Как Митохондрии являются лишь небольшой процент растительной клетки, они должны быть очищены для целого ряда исследований. Митохондрии могут быть изолированы от различных органов растений, гомогенизации, следуют дифференциальных и плотность градиентного центрифугирования для получения высокоочищенных митохондриальной дроби.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Изоляция и дыхательных измерения митохондрий от Резуховидка Таля
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Митохондрии являются основные органеллы, участвует в многочисленных метаболических путей в растениях, прежде всего производства аденозинтрифосфата (АТФ) от окисления снижение соединений, таких как никотинамид аденин динуклеотид (NADH) и флавин аденин динуклеотид (2ГВС). Полная Аннотация Arabidopsis thaliana генома установил его как наиболее широко используемых растений модель системы, и таким образом необходимость очистить митохондрий от различных органов (лист, корень или цветок) необходимо в полной мере использовать инструменты, Теперь доступны для Arabidopsis для изучения митохондриальной биологии. Митохондрии, изолируются гомогенизацией тканей, с использованием различных подходов, последовал ряд шагов дифференциального центрифугирования, производству сырой митохондриальной Пелле, который далее очищается с помощью непрерывной коллоидных плотность градиент Центрифугирование. Коллоидный плотность материала впоследствии удаляется несколько шагов центрифугирования. Начиная с 100 г свежих листьев ткани, обычно получается 2-3 мг митохондрий. Респираторные эксперименты на этих митохондрий отображения типичный ставки 100-250 нмоль O2 мин-1 мг всего митохондриальных белок-1 (NADH-зависимая скорость) с возможностью использования различных субстратов и ингибиторов для определения субстраты окисляются и возможностей альтернативных и цитохром терминала оксидазы. Этот протокол описывает метод изоляции митохондрий от Arabidopsis thaliana листья с помощью непрерывной коллоидных плотности градиенты и эффективного дыхания измерения очищенный завод митохондрий.
Введение
История исследования растений митохондриальной восходит более чем 100 лет1. Нетронутыми митохондрии были впервые выделен в начале 1950-х годов с помощью дифференциального центрифугирования. Появление коллоидных плотность градиента в 1980-х допускается митохондрий очищаться без страданий осмотического перестройки. В то время как градиент очищенный митохондрии подходят для большинства целей, из-за чувствительности масс-спектрометрии, даже сравнительно незначительных загрязнений могут быть обнаружены и может быть ненадлежащим образом назначен митохондриальной расположение2. Использование свободного потока электрофореза могут удалить оба plastidic и Пероксисома загрязнение3, но свободный поток электрофорез узкоспециализированные техника и не требуется для подавляющего большинства исследований. Кроме того, когда определение расположения белка, который она должна быть вспомнил, что двойное или несколько ориентации белков происходит в клетках. Более 100 двойной целевых белков описаны для хлоропластов/пластид и митохондрий4и ряд белков, ориентированные на митохондрии и пероксисомы известны также5. Кроме того перебазирования белков под конкретные стимулы, например оксидативного стресса, является новой темой в ячейки биологии6. Таким образом местоположение белков необходимо рассматривать в контексте изучения биологии, и разнообразные подходы используются для определения и проверки месте2.
Митохондрии обычно изолированы от растительных тканей, гомогенизации, баланс между разорвать открыть клеточной стенки выпустить митохондрии, а не повреждение митохондрий. Традиционно картофель и цветная капуста, гомогенизации предполагает использование бытовой блендер/соковыжималка аппарат сделать жидкого экстракта в буфере с различными компонентами для поддержания активности. Изоляция митохондрий от гороха листья, (популярный материал для митохондриального изоляции с помощью молодых саженцев (~ 10 дней), использует blender для Лизируйте клетки, как лист материала мягкой. При наличии Arabidopsis thaliana T-ДНК инсерционному нокаут-линий необходимо иметь возможность очистить митохондрий выполнять функциональные исследования потребовало разработки методов изолировать митохондрий от лист, корень или цветок ткани. В целом методы, разработанные для других растений работал хорошо7, с приработок, измельчения материала необходимо оптимизировать. Для выращивания арабидопсиса это может быть достигнуто в различных способов (см. ниже) и отличается между типами ткани (корень против съемки). Использование непрерывного градиента также могут быть оптимизированы как плотность митохондрий от различных органов или этапы развития означает, что они могут перенести по-разному. Таким образом для максимального разделения плотность градиента можно усовершенствовать для достижения лучших разделения.
Однажды очищенный, митохондрии может использоваться для различных исследований, в том числе экспериментов усвоение белков и тРНК, анализов активность фермента, дыхательной цепи измерения и Вестерн-блот анализ. Изолированных митохондриях может также использоваться для анализа масс-спектрометрии белков изобилия. Целевые несколько реакции, мониторинг (MRM) анализ позволяет для количественной оценки определенных белков, но требуют значительных пробирного развития. В отличие от этого квантификация диметил или других изотопов этикетки8, обеспечивает открытие подход в выявлении различий через весь протеом, который может использоваться для выявления роман биологические исследования.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Этот протокол используется для изоляции нетронутыми митохондрий от Arabidopsis thaliana органов, выращивается на земле, с помощью непрерывного коллоидных плотности градиенты. Все процедуры после сбора материала осуществляется на 4 ° C.
1. Подготовка шлифование средних, мыть буфер и градиент решения
- Подготовка 300 мл шлифовальных среднего (минус аскорбат и хвоща) и 200 мл 2 x мыть буфера в таблице 1 один день до изоляции, держать их холодной при 4 ° C.
Примечание: Добавление Аскорбат натрия и L-цистеина (бесплатная база) до конечной концентрации 17.84 и 20,36 мм, соответственно, шлифовальные средний утром в изоляции. Если митохондрии должны использоваться для западной помарки или синий родной Полиакриламид гель электрофореза (БН-страница) анализ, составляют 2 x мыть буфера без BSA. - Подготовьте градиенты утром митохондриальной изоляции (рис. 1 и Таблица 1).
- Сделать градиент решения тяжелой и легкой в двух стаканах; 35 мл каждого достаточно для двух труб градиента.
- Вымойте палаты градиента Заливщик и перистальтические трубы ПВХ деионизированной водой и обеспечить даже потока через трубы из всех труб.
- 2 место пробирок (50 мл) под небольшим углом на льду с розетками перистальтические трубы ПВХ пленку внутри трубы, чтобы убедиться, что градиент решение работает вниз стороне трубы.
- Тесной связи между внутренней и внешней камеры (черный рычаг вниз). Место градиента Заливщик на магнитной мешалкой с баром небольшой переполох во внутренней камере.
- Залейте 35 мл тяжелых градиента раствор в внутренней камере (палаты с трубки розетки). Отказаться от тяжелых градиентного раствора в двух пробирок, размещены на льду, до тех пор, пока половина остается с Перистальтический насос курсу быстро (300 мл/ч).
- Залейте 35 мл света градиента раствор в наружной палата (палата без трубки розетки). Открыть соединение между камерами (push черный рычаг вверх на полпути) и позволяют решать осторожно перемешать. Смешайте решения с использованием магнитной мешалкой.
- Разрешить решения для запуска медленно (60 мл/ч) до тех пор, пока все градиентной смеси было отказаться от камер, что привело в двух трубок градиентной заливкой 0 - 4,4% (w/v) поливинилпирролидона (ПВП). Сохранить градиенты на льду до готовности для использования в шаг 2.12.
Примечание: После того, как был подготовлен градиента, развести 2 x мыть средних и 1 x prechilled деионизированной водой и держать холодной при 4 ° C.
2. гомогенизации и митохондриальной изоляции
- Вырезать весь розетка ткани от 4 - неделя старый Arabidopsis растений, выращенных на земле с ножницами, по крайней мере 80 растения потребуются для 1 prep.
Примечание: 10-14 день старый воды культур, минимум 5 горшки/prep, или 2 - неделя старый сеянцев, выращенных на плиты агара фотосинтетическую & Скуг базальной соль смесь (МС), минимум 4 пластин, также могут быть использованы. - Место половина из растительного материала, которая была сокращена на мелкие кусочки в предварительно охлажденным 4 ° C большой ступку и пестик с 75 мл среднего помола (Таблица 1) и широко растереть несколько минут, пока слева не большие куски ткани.
- Предварительно намочить 4 слоев Биофильтрационный материал (размер пор 22-25 мкм) с измельчением среднего и фильтр огневки через 4 слои материала фильтрации через воронку пластиковые в коническую колбу 500 мл.
- Измельчить, остальная половина из ткани с другой 75 мл среднего помола.
- Объединить гомогенатах в фильтрующих материалов и максимально возможной огневки через фильтр.
- Измельчить оставшиеся ткани, оставшиеся на Биофильтрационный материал снова с оставшиеся 150 мл шлифовальных средний, фильтр снова в коническую колбу 500 мл.
- Центрифуга для отфильтрованных огневки в 8 предварительно охлажденные 50 мл пластиковых пробирок на 2500 x g при 4 ° C в фиксированный угол ротора за 5 мин.
- Налить супернатант в чистой пробирок (50 мл; не мешать зеленые гранулы) и центрифуги на 17500 x g при 4 ° C на 20 мин в фиксированный угол ротора.
- Отбросить все, но < 3 мл супернатант путем аспирации (или осторожно слить не нарушая гранулы). Нежно ресуспензируйте гранулы в остаточных супернатанта, используя небольшой тонкой кистью.
- Добавьте 10 мл 1 x мыть буфера к каждой пробке и объединить 4 трубки в 1 чистых пластиковых пробирок (то есть, что приводит к 2 трубы).
- Заполнить эти трубки с 1 x мыть буфера до 50 мл и повторите шаги 2,7-2,9.
- Бассейн сырой митохондриальной окатышей в 1 трубки с помощью капельницы и равномерно расходятся с тонкой кистью (небольшое количество мыть буфера могут быть использованы, но окончательный объем должен быть меньше чем 3 мл надеть поверх градиента). Аккуратно слоя митохондриальной подвеска с дозатором на 2 непрерывное 0 - 4,4% (w/v) PVP градиентов.
- Баланс трубы по весу (с помощью 1 x мыть буфера) и центрифуги на 40000 x g при 4 ° C на 40 мин обеспечить перерыва выключен. Митохондрии будут мигрировать полоса в нижней части трубки, или может присутствовать в решении тяжелых в нижней части трубки (идентифицируются облачно, желтоватыми полосами; Рисунок 2).
- Осторожно удалите верхний 5 см решения выше митохондриальной группы путем аспирации.
- Распределить оставшиеся раствор, содержащий митохондрий в 2 чистые пробирки и заполнить с 1 x мыть буфера. Равномерно распределять градиент плотности коллоидных и митохондрии, покрывая рот трубку с пластиковой парафин фильм и переворачивать несколько раз. Центрифуги для 15 мин на 31000 x g при 4 ° C с медленным торможения.
Примечание: Перед центрифугированием, убедитесь, что митохондрии и оставшиеся коллоидных плотность градиент равномерно распределены. В противном случае градиент плотности коллоидных могут сосредоточиться в нижней части трубки и предотвратить грануляции митохондрий. - Удалите супернатант аспирации, заполнить трубу с 1 x мыть буфера до 50 мл и инвертировать снова для обеспечения смешивания. Центрифуги для 15 мин на 31000 x g при 4 ° C с медленным торможения.
- Аспирационная супернатант и собирать митохондриальной окатышей в как малые тома (~ 500 мкл) возможно с помощью пипетки с модифицированных 200 мкл советы (вырезать кончик немного выше ее конец увеличить его открытия). Митохондрии в 1,5 мл трубку и удержание их на льду для немедленного использования или хранения при температуре-80 ° C.
Примечание: Если митохондрий будет использоваться для натрия Додециловый сульфат полиакриламидный гель-электрофорез (SDS-PAGE), BN-страницы, или immunoblot анализов, используйте 1 x мыть буфера без BSA для окончательного стирок (т.е., шаг 2.15 и 2.16). - Определите концентрацию белка митохондрий, с помощью метода Брэдфорд.
Примечание: Для центрифуг аликвоты BN-страница на 4 ° C и магазин Пелле-80 ° c до использования. Для измерения потребления кислорода могут использоваться только свежевыделенных митохондрий.
3. кислорода измерения потребления
Примечание: Потребление кислорода, свежезаваренным изолированных завод митохондрий могут быть проанализированы с электродом кислорода Кларк типа, позволяя определение митохондриальной целостности, c тситохрома пути деятельности и альтернативный путь деятельности.
- Установка программного обеспечения
- Установка лицензионной кислорода, мониторинга программного обеспечения на компьютер, используемый для измерения потребления кислорода.
- Подготовка среднего дыхания, субстратов, запасов химических растворов и Кларк тип электрода кислорода
- Подготовьте дыхания средний (300 мм сахарозы, 10 мм NaCl, 5 мм х2PO4, 2 мм MgSO4, 0,1% (w/v), бычьим сывороточным альбумином (БСА), 10 мм TES (рН 7,2)) используется для исследования потребления кислорода.
- Подготовьте субстратов, ингибиторы и эффекторы, используемых для измерения митохондриальное дыхание (Таблица 2). Они могут быть подготовленных ранее и хранятся при температуре-20 ° C.
Примечание: Нейтрализации pH кислой решений, таких как органические кислоты до pH 7.0 с использованием NaOH перед использованием. - Теплое дыхание средне-такая же температура как Пробирная палата (25 ° C).
- Соберите электрода кислорода Кларк типа, как описано в протоколе производителя.
- Место 1 мл воздуха насыщенный водой (вода, воздух насыщен получается энергично встряхивать небольшое количество обессоленной воды в большой коническую колбу) в измерительную камеру. Чтобы переключиться на мешалки, нажмите кнопку «Гребка скорость». Нажмите на кнопку «Вкл.» и установите скорость мешалки для 65 об/мин. Нажмите кнопку «ОК», чтобы продолжить. Постоянно помешивая воды 25 ° c.
- Калибровка кислорода электрода
- Теплая вода, которая будет использоваться для калибровки в такая же температура как Пробирная палата (25 ° C).
- Подождите, пока ток стабилизации и калибровки электродов кислорода.
- Чтобы начать калибровку кислорода электрода, нажмите кнопку «Калибровка», выберите «Жидкой фазы калибровка», а затем «Air насыщенных водой.»
- (Калибровка кислорода (жидкая фаза) - шаг 1 из 5) откроется новое окно. Выберите канал для калибровки (канал, придаваемое поле управления электрод) и введите переменные (набор «Температуры камеры» до 25 ° C и «Атмосферное давление» 101,32 кПа). Нажмите кнопку «OK «для продолжения.
- В следующий шаг (шаг 2 из 5), установки скорость мешалки (65 мин) и нажмите кнопку «ОК», чтобы продолжить.
- На шаге 3 из 5 дождитесь сигнала для достижения плато. Термин «плато достиг, нажмите OK, чтобы продолжить» будет отображаться в поле. Нажмите кнопку «ОК», чтобы продолжить.
- На шаге 4 раздела 5 установить нулевой кислорода в камере, добавив Дитионит натрия 5 мг. Нажмите кнопку «ОК», чтобы продолжить.
Примечание: Снижение концентрации кислорода должен быть видимым в трассировке и должен достичь 0. - На последнем шаге калибровки (шаг 5 из 5) дождитесь сигнала для достижения плато. Термин «плато достиг, нажмите OK, чтобы продолжить» будет отображаться в поле. Нажмите кнопку «ОК», чтобы продолжить.
- Нажмите кнопку «Сохранить калибровка», чтобы сохранить калибровки. Откроется новое окно. Нажмите кнопку «OK» для подтверждения, чтобы сохранить новую калибровку для окна управления кислорода.
Примечание: После успешной калибровки, обозначая «кислорода (нмоль/мл)» будет отображаться на оси y. - После калибровки очистите измерительной камеры в камеру с водой для ополаскивания (по крайней мере 5 - 10 раз) для обеспечения надлежащей очистки. Место 1 мл среды дыхания в измерительной камере и позволяют мембраны сбалансировать за несколько минут до тех пор, пока трассировка потребление кислорода является линейной.
- Адаптировать масштаб трассировки потребление кислорода для получения хорошей склона. Нажмите кнопку «Увеличить XY» и введите переменные (набор «Кислород», 0 - 300 и «Время оси» 0 - 45 мин).
- Определение митохондриальной целостности
- С открытым поршень добавьте 970 среднего насыщенного воздуха дыхания мкл реакционной камере.
- Добавить 30 мкл изолированных митохондриях или 150 мкг всего митохондриальных белок как определено после изоляции митохондрии (общий белок должен быть включен в расчеты потом) в реакционной камере с помощью пипетки с вырежьте кончиком.
- Перемешайте митохондриальной подвеска, непрерывно с помощью магнитной мешалкой бар (65/мин) при 25 ° C воздуха-насытить решения.
- Печать в камеру с поршнем, нажмите кнопку «Начать запись», чтобы записать потребление кислорода и разрешить трассировку потребление кислорода для стабилизации (1-2 мин).
- Определите скорость потребления кислорода вручную после добавления аскорбата 10 мм и 25 мкм цитохрома c 5 минут получить курс «перед моющее средство».
Примечание: Для обозначения добавления субстратов, ингибиторы и эффекторы непосредственно в трассировке, нажмите кнопку «Добавить событие Марка» и введите соответствующее обозначение метки. Нажмите кнопку «ОК», чтобы продолжить. - Определите скорость потребления кислорода вручную на 3 мин после добавления 0,05% (v/v) моющего средства, чтобы дать курс «после моющих средств». Нажмите кнопку «Остановить запись».
- Нажмите на кнопку «Темпы изменений таблицы». 2 курсоры будут отображаться как вертикальные линии на экране графика. Щелкните и перетащите пара скорость курсоров на необходимые позиции в трассировку, чтобы определить скорость интервал. Перемещение скорость интервал вдоль трассировки, используя курсор слева. Задайте интервал скорость с помощью курсора правильный курс. Кислорода, мониторинга программного обеспечения автоматически рисует линию наилучшего между двух курсоров при перемещении курсоры интервал скорость по трассе.
- После определения интервала желаемой скорости и позиции, введите стоимость в таблицу правой кнопкой мыши на 1 2 курсоров и выберите «Добавить курс в таблицу». Нажмите кнопку «Добавить», чтобы подтвердить для отображения скорость на таблице Основная ставка.
- Рассчитать митохондриальной целостность путем деления «перед моющих средств» ставка по курсу «после моющих средств», выраженный в процентах и вычесть его из 100.
- Определение митохондриальное дыхание
- С открытым поршень мкл 970 среднего насыщенного воздуха дыхания в реакционной камере. Добавьте 500 мкм СПС и 30 мкл изолированных митохондриях или 150 мкг всего митохондриальных белок с помощью пипетки с вырежьте кончиком для дыхания среде в реакционной камере.
- Перемешать митохондриальной подвеска, непрерывно с помощью магнитной мешалкой бар (65/мин) при 25 ° C.
- Закрыть поршень, нажмите кнопку «Начать запись» для записи потребления кислорода и ждать 1-2 мин на уровень потребления кислорода для стабилизации (при линейной трассировки потребление кислорода). Добавьте 5 мм сукцинат. Запись скорость потребления кислорода для около 2 мин.
Примечание: Для обозначения добавления субстратов, ингибиторы и эффекторы непосредственно в трассировке, нажмите кнопку «Добавить событие Марка» и введите соответствующее обозначение метки. Нажмите кнопку «ОК», чтобы продолжить. - Добавьте 1 мм аденозиндифосфат (ADP). Продолжить запись скорость потребления кислорода на 2 мин.
- Добавьте 1 мм НАДН. Запись скорость потребления кислорода для 4-8 мин. Этот показатель является объем дыхания через цитохрома-оксидазы.
- Добавить 1 мм цианистый калий (KCN) (или 2,5 мкм myxothiazol или 5 мкм antimycin A) препятствовать путь c тситохрома и продолжать запись для около 2 мин соблюдать потребление кислорода через альтернативные оксидазы.
- Добавление Дитиотреитол (DTT) 5 мм и 10 мм пируват полностью активировать альтернативных оксидазы. Продолжить запись для 5-7 мин: это потенциал альтернативного оксидазы.
- Добавьте 500 мкм н пропиловый галлат (НПГ) и записать на 2 мин. Это оценивает уровень потребления остаточного кислорода, который не препятствует химически. Вычтите этот показатель от других курсов, записал, как это не может быть митохондриального происхождения. Потребление кислорода, еще происходит после ингибирование цитохрома c и АОГ путь (по KCN и nPG) весьма вероятно, исходить от пероксидазы присутствует в качестве примеси в изолированных митохондриях9.
- Нажмите кнопку «Остановить запись».
- Нажмите на кнопку «Темпы изменений таблицы» и введите курс в таблицу правой кнопкой мыши на одном из двух курсоров и выберите «Добавить таблицу норм». Нажмите кнопку «Добавить», чтобы подтвердить для отображения скорость на таблице Основная ставка.
Примечание: Когда добавление эффекторов растворяется в органических растворителях (например., antimycin А, НПГ, myxothiazol), камеры и поршень необходимо промыть с этанолом и затем воды для обеспечения надлежащей очистки.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Используя этот протокол, мы смогли обнаружить различные митохондриальных протеинов с SDS-PAGE и immunoblotting. Как показано на рисунке 3A, белок, изолированных от воды культуры ткани достаточно обнаружить слабые группы (2 мкг). Интенсивности сигнала увеличивается пропорционально суммам загружен. Для митохондрий изолированных от тканей, выращенных на пластины (рис. 3B), ответ на высокий свет стресс лечения в разных генотипов могу...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Как правило изоляции митохондрий от Arabidopsis листья урожайность до 3 мг митохондрий от примерно 80-100 3 - 4 - неделя старый растений, хотя урожайность более чем 5 мг часто может быть достигнуто с тщательного шлифования. Доходность зависит от условий роста и резко, как листья senesce, снижается, хотя митохондрии структура, как представляется, хорошо сохраняться во время старения9. Одним из наиболее важных особенностей получить хороший урожай является метод измельчения чтобы лизировать клетки вы...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют никакого конфликта интересов.
Благодарности
Это исследование было поддержано Австралийский исследовательский совет центра передового опыта в завод энергии биологии CE140100008, Австралийский исследовательский совет будущее стипендий (FT130100112) MWM и Феодор Линен стипендий (Александр фон Гумбольдт Фонд, Германия) для JS.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | Химический |
| антимицин A | Sigma-Aldrich | A8674 | Химический, растворяемый в этаноле |
| антитело AOX | от Tom Elthon | Elthon et al., 1989 | |
| Аскорбат | Sigma-Aldrich | A0157 | Аскорбатоксидаза от Cucurbita sp. |
| ATP | Sigma-Aldrich | A26209 | Химический |
| бычий сывороточный альбумин (БСА) | Bovogen | BSAS 1.0 | Химическая |
| ясность западный субстрат ECL | Bio-Rad Laboratories | 1705061 | Chemical |
| Criterion Беспятнистые сборные железобетонные гели 8-16% 18 Wells | Bio-Rad Laboratories | 5678104 | Химический |
| цианид | Sigma-Aldrich | 60178 | химический |
| Цитохром c | Sigma-Aldrich | C3131 | Химический |
| Difco Агар, гранулированный | BD Biosciences | 214530 | Химический |
| дитиотрейтол | Sigma-Aldrich | D0632 | Химический |
| ЭДТА динатриевая соль | Sigma-Aldrich | E5134 | Химический |
| Gamborg B-5 Базальная среда | Austratec | G398-100L | Химический |
| Витаминный раствор Gamborg (1000x) | Austratec | G219-100ML | Химический |
| козий анти-мышиный IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706516-2мл | Химический |
| козий анти-кролик IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706515-2мл | Химический |
| L-цистеин | Sigma | C7352-100G | Химический |
| сульфат | магнияSigma-Aldrich | 230391 | Chemical |
| Murashige & Skoog Смесь базальных солей (MS) | Austratec | M524-100L | Химический |
| миксотиазол | Sigma-Aldrich | T5580 | Химический, растворить в этаноле |
| NADH | Sigma-Aldrich | N8129 | Химическое |
| антитело Ndufs4 | от Etienne Meyer | Meyer et al., 2009 | |
| n-Пропилгаллат | Sigma-Aldrich | P3130 | Химический, растворить в этаноле |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Химический, коллоидный градиент |
| плотности Поливинилпирролидон (PVP40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | Химический |
| цианид калия | Sigma-Aldrich | 60178 | Химический |
| одноосновной фосфат калия (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | Химический |
| пируват | Sigma-Aldrich | P2256 | Химический |
| хлорид натрия | Chem-Supply | SA046 | Химический |
| дитионит натрия | Sigma-Aldrich | 157953 | Химический |
| L-аскорбат натрия | Sigma | A4034-100G | Химический |
| сукцинат | Sigma-Aldrich | S2378 | Химический |
| сахароза | Chem-Supply | SA030 | Химический |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | Химический |
| тетранатрий пирофосфат (Na4P2O7 · 10H2O) | Sigma-Aldrich | 221368 | Химический |
| транс-блот Турбо RTA миди нитроцеллюлоза Трансфер Набор для переноса | био-рад лабораторий | 1704271 | химический |
| тритон-х 100 | сигма-олдрич | x100 | химический, моющее средство |
| западный блокирующий реагент | Sigma | 11921681001 | Химический |
| баланс | Mettler Toledo | XS204 | Оборудование |
| Стаканы | Isolab | 50 мл | |
| Центрифуга | Beckman Coulter | Avanti J-26XP | |
| Оборудование Центрифуга Пробирки | Nalgene | 3117-9500 | Оборудование |
| Циркуляционный насос | Julabo | 1124971 | Прикреплено к камера с кислородным электродом |
| Коническая колба | Isolab | 500 мл | |
| Пипетка | 3 мл | ||
| Ротор с фиксированным углом | наклона Beckman Coulter | JA25.5 | |
| Оборудование | Воронка Per Alimenti | 14 см | Для фильтрации |
| Градиентная наливка | Bio-Rad | 165-4120 | Для приготовления градиентов |
| Магнитная мешалка ATE | VELP Scientifica | F20300165 | Оборудование |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | Фильтрующий материал |
| Ступка и пестик | Jamie Oliver | Гранит, 6 дюймов | Оборудование |
| O2view | Hansatech Instruments | Программное обеспечение для мониторинга кислорода | |
| Oxygraph Plus System | Hansatech Instruments | 1187253 | кислородный электрод типа Clark |
| Кисть | Художник первого выбора | 1008R-12 | |
| Парапленка | Bemis | PM-996 | пластиковая парафиновая пленка |
| Перистальтический насос | Gilson | F155001 | Для подготовки градиентов |
| ПВХ перистальтические трубки | Gilson | F117930 | Для подготовки градиентов |
| Водяная баня | VELP Scientifica | OCB | Оборудование |
Ссылки
- Day, D. A. Highlights in plant mitochondrial research. Methods in molecular biology. Plant mitochondria. 1305, v-xvi (2015).
- Millar, A. H., Carrie, C., Pogson, B., Whelan, J. Exploring the function-location nexus: Using multiple lines of evidence in defining the subcellular location of plant proteins. Plant Cell. 21 (6), 1625-1631 (2009).
- Eubel, H., et al. Free-flow electrophoresis for purification of plant mitochondria by surface charge. Plant J. 52 (3), 583-594 (2007).
- Murcha, M. W., et al. Protein import into plant mitochondria: Signals, machinery, processing, and regulation. J. Exp. Bot. 65 (22), 6301-6335 (2014).
- Carrie, C., et al. Approaches to defining dual-targeted proteins in Arabidopsis. Plant J. 57 (6), 1128-1139 (2009).
- Pinto, G., Radulovic, M., Godovac-Zimmermann, J. Spatial perspectives in the redox code - Mass spectrometric proteomics studies of moonlighting proteins. Mass Spectrom. Rev. , (2016).
- Day, D. A., Neuburger, M., Douce, R. Biochemical characterisation of chlorophyll-free mitochondria from pea leaves. Aust. J. Plant Physiol. 12 (3), 219-228 (1985).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nat. Protoc. 4 (4), 484-494 (2009).
- Cheah, M. H., et al. Online oxygen kinetic isotope effects using membrane inlet mass spectrometry can differentiate between oxidases for mechanistic studies and calculation of their contributions to oxygen consumption in whole tissues. Anal Chem. 86 (10), 5171-5178 (2014).
- Chrobok, D., et al. Dissecting the metabolic role of mitochondria during developmental leaf senescence. Plant Physiol. 172 (4), 2132-2153 (2016).
- Lee, C. P., Eubel, H., O'Toole, N., Millar, A. H. Combining proteomics of root and shoot mitochondria and transcript analysis to define constitutive and variable components in plant mitochondria. Phytochemistry. 72 (10), 1092-1098 (2011).
- Lee, C. P., Eubel, H., Solheim, C., Millar, A. H. Mitochondrial proteome heterogeneity between tissues from the vegetative and reproductive stages of Arabidopsis thaliana development. J. Proteome Res. 11 (6), 3326-3343 (2012).
- Millar, A. H., Whelan, J., Soole, K. L., Day, D. A. Organization and regulation of mitochondrial respiration in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 62, 79-104 (2011).
- Peters, K., et al. Complex I - complex II ratio strongly differs in various organs of Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 79 (3), 273-284 (2012).
- Werhahn, W. H., et al. Purification and characterization of the preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane from Arabidopsis thaliana: Identification of multiple forms of TOM20. Plant Physiol. 125 (2), 943-954 (2001).
- Heazlewood, J. L., Howell, K. A., Whelan, J., Millar, A. H. Towards an analysis of the rice mitochondrial proteome. Plant Physiol. 132 (1), 230-242 (2003).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
