Как Митохондрии являются лишь небольшой процент растительной клетки, они должны быть очищены для целого ряда исследований. Митохондрии могут быть изолированы от различных органов растений, гомогенизации, следуют дифференциальных и плотность градиентного центрифугирования для получения высокоочищенных митохондриальной дроби.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Изоляция и дыхательных измерения митохондрий от Резуховидка Таля
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Митохондрии являются основные органеллы, участвует в многочисленных метаболических путей в растениях, прежде всего производства аденозинтрифосфата (АТФ) от окисления снижение соединений, таких как никотинамид аденин динуклеотид (NADH) и флавин аденин динуклеотид (2ГВС). Полная Аннотация Arabidopsis thaliana генома установил его как наиболее широко используемых растений модель системы, и таким образом необходимость очистить митохондрий от различных органов (лист, корень или цветок) необходимо в полной мере использовать инструменты, Теперь доступны для Arabidopsis для изучения митохондриальной биологии. Митохондрии, изолируются гомогенизацией тканей, с использованием различных подходов, последовал ряд шагов дифференциального центрифугирования, производству сырой митохондриальной Пелле, который далее очищается с помощью непрерывной коллоидных плотность градиент Центрифугирование. Коллоидный плотность материала впоследствии удаляется несколько шагов центрифугирования. Начиная с 100 г свежих листьев ткани, обычно получается 2-3 мг митохондрий. Респираторные эксперименты на этих митохондрий отображения типичный ставки 100-250 нмоль O2 мин-1 мг всего митохондриальных белок-1 (NADH-зависимая скорость) с возможностью использования различных субстратов и ингибиторов для определения субстраты окисляются и возможностей альтернативных и цитохром терминала оксидазы. Этот протокол описывает метод изоляции митохондрий от Arabidopsis thaliana листья с помощью непрерывной коллоидных плотности градиенты и эффективного дыхания измерения очищенный завод митохондрий.
Введение
История исследования растений митохондриальной восходит более чем 100 лет1. Нетронутыми митохондрии были впервые выделен в начале 1950-х годов с помощью дифференциального центрифугирования. Появление коллоидных плотность градиента в 1980-х допускается митохондрий очищаться без страданий осмотического перестройки. В то время как градиент очищенный митохондрии подходят для большинства целей, из-за чувствительности масс-спектрометрии, даже сравнительно незначительных загрязнений могут быть обнаружены и может быть ненадлежащим образом назначен митохондриальной расположение2. Использование свободного потока электрофореза могу....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Этот протокол используется для изоляции нетронутыми митохондрий от Arabidopsis thaliana органов, выращивается на земле, с помощью непрерывного коллоидных плотности градиенты. Все процедуры после сбора материала осуществляется на 4 ° C.
1. Подготовка шлифование средних, мыть буфер и градиент решения
- Подготовка 300 мл шлифовальных среднего (минус аскорбат и хвоща) и 200 мл 2 x мыть буфера в таблице 1 один день до изоляции, держать их холодной при 4 ° C.
Примечание: Добавление Аскорбат натрия и L-цистеина (бесплатная база) до конечной концентрации 17.84 и 20,36 мм, соответственно, шлифовальные средний утр....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Используя этот протокол, мы смогли обнаружить различные митохондриальных протеинов с SDS-PAGE и immunoblotting. Как показано на рисунке 3A, белок, изолированных от воды культуры ткани достаточно обнаружить слабые группы (2 мкг). Интенсивности сигнала увеличивается пропорционально суммам загружен. Для митохондрий изолированных от тканей, выращенных на пластины (рис. 3B), ответ на высокий свет стресс лечения в разных генотипов могу.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Как правило изоляции митохондрий от Arabidopsis листья урожайность до 3 мг митохондрий от примерно 80-100 3 - 4 - неделя старый растений, хотя урожайность более чем 5 мг часто может быть достигнуто с тщательного шлифования. Доходность зависит от условий роста и резко, как листья senesce, снижается, хотя митохондрии структура, как представляется, хорошо сохраняться во время старения9. Одним из наиболее важных особенностей получить хороший урожай является метод измельчения чтобы лизировать клетки вы.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют никакого конфликта интересов.
Благодарности
Это исследование было поддержано Австралийский исследовательский совет центра передового опыта в завод энергии биологии CE140100008, Австралийский исследовательский совет будущее стипендий (FT130100112) MWM и Феодор Линен стипендий (Александр фон Гумбольдт Фонд, Германия) для JS.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | Химический |
| антимицин A | Sigma-Aldrich | A8674 | Химический, растворяемый в этаноле |
| антитело AOX | от Tom Elthon | Elthon et al., 1989 | |
| Аскорбат | Sigma-Aldrich | A0157 | Аскорбатоксидаза от Cucurbita sp. |
| ATP | Sigma-Aldrich | A26209 | Химический |
| бычий сывороточный альбумин (БСА) | Bovogen | BSAS 1.0 | Химическая |
| ясность западный субстрат ECL | Bio-Rad Laboratories | 1705061 | Chemical |
| Criterion Беспятнистые сборные железобетонные гели 8-16% 18 Wells | Bio-Rad Laboratories | 5678104 | Химический |
| цианид | Sigma-Aldrich | 60178 | химический |
| Цитохром c | Sigma-Aldrich | C3131 | Химический |
| Difco Агар, гранулированный | BD Biosciences | 214530 | Химический |
| дитиотрейтол | Sigma-Aldrich | D0632 | Химический |
| ЭДТА динатриевая соль | Sigma-Aldrich | E5134 | Химический |
| Gamborg B-5 Базальная среда | Austratec | G398-100L | Химический |
| Витаминный раствор Gamborg (1000x) | Austratec | G219-100ML | Химический |
| козий анти-мышиный IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706516-2мл | Химический |
| козий анти-кролик IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706515-2мл | Химический |
| L-цистеин | Sigma | C7352-100G | Химический |
| сульфат | магнияSigma-Aldrich | 230391 | Chemical |
| Murashige & Skoog Смесь базальных солей (MS) | Austratec | M524-100L | Химический |
| миксотиазол | Sigma-Aldrich | T5580 | Химический, растворить в этаноле |
| NADH | Sigma-Aldrich | N8129 | Химическое |
| антитело Ndufs4 | от Etienne Meyer | Meyer et al., 2009 | |
| n-Пропилгаллат | Sigma-Aldrich | P3130 | Химический, растворить в этаноле |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Химический, коллоидный градиент |
| плотности Поливинилпирролидон (PVP40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | Химический |
| цианид калия | Sigma-Aldrich | 60178 | Химический |
| одноосновной фосфат калия (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | Химический |
| пируват | Sigma-Aldrich | P2256 | Химический |
| хлорид натрия | Chem-Supply | SA046 | Химический |
| дитионит натрия | Sigma-Aldrich | 157953 | Химический |
| L-аскорбат натрия | Sigma | A4034-100G | Химический |
| сукцинат | Sigma-Aldrich | S2378 | Химический |
| сахароза | Chem-Supply | SA030 | Химический |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | Химический |
| тетранатрий пирофосфат (Na4P2O7 · 10H2O) | Sigma-Aldrich | 221368 | Химический |
| транс-блот Турбо RTA миди нитроцеллюлоза Трансфер Набор для переноса | био-рад лабораторий | 1704271 | химический |
| тритон-х 100 | сигма-олдрич | x100 | химический, моющее средство |
| западный блокирующий реагент | Sigma | 11921681001 | Химический |
| баланс | Mettler Toledo | XS204 | Оборудование |
| Стаканы | Isolab | 50 мл | |
| Центрифуга | Beckman Coulter | Avanti J-26XP | |
| Оборудование Центрифуга Пробирки | Nalgene | 3117-9500 | Оборудование |
| Циркуляционный насос | Julabo | 1124971 | Прикреплено к камера с кислородным электродом |
| Коническая колба | Isolab | 500 мл | |
| Пипетка | 3 мл | ||
| Ротор с фиксированным углом | наклона Beckman Coulter | JA25.5 | |
| Оборудование | Воронка Per Alimenti | 14 см | Для фильтрации |
| Градиентная наливка | Bio-Rad | 165-4120 | Для приготовления градиентов |
| Магнитная мешалка ATE | VELP Scientifica | F20300165 | Оборудование |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | Фильтрующий материал |
| Ступка и пестик | Jamie Oliver | Гранит, 6 дюймов | Оборудование |
| O2view | Hansatech Instruments | Программное обеспечение для мониторинга кислорода | |
| Oxygraph Plus System | Hansatech Instruments | 1187253 | кислородный электрод типа Clark |
| Кисть | Художник первого выбора | 1008R-12 | |
| Парапленка | Bemis | PM-996 | пластиковая парафиновая пленка |
| Перистальтический насос | Gilson | F155001 | Для подготовки градиентов |
| ПВХ перистальтические трубки | Gilson | F117930 | Для подготовки градиентов |
| Водяная баня | VELP Scientifica | OCB | Оборудование |
Ссылки
- Day, D. A. Highlights in plant mitochondrial research. Methods in molecular biology. Plant mitochondria. 1305, v-xvi (2015).
- Millar, A. H., Carrie, C., Pogson, B., Whelan, J. Exploring the function-location nexus: Using multiple lines of evidence in defining the subcellular location of plant proteins. Plant Cell
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
