Method Article

Нейронной сети идентификация развивающих компетентным или некомпетентных мыши взрослой яйцеклеток

DOI:

10.3791/56668

⸱

March 3rd, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratorio di Biologia dello Sviluppo, Dipartimento di Biologia e Biotecnologie "Lazzaro Spallanzani", University of Pavia, 2Institute of Biotechnology, University of Helsinki, 3Department of Reproductive Medicine, University of California San Diego, 4Dipartimento di Ingegneria Industriale e dell'Informazione, University of Pavia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол для неинвазивной оценки развития компетенции ооцитов осуществляется во время их в vitro созревания от Жерминаль везикул на стадии метафазы II. Этот метод сочетает в себе покадровой изображений с Велосиметрия изображение частиц (PIV) и нейросетевого анализа.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Бесплодие клиники выиграют от возможность выбора развивающих компетентным против некомпетентных яйцеклеток с помощью неинвазивных процедур, тем самым повышая общий исход беременности. Мы недавно разработали классификацию метод, основанный на микроскопические прямом наблюдений ооцитов мыши во время их в vitro созревания из везикул Жерминаль (GV) до метафазы II стадии, затем анализ движения цитоплазмы происходящие в этот промежуток времени период. Здесь мы представляем подробные протоколы этой процедуры. Ооциты изолированы от взрослой полостная фолликулов и культивировали для 15 h внутри микроскопом, оборудованных для покадровой анализа при 37 ° C и 5% CO2. Снимки делаются в интервалах 8 мин. Изображения, анализируются с помощью метода Велосиметрия изображение частиц (PIV), который вычисляет для каждой ооцитов, профиль цитоплазматических скоростей движения (мезошкала), происходящие на протяжении всего периода культуры. Наконец мезошкала каждого одной яйцеклетки подаются через инструмент математических классификации (Feed вперед искусственные нейронные сети, ФЭНН), который предсказывает вероятность гамет развивающих компетентным или некомпетентных с точностью 91.03%. Этот протокол, для мыши, теперь может быть проверена на ооциты других видов, включая человека.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Женское бесплодие является патологией, которая затрагивает все большее число женщин. По данным Всемирной организации здравоохранения около 20% супружеских пар являются бесплодными, с 40% за счет женского бесплодия. Кроме того, одна треть женщин, проходящих лечение рака (300 000 в год и 30 000 человек в год в США или Италии, соответственно) разработать преждевременное угасание функции яичников.

Стратегия по предотвращению бесплодия у больных раком является изоляции и криоконсервацию фолликулы до лечения онкологических заболеваний, следуют в vitro созревания (IVM) GV яйцеклеток до стадии MII (GV-MII переход). Наличие Неинвазивные маркеры ооцитов развития компетенции позволит улучшить оплодотворение и процессов развития и общей беременность успех1,2.

На основе конфигурации их хроматина, наблюдается после окрашивания с supravital флюрохром Hoechst 33342, млекопитающих взрослой ооциты классифицируются либо как окружили ядрышко (SN) или не окружили ядрышко (NSN)3. Помимо их организации различных хроматина эти два типа ооциты отображения многих Морфологические и функциональные различия3,4,5,6,7,8 ,9, включая их meiotic и развития компетенции. Когда изолированный от яичника и созрела в пробирке, оба типа ооциты достигают стадии MII и после осеменения спермы, разработки к стадии 2-клеток, но только те, с Организацией хроматина SN может развиться в срок9. Хотя хорошо, как метод классификации для выбора компетентного против некомпетентных ооцитов, главным недостатком является мутагенным эффект, который флюрохром, сам и, прежде всего, УФ света, используемого для его обнаружения может иметь на клетки.

По всем этим причинам мы искали другие Неинвазивные маркеры, связанные с SN или NSN хроматина конформации, что может заменить использование Hoechst при сохранении высокой классификации точности. Промежуток времени наблюдения цитоплазматических скоростей движения (мезошкала) функция становится отличительной ячейки статуса. Например недавние исследования показали, что связь между мезошкала записан в момент оплодотворения и способность мыши и человека зигот полный предимплантационной и развития доношенных10,11.

Основываясь на этих более ранних исследований, мы опишем здесь платформу для признания развивающих компетентным или некомпетентных мыши взрослой ооциты5,6,,78. Платформа базируется на трех основных шагов: 1) ооцитов, изолированных от полостная фолликулов сначала классифицируются на основе их хроматина конфигурации либо как окружении ядрышко (SN) или не окружении ядрышко (NSN); 2) промежуток времени изображения мезошкала, происходящих во время GV-MII перехода каждого одной яйцеклетки берутся и проанализированы с частиц изображения Велосиметрия (PIV); и 3) данные, полученные с PIV анализируются с канал вперед искусственной нейронной сети (FANN) для слепых классификации12,13. Мы предоставляем подробную информацию о наиболее важных этапов процедуры, предназначенные для мыши, чтобы сделать его готовы для быть протестированы и использованы для других видов млекопитающих (например, говядину, обезьян и людей).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры с участием животных были утверждены институциональный уход животных и использования и этические комитетам в университете Павии. Животные были сохранены в условиях 22 ° C, влажность воздуха 60% и свет/темно цикл 12:12 ч.

1. яичник изоляции

  1. Придать внутрибрюшинно 2 четырех до одиннадцати недельных CD1 самок мышей с 10 U фолликулостимулирующего гормона с шприц 1 мл стерильного раствора инсулина.
  2. Подождите, 46-48 ч.
  3. Весят мыши и анестезировать с внутримышечной инъекции 50 мг/кг Zoletil (Tiletamina и Zolazepan cloridrate). Усыпить шейки матки дислокации.
  4. Возьмите кожи, охватывающих брюшной стенки с помощью пары рассечение щипцов. Вырезать кожу и тело стены с ножницами и тянуть разрез с щипцами.
  5. Используя пинцет, переместите кишки сторону, выявить маточные рожки и локализовать яичников на их конечности.
  6. Аккуратно провести яичника, используя пинцет часовщик и используйте ножницы, чтобы вырезать его связки матки. Повторите с другой яичник.
  7. Перенесите собранные яичников в 35-мм ячейку культуры Петри содержащие 1 мл м2 изоляции среды предварительно нагревают при 37 ° C, 5% CO2 в воздухе.
  8. Удалите жир и маточных труб, с помощью тонкой ножницы под стереомикроскопом.

2. изоляция Cumulus ооцитов комплексов

  1. Пункции яичников поверхности с помощью стерильных пинцетов и иглы стерильные инсулина 1G пока пассивно выпускаются полостная кучевые ооцитов комплексы (КОК).
  2. Собирать Кок с более чем тремя слоями клеток кучевые, используя контролируемые рот вытащил руку Пастер микропипеткой (200 мкм в диаметре) и перенести их в 300 мкл капли свежего м2 средний.
  3. Удалите кучевые клеток, окружающих ооцитов, используя руку потянул микропипеткой Пастера (80 мкм в диаметре), осторожно закупорить и выходить за несколько секунд,
  4. Неоднократно передачи ооциты от 20 мкл капли среднего м2 на другой, пока кучевые клетки полностью устранены.

3. chromatin классификация на основе Организации ооцитов

  1. Подготовьте Hoechst 33342 окрашивание раствора в конечной концентрации 0,05 мкг/мл в м2 средний начиная с маточный раствор 5 мг/мл разбавленной в однократном ПБС.
  2. 3.5 место мкл микро каплями Hoechst, окрашивание раствора в нижней части крышки Петри 35 мм.
  3. Перевести каждый одной яйцеклетки в Hoechst, окрашивание падение, поместите блюдо на тарелку Отопление подогретым (37 ° C) и накрыть темной крышкой, чтобы избежать света экспозиции.
  4. После 10 минут инкубации при комнатной температуре наблюдать яйцеклеток с флуоресцентным микроскопом при 10-кратном под УФ света (330-385 Нм), не более 1-2 секунд.
  5. Ооциты можно отнести окружении ядрышко (SN) (рис. 1а), если они представляют кольцо Хехст положительных хроматина, окружающих ядрышка.
  6. Ооциты можно отнести не окружены ядрышко (NSN), если их ядрышко не окружен Хехст позитивных хроматина и показывает разогнать гетерохроматиновые пятна в ядре (рис. 1B).

4. нейронные сети ооцитов классификации

  1. Подготовить четыре 2 мкл капельки α-MEM среды дополнены с 5% тепло инактивированная плода бычьим сывороточным, 2 мм L-глютамином, таурином 5 мм, 100 ед/мл пенициллин, 75 мкг/мл стрептомицина и пируват натрия 23,5 мкг/мкл в 35-мм стекла дно Петри и покрыть их с подогретым (37 ° C) и предварительно уравновешенной минерального масла, чтобы избежать средних испарения.
    Примечание: При использовании живой клетки скрининг системы, держите капли на определенном расстоянии, используя сетку Рисованные 7 мм × 7 мм в качестве ориентира.
  2. Ооциты передачи 3 - 4 для каждой капли.
  3. Поместите дно стекла Петри в живой клетки скрининг системы, оборудованные с покадровой записи программного обеспечения (см. Таблицу материалы), которая позволяет наблюдать созревание яйцеклетки в среде с стабильная температура (37 ° C) и CO2 концентрация (5%).
  4. Откройте покадровой записи программного обеспечения. На экране появляется окно с живой выстрел из яйцеклетки на левой стороне и все настройки кнопки на правой стороне.
  5. Выберите центр яйцеклетки для его размещения в центре экрана. При необходимости отрегулируйте фокус.
  6. Выберите кнопку Ph и задайте Диаметр лампа 192; время экспозиции для 1/125 s; получить до 1.99; и резолюцию 1600 x1200.
  7. Выберите FL2 и задайте Диаметр лампа 5; время экспозиции 3 s; получить до 2.37; и резолюцию 1600 x1200.
  8. Выберите кнопку Новая точка для того чтобы записать ооцитов позицию внутри падение культуры. Повторите такое же обычное дело для каждого яйцеклетки в падение культуры.
  9. Выберите время и установите приобретение цикла Общее время до 15 ч.и 8 мин .
  10. Выберите начать промежуток времени для запуска цикла записи.
  11. Откройте программное обеспечение MATLAB и писать >>cell_piv; и выберите Инструмент PIV.
  12. Выберите папку, содержащую записанный фильм и выберите любой из файлов .jpeg для загрузки последовательности всей изображений. Для каждого ооцитов выберите регион интерес (ROI), нажав кнопку, выберите инструмент «область».
  13. В меню Файл выберите Процесс PIV . Выберите кнопку панели Инструментов просмотра .
    Примечание: Программа будет вычислить векторов скорости в пределах ROI и автоматически создает файл данных, сохраненный как файл .mat.
  14. Выберите файл .mat, чтобы открыть. Выберите кнопку ROI, выберите инструмент и нарисуйте круг вокруг наброски ооцитов. Нажмите кнопку Сохранить в меню файл.
    Примечание: Теперь отображаются векторов в этом регионе и звёздной данных в окне Диаграмма обновляется для этой новой ROI.
  15. Открытой собранных звёздной весь промежуток времени кадров записаны данные в электронную таблицу, с, в строках, последовательность кадров и на столбцы, каждая одной яйцеклетки проанализированы.
  16. Организуйте данные NSN и SN яйцеклеток на 10 подгруппы.
  17. Используйте 9 подгрупп итеративно обучить корма вперед искусственных нейронных сетей (FANN) и 1 подгруппа для слепого тестирования.
    1. Повторить еще 9 раз, изменяя слепого тестирования образца (десятикратного перекрестной проверки).
  18. Откройте MATLAB, запустить заказные сценарий основных и, по запросу, вставьте имя файла с обучающих данных (train.txt), количество NSN и SN ооцитов, используемых для подготовки и промежуток времени интервала для анализа (как правило, от кадр # 1-2 кадр # 112-113).
  19. Нажмите Ввод для выполнения подготовки.
  20. Вставьте имя файла с проверочными данными (test.txt).
  21. Откройте вектор test_outputs_cyt в пространстве МАТЛАБА.
    Примечание: Окно появляется на экране показаны в первой строке, вероятность получить истинное срабатываний (ТП или True NSN) и ложных срабатываний (FP или ложных NSN) для NSN и SN ооцитов, соответственно; Вместо этого во втором ряду, вероятность получения ложных негативы (FN или ложных SN) и истинный негативы (TN или True SN) для NSN и SN ооцитов, соответственно.
  22. По формуле: (TP+TN)/(TP+FP+FN+TN), для вычисления ФЭНН точность, выраженное в процентах.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рисунок 2 показывает представитель развивающих компетентным и некомпетентных ооцитов, соответственно в начале (GV) и в конце (MII) процедуры КБПБ. IVM взрослой мыши яйцеклеток происходит во время 15 h культуры. Промежуток времени наблюдения записывает прогрессирование мейоз и обнаруживает крупных meiotic мероприятий, включая GVBD и экструзии первого полярного тельца.

Анализ и сравнение более чем две...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Существует несколько важных шагов, которые одно должно заботиться о при выполнении настоящего Протокола с ооцитов мыши, а также с представителями других видов. После изолированы от их фолликулов, ооциты должны быть немедленно переданы в записи капли, как разъединение от компаньон кучевые клетки триггеры начало перехода GV-MII. Возможные изменения к настоящему Протоколу может быть добавлением 3-изобутил-1-метилксантина (IBMX) средний м2, используется для изоляции Кок. IBMX предотвращает немедленного запуска GV-MII переход...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа стала возможной благодаря для поддержки: Университет Павии ФРГ 2016; Пармский университет филь 2014, 2016; и движение за предоставление пластик, необходимые для проведения этого исследования. Мы благодарим д-р Шейн Виндзор (инженерный факультет, Бристольский университет, Великобритания) за предоставление программного обеспечения Cell_PIV.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
FolligonIntervetA201A02гормональное лечение
Hoechst 33342 Sigma-AldrichB2261Для окрашивания ооцитов гетерохроматином
Клеточная культура чашки Петри 35 мм х 10 мм;Corning 430165Для выделения КОК
EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, с фенолом краснымMerck-MilliporeMR-015-DДля выделения КОК
MEM Alpha medium (1X) + Glutamax Sigma-AldrichM4526Для созревания ооцитов in vitro
Клеточная культура Петри-чашка 35 мм стеклянное дно WillCo GWSt-3522Для экспериментов по визуализации
BioStation IM-LM Системаскрининга живых клеток Nikon MFA91001 
Пастеровская пипеткаDelchimica Scientific Glassware6709230Для манипуляций с фолликулами
Минеральное маслоSigma-AldrichM8410Для предотвращения загрязнения и испарения среды
Пенициллин/СтрептомицинLife Technologies15070063Для предотвращения загрязнения среды 
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Sigma-AldrichML16141079Для макияжа α MEM medium 
L-глютамин Life Technologies25030Для макияжа α MEM medium 
ТауринSigma-AldrichT0625Для макияжа α MEM medium 
Бычья сыворотка альбумин (BSA)Sigma-AldrichA3310Для макияжа α MEM медиа
Пируват натрия Сигма-Олдрич  P4562Для макияжа α MEM media
Zoletil (Tiletamina и Zolazepan cloridrate)Virbac SrlQN01AX9Для мышей анестезия
Cell_PIV sofware Любезно предоставлено доктором Шейном Виндзором, Бристольский университет, Великобритания                             -                             -
MATLABМатематический труд, Натик, Массачусетс;                             -Для мультипарадигмальных численных вычислений

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. Molecular methods for selection of the ideal oocyte. Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).
  2. Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature. Human. Reprod. Update. 17 (1), 34-35 (2011).
  3. Tan, J. H., et al. Chromatin configurations in the germinal vesicle of mammalian oocytes. Mol. Hum. Reprod. 15 (1), 1-9 (2009).
  4. Vigone, G., et al. Transcriptome based identification of mouse cumulus cell markers that predict the developmental competence of their enclosed antral oocytes. BMC Genomics. 14, 380(2013).
  5. Bui, T. T., et al. Cytoplasmic movement profiles of mouse surrounding nucleolus and not-surrounding nucleolus antral oocytes during meiotic resumption. Mol. Reprod. Dev. 84 (5), 356-362 (2017).
  6. Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organization during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (4), 479-485 (1995).
  7. Zuccotti, M., Garagna, S., Merico, V., Monti, M., Redi, C. A. Chromatin organisation and nuclear architecture in growing mouse oocytes. Mol. Cell. Endocrinol. 234 (1-2), 11-17 (2005).
  8. Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg? Hum. Reprod. Update. 17 (4), 525-540 (2011).
  9. Inoue, A., Nakajima, R., Nagata, M., Aoki, F. Contribution of the oocyte nucleus and cytoplasm to the determination of meiotic and developmental competence in mice. Hum. Reprod. 23 (6), 1377-1384 (2008).
  10. Ajduk, A., et al. Rhythmic actomyosin-driven contractions induced by sperm entry predict mammalian embryo viability. Nat. Commun. 2, 417(2011).
  11. Swann, K., et al. Phospholipase C-ζ-induced Ca2+ oscillations cause coincident cytoplasmic movements in human oocytes that failed to fertilize after intracytoplasmic sperm injection. Fertil. Steril. 97 (3), 742-747 (2012).
  12. Thakur, A., Mishra, V., Jain, S. K. Feed forward artificial neural network: tool for early detection of ovarian cancer. Sci. Pharm. 79 (3), 493-505 (2011).
  13. Laudani, A., Lozito, G. M., Riganti Fulginei, F., Salvini, A. On Training Efficiency and Computational Costs of a Feed Forward Neural Network: A Review. Comput. Intell. Neurosci. 2015, 818243(2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mouse OocytesCytoplasmic Movement VelocitiesTime Lapse ImagingParticle Image VelocimetryFeed Forward Neural NetworkGerminal VesicleMetaphase IIOocyte IsolationHoechst StainingDevelopmental Competence

Related Articles