Method Article

Нейронной сети идентификация развивающих компетентным или некомпетентных мыши взрослой яйцеклеток

DOI:

10.3791/56668

⸱

March 3rd, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratorio di Biologia dello Sviluppo, Dipartimento di Biologia e Biotecnologie "Lazzaro Spallanzani", University of Pavia, 2Institute of Biotechnology, University of Helsinki, 3Department of Reproductive Medicine, University of California San Diego, 4Dipartimento di Ingegneria Industriale e dell'Informazione, University of Pavia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол для неинвазивной оценки развития компетенции ооцитов осуществляется во время их в vitro созревания от Жерминаль везикул на стадии метафазы II. Этот метод сочетает в себе покадровой изображений с Велосиметрия изображение частиц (PIV) и нейросетевого анализа.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Бесплодие клиники выиграют от возможность выбора развивающих компетентным против некомпетентных яйцеклеток с помощью неинвазивных процедур, тем самым повышая общий исход беременности. Мы недавно разработали классификацию метод, основанный на микроскопические прямом наблюдений ооцитов мыши во время их в vitro созревания из везикул Жерминаль (GV) до метафазы II стадии, затем анализ движения цитоплазмы происходящие в этот промежуток времени период. Здесь мы представляем подробные протоколы этой процедуры. Ооциты изолированы от взрослой полостная фолликулов и культивировали для 15 h внутри микроскопом, оборудованных для покадровой анализа при 37 ° C и 5% CO2. Снимки делаются в интервалах 8 мин. Изображения, анализируются с помощью метода Велосиметрия изображение частиц (PIV), который вычисляет для каждой ооцитов, профиль цитоплазматических скоростей движения (мезошкала), происходящие на протяжении всего периода культуры. Наконец мезошкала каждого одной яйцеклетки подаются через инструмент математических классификации (Feed вперед искусственные нейронные сети, ФЭНН), который предсказывает вероятность гамет развивающих компетентным или некомпетентных с точностью 91.03%. Этот протокол, для мыши, теперь может быть проверена на ооциты других видов, включая человека.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Женское бесплодие является патологией, которая затрагивает все большее число женщин. По данным Всемирной организации здравоохранения около 20% супружеских пар являются бесплодными, с 40% за счет женского бесплодия. Кроме того, одна треть женщин, проходящих лечение рака (300 000 в год и 30 000 человек в год в США или Италии, соответственно) разработать преждевременное угасание функции яичников.

Стратегия по предотвращению бесплодия у больных раком является изоляции и криоконсервацию фолликулы до лечения онкологических заболеваний, следуют в vitro созревания (IVM) GV яйцеклеток до стадии MII (GV-MII переход). Наличие Неинвазивные мар....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры с участием животных были утверждены институциональный уход животных и использования и этические комитетам в университете Павии. Животные были сохранены в условиях 22 ° C, влажность воздуха 60% и свет/темно цикл 12:12 ч.

1. яичник изоляции

  1. Придать внутрибрюшинно 2 четырех до одиннадцати недельных CD1 самок мышей с 10 U фолликулостимулирующего гормона с шприц 1 мл стерильного раствора инсулина.
  2. Подождите, 46-48 ч.
  3. Весят мыши и анестезировать с внутримышечной инъекции 50 мг/кг Zoletil (Tiletamina и Zolazepan cloridrate). Усыпить шейки матки дислокации.
  4. Возьмите кожи, охватывающих брюшной ст....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рисунок 2 показывает представитель развивающих компетентным и некомпетентных ооцитов, соответственно в начале (GV) и в конце (MII) процедуры КБПБ. IVM взрослой мыши яйцеклеток происходит во время 15 h культуры. Промежуток времени наблюдения записывает прогрессирование мейоз и обнаруживает крупных meiotic мероприятий, включая GVBD и экструзии первого полярного тельца.

Анализ и сравнение более чем две.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Существует несколько важных шагов, которые одно должно заботиться о при выполнении настоящего Протокола с ооцитов мыши, а также с представителями других видов. После изолированы от их фолликулов, ооциты должны быть немедленно переданы в записи капли, как разъединение от компаньон кучевые клетки триггеры начало перехода GV-MII. Возможные изменения к настоящему Протоколу может быть добавлением 3-изобутил-1-метилксантина (IBMX) средний м2, используется для изоляции Кок. IBMX предотвращает немедленного запуска GV-MII переход.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа стала возможной благодаря для поддержки: Университет Павии ФРГ 2016; Пармский университет филь 2014, 2016; и движение за предоставление пластик, необходимые для проведения этого исследования. Мы благодарим д-р Шейн Виндзор (инженерный факультет, Бристольский университет, Великобритания) за предоставление программного обеспечения Cell_PIV.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
FolligonIntervetA201A02гормональное лечение
Hoechst 33342 Sigma-AldrichB2261Для окрашивания ооцитов гетерохроматином
Клеточная культура чашки Петри 35 мм х 10 мм;Corning 430165Для выделения КОК
EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, с фенолом краснымMerck-MilliporeMR-015-DДля выделения КОК
MEM Alpha medium (1X) + Glutamax Sigma-AldrichM4526Для созревания ооцитов in vitro
Клеточная культура Петри-чашка 35 мм стеклянное дно WillCo GWSt-3522Для экспериментов по визуализации
BioStation IM-LM Системаскрининга живых клеток Nikon MFA91001 
Пастеровская пипеткаDelchimica Scientific Glassware6709230Для манипуляций с фолликулами
Минеральное маслоSigma-AldrichM8410Для предотвращения загрязнения и испарения среды
Пенициллин/СтрептомицинLife Technologies15070063Для предотвращения загрязнения среды 
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Sigma-AldrichML16141079Для макияжа α MEM medium 
L-глютамин Life Technologies25030Для макияжа α MEM medium 
ТауринSigma-AldrichT0625Для макияжа α MEM medium 
Бычья сыворотка альбумин (BSA)Sigma-AldrichA3310Для макияжа α MEM медиа
Пируват натрия Сигма-Олдрич  P4562Для макияжа α MEM media
Zoletil (Tiletamina и Zolazepan cloridrate)Virbac SrlQN01AX9Для мышей анестезия
Cell_PIV sofware Любезно предоставлено доктором Шейном Виндзором, Бристольский университет, Великобритания                             -                             -
MATLABМатематический труд, Натик, Массачусетс;                             -Для мультипарадигмальных численных вычислений

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. Molecular methods for selection of the ideal oocyte. Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).
  2. Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a syst....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mouse OocytesCytoplasmic Movement VelocitiesTime Lapse ImagingParticle Image VelocimetryFeed Forward Neural NetworkGerminal VesicleMetaphase IIOocyte IsolationHoechst StainingDevelopmental Competence

Related Articles