной очагов названы γH2AX очагов и поддаются обнаружению с помощью микроскопии иммунофлуоресценции8. ΓH2AX способствует набору далее DSB-отзывчивым белков и участвует в chromatin remodeling, репарации ДНК и трансдукции сигнала9. Как считается, что каждый γH2AX фокус представляют единый DSB, количественная оценка DSB, иммунофлуоресценции возможно, которая была продемонстрирована в рак клеточных линий и пациентов образцов10,11, 12 , 13 , 14. 53BP1 (белок p53 привязки 1) является другой ключевой белок в посредничестве DSB ремонт. Он участвует в наборе DSB-отзывчивым белков, контрольно-пропускной пункт сигнализации и Синапсис DSB заканчивается15. Кроме того 53BP1 играет решающую роль в выборе пути ремонт DSB. Это вызывает ремонт DSB к NHEJ время HR16. С учетом подлинных функций γH2AX и 53BP1 в ремонт DSB одновременный анализ γH2AX и 53BP1, иммунофлуоресценции может быть полезным методом для точного анализа формирования и ремонт DSB.

Эта рукопись содержит пошаговые протокол для выполнения иммунофлуоресценции γH2AX и 53BP1 в клеточных ядер. В частности техника применяется в нормальной фибробласты клетки линии NHDF, в рентгеновских облученных лимфоцитах здорового человека и CD34 + клеток у пациентов с острой миелоидной лейкемией. Подробности метода указано в контексте представленных результатов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

все методы, описанные здесь были одобрены II Комитет этики медицинского факультета Мангейма Гейдельбергского университета. Написанных информированное согласие было получено от всех лиц.

1. Подготовка материалов

  1. Стоковый раствор антикоагулянта: подготовить антикоагулянт Стоковый раствор 200 И.Ю гепарина на мл 0,9% хлорида натрия. Заполните каждый из коллекции трубок (рисовать объём 9 мл) с 2 мл антикоагулянт Стоковый раствор до вывода образцов крови или костного.
  2. Лизис решение для красных клеток: подготовка 10 x лизис решение для красных клеток с 82.91 г, аммония хлорида, бикарбонат аммония 7,91 g и 2 мл 0,5 М Этилендиаминтетрауксусная кислота раствора для рН 8,0, растворяя агентов в Двухместный дистиллированной воды для общим объемом 1 л
  3. Фиксации решение: добавить 8.3 мкл раствором гидроксида калия 1 M параформальдегида (PFA) 360 мг в микротитровальных трубке. Заполните трубу с фосфатный буфер (PBS) до отметки 1 мл трубки и тепловых труб в блоке Отопление на 95 ° C для получения 1 мл раствора PFA 36%. Передать решение PFA 36% 1 мл трубку с объемом 15 мл. Добавьте 8 мл PBS в 1 мл 36% PFA решение, чтобы получить 9 мл 4% раствора запасов PFA. Алиготе, 4% раствор PFA и хранить при температуре-18 ° C до использовать для фиксации клеток.
    Предупреждение: 1) калия гидроксида раствор обладает коррозионными свойствами. Помните о защиты глаз и кожи. 2) PFA канцерогенами. Избегайте контакта с кожей и ингаляции. Приготовляют раствор фиксации под капотом.
  4. Permeabilization решение: добавьте 50 мкл Octoxinol 9 до 50 мл PBS для получения решения приблизительно 0,1% Octoxinol-9.
  5. Преграждая разрешение: подготовить 5% и 2%, блокирование решений путем смешивания агент блокирования белка с PBS и хранить в 6 – 8 ° с.

2. Подготовка образцов

  1. фибробластов в культуре клеток: культивировать фибробластов клетки линии NHDF в увлажненные 5% CO 2 атмосфера при 37 ° C в среде RPMI 1640 с 10% плода телячьей сыворотки, 4 мм глютамин и 1% пенициллина/стрептомицина.
    1. Подготовка микроскопа с сторонником фибробласты
      1. удалить носитель из колбу (район рост 75 см 2) с экспоненциально растет NHDF фибробластов. PBS на 10мл флакон. Мыть нежно адэрентных фибробластов, вручную встряхивая колбу за 1 мин
      2. Удаление PBS и добавьте 1 mL трипсина в колбу. Встряхните флакон осторожно, чтобы обеспечить охват всех адэрентных клеток трипсином. Удаление трипсина из колбы. Поставьте колбу в инкубатор для 5 минут при 37 ° с.
      3. Принимают настой из инкубатора и добавляют 10 мл RPMI 1640 среднего в колбу. Пипетка средних вверх и вниз несколько раз, чтобы разогнать фибробласты.
      4. Пипетка 0,3 мл дисперсной фибробластов на каждой из двух полей микроскопа и поставить слайд в инкубатор на 24 часа, так что фибробласты присоединиться к слайду. Для иммуноокрашивания γH2AX и 53BP1 в ядрах фибробластов, переходите к шагу 3.1.
  2. Пациентов образцов
    1. кровь образцов: использовать коллекции трубок, которые были заполнены с 2 мл раствора антикоагулянт запасов и добавить 7 мл крови в трубы. Храните образцы на ночь при комнатной температуре (т.е., 18-20 ° C). Следующий день, изолировать G0/G1 фазе покоя мононуклеарных клеток центрифугированием градиента плотности (шаг 2.2.3).
    2. Образцы костного мозга: использовать коллекции трубок, которые были заполнены с 2 мл раствора антикоагулянт штока (шаг 1.1) и добавить 7 мл костного мозга в трубы. Храните образцы на ночь при комнатной температуре (т.е., 18-20 ° C). Следующий день, изолируйте G0/G1 фазе покоя мононуклеарных клеток центрифугированием градиента плотности (шаг 2.2.3). Использование CD34 микрошарики и клеточной разделения столбцов для изоляции CD34 + клеток.
    3. Изоляции мононуклеарных клеток центрифугированием градиента плотности
      Примечание: Мононуклеаров изолированы от крови и костного образцы по плотности градиентного центрифугирования 17 , 18 , 19.
      1. Развести гепаринизированным крови в соотношении 1:1 с PBS и образца гепаринизированным костного мозга в соотношении 1:3 с PBS. Осторожно приостановить клетки путем их рисования и из пипетки в два раза.
      2. Добавить объем среднего градиента плотности свежего трубки. Аккуратно слой разбавленной крови или костного мозга на вершине средний градиент плотности. Будьте осторожны, чтобы не смешивать два слоя.
      3. Центрифуга трубки для 30 мин при комнатной температуре и 400 x g. снимать верхний плазменный слой с пипеткой. Затем тщательно урожай мононуклеарных клеток в слое над средний градиент плотности. Передача мононуклеарных клеток в свежий трубку.
      4. Добавить по крайней мере три тома PBS мононуклеарных клеток в трубе. Осторожно приостановите клетки путем их рисования и из пипетки в два раза. Центрифуга для трубки для 10 мин при комнатной температуре и 400 x г.
      5. После отжима удалить супернатант и добавляют 10 мл 4 ° C, 1 x лизис решение для красных клеток. Нежно ресуспензируйте клетки путем их рисования и из пипетки в два раза и поместить трубку на льду на 5 мин. Затем добавьте 30 мл PBS на 4 ° C и центрифуги трубки для 10 мин при комнатной температуре и 400 x г.
    4. Подготовка cytospins
      1. подготовить два cytospins с мононуклеарных клеток пациента образцов (то есть, один из cytospin для γH2AX иммунофлюоресценции окрашивания и один cytospin для γH2AX и 53BP1 комбинированный пятнать иммунофлюоресценции) центрифугированием (300 x g, 10 мин) 1,0 x 10 5 клетки для каждого приготовления ( рис. 3 и 4).

3. γH2AX и 53BP1 иммунофлюоресценции окрашивание

  1. фиксации и permeabilization: исправить клетки с 200 мкл 4% ПФА за 10 мин. После фиксации Вымойте клетки мягко три раза с 30 мл PBS для 5 мин на шейкере лаборатории. Затем разрушения клеток с 200 мкл 0,1% Octoxinol 9 10 мин мыть клетки мягко три раза за 5 мин на лаборатории шейкер с 30 мл 5% раствора и блокировки. Заблокировать ячейки в 30 мл свежего 5%, преграждая разрешение для 1 ч.
  2. Инкубации с антител
    1. инкубировать один подготовки клетки с моноклонального анти γH2AX антитела мыши (1: 500) и другой подготовки клетки с моноклонального анти γH2AX антитела мыши (1: 500) и кролика polyclonal антитела анти 53BP1 (1: 500) на ночь в отеле 4 ° C.
    2. После инкубации вымыть клетки мягко 3 раза с 30 мл 2% раствора и блокировки для каждого 5 мин на лаборатории шейкер.
    3. Удалить блокирующий решение и инкубировать первый подготовки клетки с анти мыши вторичное антитело проспряганное Alexa488 коза (1: 500) и второй подготовки клетки с (анти мыши вторичное антитело проспряганное Alexa488 коза 1: 500) и анти кролик вторичные антитела конъюгированных Alexa555 осла (1: 500) за 1 ч при комнатной температуре.
  3. Среднего монтажа: слайд с клетками в миску и вымыть клетки мягко три раза для каждого 5 мин на лаборатории шейкер с PBS по 30 мл. Удаление PBS и смонтировать клетки с монтажа носитель, содержащий 4,6-diamidino-2-phenylindole. Осторожно положите coverslip поверх средства монтажа, так что нет пузырьков воздуха Встроенный. Подождите, по крайней мере 3 h для упрочнения среды монтажа до анализа клеток по микроскопии флуоресцирования.

4. Анализ γH2AX и 53BP1 очагов

  1. микроскопии флуоресцирования: анализ γH2AX и 53BP1 центрами в ядрах клеток с флуоресцентным микроскопом оснащены фильтрами для DAPI, Alexa 488 и Cy3 во время визуализации на объектив 100 X увеличение. Запись изображения с камеры и обрабатывать изображения с соответствующим программным обеспечением обработки изображений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Анализ γH2AX очагов в клетках является наиболее точным в фазе G0/G1 и G2 фазе, когда γH2AX очаги появляются как собственный люминесцентные точки (Рисунок 5A). В отличие от анализа очагов γH2AX клеток в S фазе осложняется дисперсной Пан ядерных γH2AX крапинками, вызванные процессом репликации (Рисунок 5B).

Фиксация клеток была выполнена с 4% PFA (10 мин) и permeabilizati...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Иммунофлуоресценции γH2AX и 53BP1 является полезным методом для анализа формирования и ремонт ДГЖД в широком спектре областей исследований. Критические параметры, которые влияют на результаты экспериментов являются фазы клеточного цикла, агенты, используемые для фиксации и permeabilization клеток, выбор антител и аппаратное и программное обеспечение флуоресцентным микроскопом.

Влияние клеточный цикл на модели очагов γH2AX была продемонстрирована экспоненциально растет нормальной фибробласты кл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Проект был поддержан фондом немецкого Хосе Каррерас лейкемии (DJCLS 14 R/2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
RPMI средаSigma-AldrichR0883Среда для клеточной культуры
Heparin sodiumratiopharmPZN 3029843  Гепарин 5 000 МЕ/мл
Раствор хлорида натрия 0,9%B. BraunPZN 1957154Компонент стокового антикоагулянта
Ficoll-Paque PremiumGE Healthcare17-5442-02Среда для выделения мононуклеарных клеток
Раствор трипсина 10XSigma-Aldrich59427CФермент для диссоциации фибробластов в клеточной культуре
CD34 MicroBead KitMiltenyi Biotec130-046-702Выделение CD34+ миелоидных клеток-предшественников
Диагностические предметные стекла для микроскопаThermo ScientificER-203B-CE24Предметные стекла для микроскопа
Megafuge 1.0 RHeraeus75003060  Настольная центрифуга 
Cytospin
КрышкаHeraeus76003422Крышка для работы без микропробирок
Контейнер CytoHeraeus75003416Контейнер Cyto с 2 коническими отверстиями
Держатель зажимаHeraeus75003414Носитель для удержания контейнера Cyto и ползунка
Опорный вкладышHeraeus75003417Опорный вкладыш для держащий зажим
носитель Triton X-100 (Octoxinol 9)Thermo Scientific85112Моющее средство для проникновения клеточных мембран
Раствор гидроксида калия 1MMerck Millipore109107Необходим для приготовления раствора параформальдегида
ПараформальдегидSigma-AldrichP6148Фиксирующий агент
Фосфатный буферный физиологический растворSigma-AldrichD8537Сбалансированный солевой раствор
ХемиблокаторMerck Millipore2170Блокатор
мыши моноклональный анти-&гамма; Антитело к H2AX (JBW301)Merck Millipore05-636Первичное антитело для обнаружения γ H2AX
Поликлональное антитело кролика против 53BP1 антитела (NB100-304)Novus BiologicalsNB100-304Первичное антитело для обнаружения 53BP1
Alexa Fluor 488-конъюгированное козье антитело против мышиInvitrogenA-11001Вторичное антитело
Alexa Fluor 555-конъюгированное ослиное антитело против кроликаInvitrogenA-31572Вторичное антитело
Vectashield монтажная средаVector LaboratoriesH-1200содержит DAPI для окрашивания ДНК
Axio Scope.A1Zeiss490035Флуоресцентный микроскоп
Cool Cube 1 CCD камераМетасистемыH-0310-010-MSСистема камер для цифровой записи
Программное обеспечение ISISМетасистемы НеприменимоПрограммное обеспечение для микроскопа
Аппарат

Ссылки

  1. Hoeijmakers, J. H. Genome maintenance mechanisms for preventing cancer. Nature. 411 (6835), 366-374 (2001).
  2. Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
  3. Zeman, M. K., Cimprich, K. A. Causes and consequences of replication stress. Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).
  4. IAEA. Biological effects of low doses of ionizing radiation: A fuller picture. , https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf (1994).
  5. Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12871-12876 (2003).
  6. Simsek, D., Jasin, M. Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation. Nat Struct Mol Biol. 17 (4), 410-416 (2010).
  7. Weinstock, D. M., Brunet, E., Jasin, M. Formation of NHEJ-derived reciprocal chromosomal translocations does not require Ku70. Nat Cell Biol. 9 (8), 978-981 (2007).
  8. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
  9. Scully, R., Xie, A. Double strand break repair functions of histone H2AX. Mutat Res. 750 (1-2), 5-14 (2013).
  10. Walters, D. K., et al. Evidence for ongoing DNA damage in multiple myeloma cells as revealed by constitutive phosphorylation of H2AX. Leukemia. 25 (8), 1344-1353 (2011).
  11. Yu, T., MacPhail, S. H., Banath, J. P., Klokov, D., Olive, P. L. Endogenous expression of phosphorylated histone H2AX in tumors in relation to DNA double-strand breaks and genomic instability. DNA Repair (Amst). 5 (8), 935-946 (2006).
  12. Sedelnikova, O. A., Bonner, W. M. GammaH2AX in cancer cells: a potential biomarker for cancer diagnostics, prediction and recurrence. Cell Cycle. 5 (24), 2909-2913 (2006).
  13. Chen, E., et al. JAK2V617F promotes replication fork stalling with disease-restricted impairment of the intra-S checkpoint response. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (42), 15190-15195 (2014).
  14. Popp, H. D., et al. Increase of DNA damage and alteration of the DNA damage response in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemias. Leuk Res. 57, 112-118 (2017).
  15. Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (1), 7-18 (2014).
  16. Escribano-Diaz, C., et al. A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice. Mol Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
  17. Boyum, A. Separation of White Blood Cells. Nature. 204, 793-794 (1964).
  18. Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).
  19. Bain, B., Pshyk, K. Enhanced reactivity in mixed leukocyte cultures after separation of mononuclear cells on Ficoll-Hypaque. Transplant Proc. 4 (2), 163-164 (1972).
  20. Popp, H. D., et al. Leukocyte DNA damage after reduced and conventional absorbed radiation doses using 3rd generation dual-source CT technology. Eur J Radiol Open. 3, 134-137 (2016).
  21. Rothkamm, K., Balroop, S., Shekhdar, J., Fernie, P., Goh, V. Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: a quantitative biomarker of low-level radiation exposure. Radiology. 242 (1), 244-251 (2007).
  22. Lobrich, M., et al. In vivo formation and repair of DNA double-strand breaks after computed tomography examinations. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (25), 8984-8989 (2005).
  23. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods Mol Biol. 588, 55-61 (2010).
  24. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods Mol Biol. 588, 63-66 (2010).
  25. Rothkamm, K., Lobrich, M. Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5057-5062 (2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

H2AX53BP1CD34H2AX
Иммунофлуоресценции γH2AX и 53BP1 для анализа формирования и ремонт двухнитевые разрывы ДНК
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.