Методическая статья

В пробирке SUMOylation Assay для изучения сумо E3 лигаза активность

DOI:

10.3791/56629

⸱

29 января 2018 г.

 ,  ,  , 
1Institute of Microbiology and Immunology, National Yang-Ming University, 2UC Davis Cancer Center, University of California, Davis, 3Department of Biochemistry and Molecular Medicine, University of California, Davis, 4Institute for Translational Medicine, College of Medical Science and Technology, Taipei Medical University, 5Division of Molecular and Genomic Medicine, National Health Research Institutes, 6Center for Infectious Disease and Cancer Research, Kaohsiung Medical University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В отличие от убиквитин ligases было выявлено несколько ligases E3 сумо. Это изменение в пробирке SUMOylation протокол имеет возможность идентифицировать Роман сумо E3 ligases assay растворения в пробирке .

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Модификация маленький убиквитин как модификатор (сумо) является важным столб-поступательные изменения (ПТМ), которая опосредует сигнала прежде всего путем модулирования белок белковых взаимодействий. Подобно убиквитин модификации, SUMOylation режиссер последовательного фермента Каскад, включая E1-активация ферментов (SAE1/SAE2), E2-спряжение фермента (Ubc9), E3-лигаза (то есть, основные сборки взаимодействия семьи, RanBP2 и Pc2). Однако, в отличие от ubiquitination, E3 лигаза не является необходимым для реакции, но не обеспечивают точность и эффективность для сопряжения сумо. Белки, изменена SUMOylation может быть идентифицирован в vivo пробирного через иммунопреципитации субстрата специфических антител и immunoblotting с сумо специфические антитела. Однако демонстрация белка сумо E3 лигаза деятельности требует растворения в пробирке SUMOylation анализов с использованием очищенные ферменты, субстрат и сумо белков. Поскольку в реакциях, в пробирке , обычно SAE1/SAE2 и Ubc9, только достаточно для сумо спряжение, повышение SUMOylation по предполагаемым лигаза E3 не всегда легко обнаружить. Здесь мы описываем изменение в пробирке SUMOylation протокол, который последовательно идентифицирует сумо модификации с помощью системы в vitro воссоздана. Шаг за шагом протокол для очистки каталитически активных K-bZIP, вирусный лигаза E3 сумо-2/3, также представил. SUMOylation деятельность очищенный K-bZIP показываются на p53, известных целевых сумо. Этот протокол может быть использован не только для выяснения Роман сумо E3 ligases, но и для выявления их специфичности paralog сумо.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

СУМО модификации первоначально была определена как реверсивные столб-поступательные изменения (ПТМ), который регулирует белок стабильности1. В дополнение к прямой спряжение сумо может быть присоединен к белку через non ковалентные взаимодействия по сумо взаимодействия мотивы (SIMs)2. Похож на тирозил-фосфорилирования молекул, укрывательство Src гомологии 2 (Ш2) или phosphotyrosine привязку (ПТБ) доменов3,4, сумо модификации предоставляет дополнительные взаимодействия платформу для селективного набор SIM-содержащих эффекторные белки5,6. Помимо регулирования передачи сигнала SUMOylation транскрипционный анализ факторов и chromatin remodeling молекул служат для модулировать ген выражение7,8. Исследования структуры генома всей SUMOylation показали, что сумо модификация связан с позитивным9,10 или отрицательные10,11,12 транскрипции регулирование, отчасти из-за специфики paralogue SUMOylation.

Существует три основных сумо изоформ белка, спряжение подарок в mammalian клетках; к ним относятся сумо-1 и весьма гомологичных сумо-2 и сумо-3 (упоминаемый как сумо-2/3)13. СУМО обычно спрягаются для остатков лизина (K) в ψKxD/E консенсус мотив в целевого белка. SIM-карты в сумо E3 ligases отвечает за специфики paralogue14. В отличие от ubiquitination путей, содержащих сотни E3 ligases там были лишь несколько сумо E3 ligases определены15. СУМО E3 ligases определяются свойствами, включая их способность (i) связывают Ubc9, (ii) связывают общие сумо через SIM домена и (iii) повышение сумо передачи от Ubc9 на подложке. Лигаза E3 не является абсолютно необходимым для сумо спряжение16, но обеспечивает субстрата и специфичность сумо paralogue. Поскольку обычно только малую часть всего субстрата белка, сумо изменение, обнаружение SUMOylated белков в vivo это всегда вызов. Таким образом точные и воспроизводимые анализы необходимы для того, чтобы выяснить точное предназначение сумо модификации.

В пробирке SUMOylation assay, который оценивает очищенный Ubc9 способность катализировать SUMOylation субстрата белков, является широко признанным assay для изучения сумо модификация17. Однако сумо E3 лигаза деятельность в большинстве случаев не могут быть обнаружены или могут быть обнаружены только с мутировал лигаза сумо с высокой активностью лигаза сумо E3 и низкой субстратная специфичность по стандартному протоколу из-за присутствия обильное количество Ubc918 . Общий успех этот assay в значительной степени зависит от тщательного титрования очищенный Ubc9. В vitro Пробирная SUMOylation описано здесь отличается от стандартного SUMOylation протокола (см. Таблицу материалы). Наблюдение за увеличение глобальной модификации сумо во время возобновления саркома Капоши связанные герпеса (KSHV) побудило нас выявления вирусной лигаза сумо E3, которая может нести ответственность за регулирование вверх SUMOylation. После небольших скрининг взаимодействия белков вирусной сумо E3 лигаза K-bZIP, p53 был признан Роман субстрата. В этом протоколе мы показать в деталях клетках насекомых, шаги, связанные в выражение и очистки одичал тип K-bZIP, вирусный лигаза сумо E3 с сумо-2/3 специфика. Очищенный K-bZIP способность увеличить SUMOylation p53, известный сумо субстрата, оценивается присутствии снижение количества E1 и E2 ферментов. Используя этот измененный SUMOylation assay, исследователи могут надежно определить способности сумо E3 лигаза SUMOylate роман или известных субстратов, который является основным шагом в изучении белков SUMOylation. Кроме того этот метод помогает идентифицировать Роман сумо E3 ligases с низкой лигаза активность, но высокий субстратная специфичность.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка бакуловирусы выражение конструкций

  1. Очищать сумо E3 лигаза K-bZIP путем клонирования cDNA K-bZIP19 в вектор бакуловирусы двойного выражения (см. таблицу материалы) с N-терминальный epitope тегом. Мы имели успех с помощью тега octapeptide (указывается в протоколе как вектор тег K-bZIP).
    Примечание: Шаблон для K-bZIP полимеразной цепной реакции (ПЦР) клонирования ДНК — cDNA обратной транскрипции от РНК, изолированных от клеток TREx F3H3-K-Rta BCBL-1, после лечения доксициклин20.
    1. Передача полнометражного K-bZIP cDNA19 в двойной выражение вектор с СРОя клонирования сайтов. СРО Я дайджест продукт PCR и 1 мкг двойной выражение вектора при 37 ° C, 3 h21.
    2. Отдельные и извлечь переваривается ДНК, после электрофореза геля агарозы 0,8%22. Перевязать вставку (K-bZIP) и векторные T4 ДНК лигаза на 16 ° C в течение 30 мин в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалы).
    3. 5 мкл лигирование ДНК до 50 мкл сведущее Escherichia coli клеток «А» (см. Таблицу материалы) в 1,5 мл. Положите на льду за 30 мин. Затем, инкубировать 1,5 мл в ванну воды 42 ° C для 45 s и немедленно положить трубку на льду на 3 мин.
    4. Добавить 600 мкл S.O.C. среднего (экстракт дрожжей 0,5% (w/v), 2% (w/v) Триптон, 10 мм NaCl, 2,5 мм KCl, 20 мм MgSO4и 4% (w/v) глюкозы) в трубку и инкубировать при 37 ° C в течение 1 ч. Затем центрифуга трубки при комнатной температуре 3 мин на 600 x g.
    5. Удалить супернатант, Ресуспензируйте лепешка с 60 мкл Лурия Бертани среднего (LB; триптон 1% (w/v), 0,5% (w/v) дрожжевой экстракт и 85 мм NaCl) и распространяются на плиты агара LB, содержащий ампициллина 100 мкг/мл. Инкубируйте плита агара при 37 ° C для 16 h23,24.
    6. Выберите 1 колонии для прививок в среде LB 5 мл, содержащие 100 мкг/мл Ампициллин и культуры при 37 ° C для 16 h с 250 rpm встряхивания. Затем извлеките плазмида, вектор тег K-bZIP, с плазмида добыча комплект согласно инструкциям производителя (см. Таблицу материалы).
  2. Создания рекомбинантных bacmid, укрывательство тег K-bZIP путем преобразования вектор тег K-bZIP в сведущее Escherichia coli клетки «B» (см. таблицу материалы).
    1. Смесь 0,2 мкг вектор тег K-bZIP плазмиды и 100 мкл компетентным э. ИСЖ клетки «B» в 1,5 мл трубки и положить на лед на 30 мин инкубировать трубки в ванну воды 42 ° C для 45 s и немедленно положить трубку на льду на 3 мин.
    2. 900 мкл S.O.C. среды в трубку и инкубировать и при 37 ° C для 4 h с вращением на 50 об/мин. Далее принять 10 мкл среды, дополнительные 50 мкл S.O.C среды для распространения на плиты агара LB, содержащие 50 мкг/мл канамицин, гентамицин 7 мкг/мл, 10 мкг/мл тетрациклин, 100 мкг/мл галактозидазы субстрата и 40 мкг/мл изопропиловый β-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ ) и инкубировать пластины для 48 ч при 37 ° C.
    3. Прививать один белый колонии в среде LB 5 мл, содержащие 50 мкг/мл канамицин, гентамицин 7 мкг/мл и 10 мкг/мл тетрациклин. Проинкубируйте при 37 ° C с 250 об/мин, пожимая на 16 h.
    4. Изолировать bacmid рекомбинантных ДНК, укрывательство тег K-bZIP, количественной оценки и вновь приостановить в концентрации 1 мкг/мкл25.
  3. Генерировать рекомбинантных baculoviruses, выражая тег K-bZIP transfecting 1 мкг bacmid рекомбинантных ДНК, содержащие тег K-bZIP в Sf9 клетки в одной скважине 6-ну плиты.
    1. Семенной 2 x 106 Sf9 клетки (см. Таблицу материалы) в среде Насекомое 2 мл Грейс поставляется с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1% гентамицина в каждом хорошо 6 хорошо пластины, а затем Инкубируйте на 27 ° C в течение 1 ч.
    2. Поддерживать культуру фазы журнала Sf9 клеток в среде насекомых Грейс поставляется с 10% FBS, гентамицин 1% и 1% моющего средства C (см. Таблицу материалов) при 27 ° C в орбитальных подвеска на 140 об/мин. Подсчет количества ячеек с помощью Горяева и пятнать Трипановый синий; жизнеспособность клеток должен превышать 95%. Поддержания клеток с использованием subcultivation соотношении 1:3 каждые 2-3 дня (минимальная плотность ~0.5 x 106 клеток/мл).
    3. Добавить 2 мкл bacmid ДНК (1 мкг/мкл) и 98 мкл сокращение сыворотке СМИ (см. Таблицу материалы) в 2-мл пробирку. Затем, добавить 4 мкл Реагента трансфекции (см. Таблицу материалы) для трубки и хорошо перемешать. Инкубации при комнатной температуре в течение 15 мин.
    4. Добавьте эту смесь трансфекции (104 мкл) в каждой скважине и Инкубируйте на 27 ° C в течение 12-16 ч.
    5. Удаление исчерпаны СМИ с нежным стремление и заменить 2 мл свежего Грейс насекомых среды поставляется с FBS и 1% гентамицин 10%. Sf9 клетки свободно придерживаться поверхности плиты и не будет нарушено с нежным стремление.
  4. Собирать рекомбинантных бакуловирусы после transfection и усилить бакуловирусы для получения высокого титра запасов (P1) для дальнейших экспериментов.
    1. 72 ч после изменения среднего, скрип Sf9 ячеек с помощью стерильных ячейки стеклоподъёмника, собирать супернатант от каждой индивидуальной скважины в 1,5 мл трубки и вихревые для 10 s.
    2. Центрифуга на 4 ° C на 3 мин в 150 x g. сбор супернатанта как бакуловирусы P0 и Алиготе в 1,5 мл пробирок (1 мл бакуловирусы в каждой тюбике). Хранить при температуре-80 ° C.
    3. 7 Sf9 клетки семян 1 x 10 в 10 мл Грейс среднего насекомого поставляется с 10% FBS и 1% гентамицина в 10 см Петри и Инкубируйте на 27 ° C в течение 1 ч.
    4. Для усиления рекомбинантных baculoviruses выражая тег K-bZIP добавить 0,5 мл P0 бакуловирусы в сеяный клетки Sf9 и Инкубируйте на 27 ° C в течение 48 часов.
    5. Соберите супернатанта как P1 бакуловирусы в 15 мл трубки и хранить при 4 ° C до 1 месяца.

2. Очистка K-bZIP

  1. Поддерживать культуру фазы журнала Sf9 клеток в среде насекомых Грейс поставляется с 10% FBS, гентамицин 1% и 1% моющего средства C 27 ° C в орбитальных подвеска на 140 об/мин, как описано в шаге 1.3.2.
  2. В день трансдукции добавьте 1 mL бакуловирусы содержащих супернатант (P1) в 250 мл с плотностью 2 х 106 клеток/мл Sf9 клеток.
  3. Инкубировать Sf9 клетки за 72 ч при 27 ° C на орбитальный шейкер с 140 rpm тряски, а затем собрать центрифугированием в 2740 x g 15 мин при 4 ° C.
  4. Удалить супернатант и лизировать клетки окатышей в 10 мл буфера lysis (20 мм HEPES рН 7.9, 0.5 М NaCl, 1% моющего средства (см. Таблицу материалы), 2% глицерина, ингибитор протеазы коктейль) и поворот на 50 об/мин, с использованием подвеска смеситель на 4 ° C на 30 мин.
  5. Центрифуга ячейка lysate на 15000 x g 15 мин для сбора супернатант.
  6. Для того чтобы очистить тег K-bZIP, Проинкубируйте lysates клетки (10 мл) с 50 мкл антител тегами магнитные бусы в 14 мл полипропиленовые трубы и повернуть на 50 об/мин за 3 ч при 4 ° C, с помощью миксера подвеска. После захвата белка, Пелле бусы на 800 x g центрифуги для 30 s при 4 ° C. Удалить большую часть супернатанта, вновь приостановить бисер остаточного объема около 1 мл и передать 1,5 мл трубки для стирки.
  7. Вымойте захваченных белка, поместив трубка, содержащая бусы на магнитную подставку и удалить супернатант после магнитной бусины полностью присоединились к стороне трубки.
  8. Вымойте бусины с буфера lysis четыре раза.
    1. Добавьте 1 mL литического буфера в 1,5 мл пробирок и инвертировать трубы 10 раз. Место 1,5 мл на магнитную подставку и удалить супернатант, как описано в 2.7.
    2. Повторите предыдущий шаг, еще 3 раза.
  9. Один раз мыть бусины с-фосфатный буфер (PBS).
    1. Добавьте 1 mL PBS (137 мм NaCl, 2,7 мм KCl, 8 Na2HPO4, 1,5 мм KH2PO4) в 1,5 мл пробирок и инвертировать трубы 10 раз.
    2. 1,5 мл трубки надевают магнитного стенд и затем удалить супернатант.
  10. Элюировать тег K-bZIP белка от антител тегами магнитные бусы, добавив 100 мкл 150 мкг/мл octapeptide, разбавленных в PBS в 1,5 мл трубку. Поверните трубки для 10 мин на 50 об/мин, подвеска смеситель при комнатной температуре. Затем положите трубку на магнитного стенд и собирать K-bZIP содержащих супернатант в чистой 1,5 мл.
  11. Анализ 1-5 мкл очищенного тег K-bZIP белка, SDS-PAGE следуют Кумасси синим пятнать26. Загрузка 2 мкг, 1 мкг, и 0,5 мкг образцы бычьим сывороточным альбумином (БСА) на том же гель и использовать его для количественной оценки с помощью программы обработки изображений, как ImageJ. Для сравнения оценки K-bZIP концентрации BSA стандартам.
  12. Очищенный K-bZIP теперь готов для использования в каждом SUMOylation assay. Разбавляют K-bZIP в PBS до конечной концентрации 100 нг/мкл и хранить в небольших аликвоты-80 ° c.

3. SUMOylation Assay

  1. Мкл 3 100 нг/мкл очищенная тегом K-bZIP в мастер смесь каждого в пробирке SUMOylation реакции. Компоненты в мастер смеси содержат 1 мкл буфера белка, 1 x SUMOylation буфера, белок p53 0.5 мкл (0.5 мг/мл), 25 Нм E1 активации фермента (фондовых высококонцентрированные: 1 мкм), 50 Нм E2 спрягать фермента (фондовых высококонцентрированные: 10 мкм) и 250 Нм сумо пептидов (сумо-1 , Сумо-2, или сумо-3; запасов высококонцентрированные: 5 мкм) на окончательный объем 17 мкл.
  2. Осторожно перемешать содержимое и инкубировать реакции при 30 ° C на 3 ч. прекратить реакции, добавив 20 мкл 2 x SDS-PAGE загрузки буфера (100 мм трис-HCL pH 6.8, лаурилсульфат натрия 4%, 0,2% (w/v) бромфеноловый синий, 20% (v/v) глицерина и β-меркаптоэтанол 200 мм) и Денатурируйте образцы на 95 ° C за 5 мин.
  3. Отдельные образцы на SDS-PAGE, передача разлученных белков на PVDF мембрану с помощью аппарата полусухим методом электрофореза передачи и анализировать, Западная помарка, с использованием антител анти p53.
    1. Настроить аппарат гель как шаг 2.11 и загрузить 20 мкл пример в гель скважин.
    2. Побегите гель 10% в постоянного тока на 80 V около 120 мин (до тех пор, пока краска группы достигает нижней части геля). После окончания электрофореза Выключите источник питания.
    3. Отключите аппарат гель и гель кассеты вывезти гель и плавать гель в полусухом передачи буфера (48 мм трис-HCl, 39 мм глицин, 20% метанола) за 5 мин.
    4. Возьмите другой контейнер и замочить PVDF мембрану в метаноле за 1 мин. Затем возьмите PVDF из метанола и помещаются в буфер передачи полусухое. Аккуратно агитируйте мембрана для 5 мин.
    5. Удалите крышку безопасности полусухое электрофоретической аппарата.
    6. Предварительно мокрый фильтр бумага и подготовить бутерброд гель на аноде дно платины следующим: фильтровальная бумага, PVDF мембраны, гель и фильтровальную бумагу.
    7. Безопасный катод пластины и безопасность Обложка, затем бежать пятно на 15 V постоянного тока для 90 минут повернуть источник питания, отключите аппарат полусухое и вывезти PVDF мембрану.
    8. Блок PVDF мембрану с блокирующий буфер (5% обезжиренное молоко в TBST буфер (137 мм2NaCl, 20 трис-HCl, 0.1% моющего средства B (см. Таблицу материалы), рН 7,6)) при комнатной температуре за 1 час с 30 об/мин, тряски, орбитальный шейкер.
    9. Гибридизируйте PVDF мембрану с анти p53 антитела разбавленной (1:1, 000) в блокирующем буфере для 12-16 ч при температуре 4 ° C встряхивании 30 об/мин с помощью миксера подвеска.
    10. Взять из PVDF мембрану в контейнер и поставьте TBST. Промойте PVDF мембрану с TBST вдвое больше.
    11. Замочите PVDF мембрану в TBST 30 мин с 45 rpm, тряски, орбитальный шейкер.
    12. Гибридизируйте PVDF мембрану с анти кролик антитело проспряганное с пероксидазы (ПХ) разбавляют (1:4, 000) в блокирующем буфере 1 ч при комнатной температуре с 30 об/мин, тряски, используя миксер подвеска.
    13. Вымойте PVDF мембрану с TBST 3 раза, как описано в шаге 3.4.10.
    14. Замочите PVDF мембрану в TBST 30 мин встряхивании 45 об/мин с помощью миксера подвеска. Удаление TBST и добавьте PBS для сохранения PVDF мембрану при 4 ° C до 12 ч.
    15. Перемешайте реагент расширенной Хемилюминесцентный субстрат (ECL субстрата) 1 и 2 (1:1) (см. Таблицу материалы). Удаление PVDF мембрану из PBS, кратко пятно с бумажным полотенцем или легких стеклоочистителя поглощать избыточную влагу, и сразу же добавить 400 мкл Реагента ECL на поверхности каждого мембраны для 3-5 мин удалить избыток ECL реагента, кратко промокательной, но не позволяют м embrane для полностью сухой.
    16. Разоблачить пятно с помощью люминесценции съемочной системы или авторадиографии фильм27.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Согласно информации, представленной изготовителем, стандартное количество E1 и E2 фермента в SUMOylation assay-50 Нм до 500 Нм, соответственно. Минимальное количество E2 спрягать фермента Ubc9, которая способна SUMOylate p53 был сначала определяется в пробирке SUMOylation assay. Как низко как одной пятой от объема Ubc9, используемых в стандартных в пробирке SUMOylation протокол assay смогла эффективно SUMOylate p53 (рис. 1A)...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В пробирке SUMOylation протокол, описанный здесь обычно используется для установления статуса SUMOylation выявленных Ubc9 субстратов. Основные ограничения, используя стандартный протокол для изучения SUMOylation функция сумо E3 лигаза является обилие активации сумо E1 и E2 спрягать ферментов Ubc9, которые максимально спряжение сумо в в vitro системах. Учитывая эту задачу мы считаем что титрование количество сумо E1 и E2 ферментов до уровня, что один едва можно обнаружить, что их деятельность в SUMOylati...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы раскрывают не потенциальные конфликты интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана от грантов от министерства науки и технологии (большинство, 105-2320-B-010-007-MY3 КЦП), национального института здравоохранения исследований (НПУ-EX105-10215BC КЦП), министерства науки и технологии (наиболее 105-2314-Б-400-019 для ХИК) и от национального института медицинских исследований (НПЗУ мг-105-SP-10, НПЗУ мг-106-SP-10-ХИК.). Эта работа была также поддерживается частично с национальным университетом Yang Ming на публикации рукописи КЦП. Спонсоры имел никакой роли в дизайн исследования, сбор данных и анализ, решение опубликовать или возмещение рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
pFastBacInvitrogen10359-016вектор бакуловируса двойной экспрессии
вектор pCR2.1-TOPO векторInvitrogenPCR
компетентная клетка  E. coli DH5αYeastern BiotechFYE678-80VLкомпетентные E. coli клетки A
E. coli DH10BacInvitrogen10359-016компетентные E. coli клетки B
FugeneHDRoche04709705001реагент для трансфекции
Opti-MEMGibco31985062уменьшенный уровень сыворотки
T4 LigaseNEW England BioLabsM0202S
CPOI (RsrII)Thermo ScientificER0741
Bluo-galThermo ScientificB1690галактозидазный субстрат
IPTGSigma-AldrichI6758-1G
Grace' s Среда для насекомыхGibco11605094
фетальная сыворотка крупного рогатого скотаGibco10082147
гентамицинThermo Fisher15750060
ампициллинSigma-AldrichA9393-25G
КанамицинSigma-AldrichK0254-20ML
гентамицинGibco15710-064
тетрациклинSigma-Aldrich87128-25G
LB BrothMerk1.10285.0500
HEPESSigma-AldrichH4034-100G
NaClSigma-AldrichS9888-5KG
KClMerk1.04936.1000
Na2HPO4Sigma-AldrichS5136-500G
KH2PO4J.T.Baker3246-01
додецилсульфат натрияMerk1.13760.1000
β-меркаптоэтанолBio-Rad161-0710
TRIS (основание)J.T.Baker4109-06
Обезжиренное молокоFonterra
глицеринJ.T.Baker2136-01
Triton X-100Amresco0694-1Lмоющее средство A
Tween 20Amresco0777-500MLмоющее средство B
Poloxamer 188 растворSigma-AldrichP5556-100MLмоющее средство C
Ингибитор протеазы КоктейльRoche04 693 132 001
3x Флаг пептидSigmaF4799
anti-FLAG m2 Магнитные бусиныSigma-AldrichM8823Магнитные бусины с антителами
SUMOlink SUMO-1 KitActive Motif40120стандартный протокол SUMOylation 
SUMOlink SUMO-2/3 KitActive Motif40220стандартный протокол SUMOylation 
QIAquick Набор для экстракции гелемQIAGEN28704
Мини-набор для плазмид QIAGEN12123Набор для экстракции плазмид
Полипропиленовые трубкиFalcon352059
чашка ПетриFalcon351029
Клеточный подъемникCorningCNG3008
Наконечник для загрузкиSorenson BioScience28480
PVDFPerkinElmerNEF1002
Промокательная фильтровальная бумагаBio-Rad1703932
Mini slab гелевый аппарат (Bio-Rad Mini Protean II Cell)Bio-Rad1658001 EDU
Trans-Blot SD Полусухая электрофоретическая передаточная ячейкаBio-Rad1703940
Pierce ECL Western BlottingThermo32106ECL реагентный
смеситель суспензииDigisystem laboratory instruments  Inc.SM-3000
Kansin instruments Co.OS701
ImageQuant LAS 4000
биомолекулярный имиджер		GE Healthcare28955810
Sf9Thermo ScientificB82501
антитело против p53Cell Signaling#9282
антитело против кроликаGE HealthcareNA934-1ML
продукта Орбитальный вибростенд

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bies, J., Markus, J., Wolff, L. Covalent attachment of the SUMO-1 protein to the negative regulatory domain of the c-Myb transcription factor modifies its stability and transactivation capacity. J Biol Chem. 277 (11), 8999-9009 (2002).
  2. Lin, D. Y., et al. Role of SUMO-interacting motif in Daxx SUMO modification, subnuclear localization, and repression of sumoylated transcription factors. Mol Cell. 24 (3), 341-354 (2006).
  3. Welsh, M., Jamalpour, M., Zang, G., Akerblom, B. The role of the Src Homology-2 domain containing protein B (SHB) in beta cells. J Mol Endocrinol. 56 (1), 21-31 (2016).
  4. Huang, W. Q., et al. Structure, function, and pathogenesis of SHP2 in developmental disorders and tumorigenesis. Curr Cancer Drug Targets. 14 (6), 567-588 (2014).
  5. Perry, J. J., Tainer, J. A., Boddy, M. N. A SIM-ultaneous role for SUMO and ubiquitin. Trends Biochem Sci. 33 (5), 201-208 (2008).
  6. Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins. EMBO J. 26 (18), 4102-4112 (2007).
  7. Ouyang, J., Shi, Y., Valin, A., Xuan, Y., Gill, G. Direct binding of CoREST1 to SUMO-2/3 contributes to gene-specific repression by the LSD1/CoREST1/HDAC complex. Mol Cell. 34 (2), 145-154 (2009).
  8. Lyst, M. J., Stancheva, I. A role for SUMO modification in transcriptional repression and activation. Biochem Soc Trans. 35, Pt 6 1389-1392 (2007).
  9. Liu, H. W., et al. Chromatin modification by SUMO-1 stimulates the promoters of translation machinery genes. Nucleic Acids Res. 40 (20), 10172-10186 (2012).
  10. Rosonina, E., Duncan, S. M., Manley, J. L. SUMO functions in constitutive transcription and during activation of inducible genes in yeast. Genes Dev. 24 (12), 1242-1252 (2010).
  11. Chang, P. C., et al. The chromatin modification by SUMO-2/3 but not SUMO-1 prevents the epigenetic activation of key immune-related genes during Kaposi's sarcoma associated herpesvirus reactivation. BMC Genomics. 14, 824(2013).
  12. Neyret-Kahn, H., et al. Sumoylation at chromatin governs coordinated repression of a transcriptional program essential for cell growth and proliferation. Genome Res. 23 (10), 1563-1579 (2013).
  13. Tatham, M. H., et al. Polymeric chains of SUMO-2 and SUMO-3 are conjugated to protein substrates by SAE1/SAE2 and Ubc9. J Biol Chem. 276 (38), 35368-35374 (2001).
  14. Mattoscio, D., Segre, C. V., Chiocca, S. Viral manipulation of cellular protein conjugation pathways: The SUMO lesson. World J Virol. 2 (2), 79-90 (2013).
  15. Gareau, J. R., Lima, C. D. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).
  16. Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1. Cell. 108 (3), 345-356 (2002).
  17. Knipscheer, P., et al. Ubc9 sumoylation regulates SUMO target discrimination. Mol Cell. 31 (3), 371-382 (2008).
  18. Vethantham, V., Manley, J. L. In vitro sumoylation of recombinant proteins and subsequent purification for use in enzymatic assays. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (1), 5121(2009).
  19. Lin, S. F., Robinson, D. R., Miller, G., Kung, H. J. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus encodes a bZIP protein with homology to BZLF1 of Epstein-Barr virus. J Virol. 73 (3), 1909-1917 (1999).
  20. Yang, W. S., Hsu, H. W., Campbell, M., Cheng, C. Y., Chang, P. C. K-bZIP Mediated SUMO-2/3 Specific Modification on the KSHV Genome Negatively Regulates Lytic Gene Expression and Viral Reactivation. PLoS Pathog. 11 (7), 1005051(2015).
  21. Connor, C. D., Metcalf, E., Wrighton, C. J., Harris, T. J., Saunders, J. R. RsrII--a novel restriction endonuclease with a heptanucleotide recognition site. Nucleic Acids Res. 12 (17), 6701-6708 (1984).
  22. Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of endonuclease R-EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis. J Virol. 14 (5), 1235-1244 (1974).
  23. Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
  24. Gingold, E. B. Bacterial transformation. Methods Mol Biol. 2, 237-240 (1985).
  25. Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
  26. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  27. Ahmed, S., Holt, M., Riedel, D., Jahn, R. Small-scale isolation of synaptic vesicles from mammalian brain. Nat Protoc. 8 (5), 998-1009 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in vitroK bZIPSUMO p53Ubc9SDS PAGE

Похожие статьи