Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Вызывая Cre-lox рекомбинации в мыши головного мозга путем электропорации в утробе матери

11.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56675

⸱

17 ноября 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, James Madison University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Ячейки автономных функций генов в мозге могут быть изучены, вызывая потери или получить функции в разреженных популяции клеток. Здесь мы описываем в утробе матери электропорации доставить рекомбиназа КРР в разреженных населения вызывают потери функции в vivoразвивающихся корковых нейронов с floxed генов.

Аннотация

Ячейки автономных функций нейронов генов могут быть выявлены, вызывая потери или получить функции гена в небольшой и редкие популяции нейронов. Для этого требуется создание мозаику, в которой нейроны с прибылей или убытков функции гена окружены генетически невозмущенной ткани. Здесь мы сочетаем системе рекомбинации Cre-lox с электропорации в утробе матери для того, чтобы генерировать ткани мозга мозаики, которые могут быть использованы для изучения клеток автономные функции генов в нейронах. ДНК конструкции (доступно через репозитории), кодирование для флуоресцентные метки и Cre рекомбиназа, вводятся в разработке корковых нейронов, содержащие гены с сайтов loxP в мозгах зародышей мыши, используя в утробе матери Электропорация. Кроме того мы описываем различные приспособления в метод электропорации в утробе матери , которые увеличивают выживаемость и воспроизводимость. Этот метод также включает установление титра для Cre опосредованной рекомбинации в разреженный или плотные популяции нейронов. Гистологические препараты помечены мозговой ткани не требуется (но могут быть адаптированы к) иммуногистохимия. Конструкции, используемые гарантируют что дневно помечены нейронов нести ген рекомбиназа Cre. Гистологические препараты позволяют морфологический анализ нейронов через конфокальная томография дендритных и аксональной беседки и дендритных шипиков. Потому что в разреженных мозаика ткани достигается прибылей или убытков функции, этот метод позволяет исследование клеток автономная необходимость и достаточность гена продуктов в естественных условиях.

Введение

Создание генетических мозаика — классический экспериментальная парадигма для понимания функции гена интереса. Чтобы определить, является ли необходимой для клеточном фенотипу ген, простейший подход вызывает потерю функции гена во всем организме (например , нокаут). Однако чтобы определить, если ген требуется конкретно определенного типа клеток, нокаут гена во всем организме не является допустимым подход. Вместо этого метода не требуется, приведет к потере функции гена в данной ячейке, в то время как он окружен ткани wildtype (т.е. генетически невозмущенной) — другими словами, создание мозаики тканей. Если мутант ячейки показывает мутант фенотип, но окружающие клетки wildtype, не гена функции клеток автономные образом. Анализ мозаика ткани, в которой мутантные клетки окружены wildtype ткани, идеально подходит для понимания клеток автономных функций генов, особенно в головном мозге, где нейронов и глии образуют обширную сеть взаимосвязанных ткани.

Несколько видов ткани мозга мозаики предоставляют мощные модели для изучения клеток автономных функций генов. Исследования были посвящены нейрональных трансплантации1, женский Х-хромосомой мозаичностью2,3,4, и эндогенного соматических мозаичностью5,6 нарисовали их выводы, основанные на мозаика ткани мозга. Условного удаления гена через систему Cre-lox рекомбинации является метод, который принимает полное преимущество большой доступности трансгенные мыши линий. В этом методе два loxP сайты появляются по обе стороны требуемую последовательность гена (например экзона), оставляя его в окружении loxP сайты, что оба лицом в одном направлении («floxed»). CRE рекомбиназа акцизов последовательности между сайты loxP7. CRE опосредованной рекомбинации можно достичь путем скрещивания floxed мышей к другой мыши линии, выражая Cre рекомбиназа наряду с флуоресцентные маркер в подмножество ячеек («Cre репортер линия»). Это было продемонстрировано в различных способов, чтобы раскрыть функции гена в подмножества ячеек, например возбуждающих нейронов или астроциты8. CRE репортер линии можно выразить CreERT2 разрешить Cre опосредованной рекомбинации быть наркотиков индуцибельной (сингл нейрон маркировки с индуцибельной Cre опосредованной нокаутом, или пятно)9. В другой стратегии под названием Мозаика анализ с маркерами (MADM)10,11КРР опосредованной interchromosomal Рекомбинация позволяет гомозиготных мутанта созданы наряду с гетерозиготной ткани. В этих подходов новая линия мышей должна производиться каждый раз для каждого кандидата ген или сотовой подтип, для которого проверяется. Кроме того рекомбиназа Cre могут быть введены постнатально через ионофорез12 или вирусных векторов (например аденоассоциированный вирусов13 или lentiviruses14 ношение сотовых подтип конкретных промоутеры). Эта стратегия создает сильный и послеродовой маркировки. Ориентироваться на развитие мозга корковых нейронов малонаселенных и пренатально, идеальной стратегии находится в утробе матери электропорации Cre рекомбиназа с маркером флуоресцентные.

Кроме объединения Cre-lox рекомбинации через в утробе матери электропорации производить мозаика ткани в естественных условиях, мы представляем несколько адаптации процедур из других опубликованных протоколов15,,16 17,18,19,,2021. Мы предоставляем информацию для улучшения успех размножения приурочен беременных самок. Мы также приводим наши две стратегии ввести разреженных и яркие маркировки нейронов коркового ткани: одна стратегия заключается в том, чтобы Титруйте уровни одной конструкции кодирования для рекомбиназа КРР и флуоресцентных маркеров22. Другая стратегия заключается в использовании системы «Supernova», разработанный специально с этими параметрами в виду23,24. Кроме того мы предлагаем улучшений на производстве последовательной микроинъекции пипетки и упрощения для хирургии электропорации в утробе матери . Наконец мы наметим важнейшие шаги в упрощенной гистологический препарат, который позволяет анализ дендритных шипиков и дендритных и аксональной беседок, без дальнейшего окрашивания или иммуногистохимия.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Описанные здесь методы были одобрены животное уход и использование Комитета (ACUC) из Университета Джеймса Мэдисона и находятся в соответствии и соблюдение всех соответствующих нормативных и институциональных руководящих принципов.

1. мышь Set-up

  1. Дом молодой (> P60) Мужские и женские гомозиготных floxed мышь вместе, чтобы создать пару заводчик25.
    Примечание: Хороший отрицательный контроль заключается в создании дополнительных заводчик пару мышей wildtype, в котором Cre рекомбиназа выражение не вызовет мозаика26.
  2. Разрешить Самки рожают и поднять ее первый помет с мужчиной. Держите самца вместе с самка увеличить выживание помет. После отъёма поросят в помете, например на послеродовой день (P) 21, отдельных женщин и мужчин.
  3. Мышиных разведения
    1. Настройка времени спаривания между женской и мужской25. Использование визуальных подсказок для определения цикл эструса женского27и проверить для вагинальных свечей утром после спаривания25.
    2. Если вилка найдено, отдельные и весят самка. Граф день как день эмбриональных (E) 0,5.
    3. Далее, весом самки каждые 3-5 дней, чтобы определить, если она беременна. Беременные самки будет иметь 10-20% увеличение массы тела 7-10 дней после зачатия (E0).
      Примечание: Этот шаг подтверждает стельность раньше и более надежно, чем визуальный осмотр25.
    4. Если женщина не беременна, повторите шаги 1.3.1-1.3.3.
  4. После подтверждения беременности, выберите дату электропорации в утробе матери . Целевой слой II/III кортикального слоя пирамидальных нейронов прародителями, выполняют электропорации в E15.5.

2. ДНК set-up

  1. Выберите один ДНК построить что коды для рекомбиназа КРР, а также маркер флуоресцентные, таких как Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП)28,29. Кроме того используете систему «Supernova», подробно описаны в предыдущих публикациях23,24. Смотрите список материалов, например конструкции.
  2. Усиливает construct(s) ДНК из шага 2.1 в E. coli с использованием стандартных методов микробиологического30.
  3. Очищайте ДНК конструкцию с бесплатно эндотоксина плазмидные очистка kit следуя инструкциям производителя. Элюировать конструкцию с эндотоксинов свободной воды.
    Примечание: Выбор свободных эндотоксина очистки комплект над стандартной очистки комплект имеет решающее значение.
  4. Концентрат элюата ДНК до 1-3 мг/мл в зависимости от желаемой маркировки плотность26.
    Примечание: Титр всегда необходимо установить при работе с новой конструкции ДНК, учитывая, что они имеют разную длину и промоутеров. Рассмотрим, инъекционных конструкцию на нескольких различных концентраций и/или суммы для оценки выражения. Например внутримышечно по 1 мкл или 1,5 мкл 2,0 мг/мл GFP. CRE способен вызвать разреженные (1 мкл) или плотной (1,5 мкл) маркировки уровня II/III визуальные кортикального слоя пирамидальных нейронов26.
  5. Добавить 0,4% Трипановый синий в 1 x фосфатный буфер (PBS; 137 мм NaCl, 2,7 мм KCl, 10 Na2HPO4, 1.8 мм х2PO4 H2O, скорректирована с рН 7,4 с HCl) 1:10 до концентрированный раствор ДНК.
  6. Добавьте 10 x PBS 1:10 в концентрированный раствор ДНК.
  7. Хранить концентрированный раствор ДНК при 4 ° C. Раствор может храниться на неопределенный срок.

3. Пипетка установки

  1. С помощью стеклянные капиллярные съемник, вытащить пипетки с очень долго (10-15 мм) Конусность и очень хорошо кончика, типичный пипеток для инъекций эмбриональных стволовых клеток или ядерной передачи31.
    Примечание: Чтобы предотвратить загрязнение пипеток мусора, они должны быть сделаны в течение 2 дней после операции.
    1. Калибровка стеклянные капиллярные провокатор, выполнив тест рамп, следуя инструкциям производителя. Использование, результирующее значение тепла программировать потянув протокол, используя следующие параметры: тепла = (рампа тестовое значение + 15), тянуть = 30, vel = 120, время = 100, давление = 200. Вставьте стеклянный капилляр, Закрепите зажимы на съемник и активировать запрограммированных потянув протокол, создание конусность на стеклянный капилляр.
    2. Убедитесь, что длина конуса между 10-15 мм с помощью составного световой микроскоп (например 10 X цель)31.
  2. Разбейте обратно пипетку в форме грубо обрезная наконечник диаметром 20-25 мкм.
    1. Центр сингл слойной задачи очистки (см. перечень материалов) за 50 мл стакан и стрейч протрите тугой одной рукой. С другой стороны удерживая и перпендикулярно и полностью протолкнуть пипетки (конусом стороной вниз) центр салфетку, вызывая чистой перерыв в конус31.
      Примечание: Нажав пипеткой полностью через салфетку будет производить наконечник диаметром 20-25 мкм около 70% времени.
    2. Подтвердите под микроскопом составные света (например , 20 x цель).
      Предупреждение: Используйте защиту для глаз во время разбития стекла.
  3. Калибровки пипетки, забирающие 1 мкл 0,4% Трипановый синий в ПБС в частично заполненные piptte, а затем окончания пипетку с маркировкой 1 мкл основанный на высоту 1 мкл в пипетку, используя маркер алкоголя устойчивостью острым концом. Используйте калиброванный пипетку для выпускников других пипетки прежде чем выбросить. Держите пипетки в пипетку держателя от пыли и других частиц.

4. в утробе матери Электропорация

  1. Грефе щипцы, ножницы Ирис, Хартман комаров щипцы, нетканый марлевые губки, кольцо наконечником щипцы и Петри на поддон из нержавеющей стали и обернуть алюминиевой фольгой. Поместите лоток и 1 Л 0,9% физиологического раствора (0,9% wt/vol NaCl в воде) в автоклаве. Автоклаве при температуре 121 ° C и 3,5 кПа для 40 мин удалить из автоклава и место в зоне дезинфекции хирургических.
    Примечание: Очень важно для поддержания стерильных условий во время операции.
  2. Теплый газобетона физиологическим бутылка 1 Л в небольшой водяной бане до 38 ° C по меньшей мере 2 ч до операции.
  3. Подключите к генератор пинцет тип электродов и педали (см. список материалов). Следуя инструкциям производителя, задать генератор доставить пять импульсов 50 мс 50 V (с интервалом в 950 ms) когда вызвано педали. Лечить пинцет тип электродов и место на вылеченные хирургические области.
  4. Сделать носовой конус анестезии как ранее опубликованные32, но использовать конце нитрил или латексные перчатки пальцев сформировать диафрагмы, который надежно надевается открытия носовой конус. Вырежьте отверстие в диафрагме достаточно большой, чтобы соответствовать над мыши мордой.
  5. Глубоко анестезировать беременных мышей на E15.5 в камере индукции, заполнены с изофлюрановая (2-4%), в чистый кислород, течет в 1 Л/мин. После ~ 1 мин, восстанавливающих рефлекс тест (Аккуратно наклоните камеру всасывание и убедитесь, что мышь не само право). Вес мыши для определения дозы осуществляется позже во время операции анальгезии.
  6. Передача мыши в области хирургической и администрировать вдыхаемого изофлюрановая (1-2%) в чистый кислород, течет в 1 Л/мин через носовой конус для поддержания мышь в хирургической плоскости. Используйте щипцы для тестирования педали рефлекс (щепотка лапы мягко и убедитесь, что мышь не возвращать рефлекс) для проверки анестезии. Отслеживать частоту дыхания и усилий, ищет глубокое, регулярное дыхание (~ 70-100 вдохов/мин), и что слизистые розового цвета и влажные.
  7. Применить достаточно ветеринарная Офтальмология Мазь на глаза, чтобы полностью покрыть их для защиты от высыхания во время процедуры.
  8. Flex, диск металлический активатор герметичной упаковке заполнены с перенасыщенных солевой раствор (см. перечень материалов), активация экзотермические Кристаллизация соли. Положите 2 задачи сингл слойной салфетки на вершине мешок и поместите указатель мыши на мешочек для поддержания температуры тела.
  9. Массаж депиляционный крем на область живота с ватные тампоны до брюшной меха растворяет (примерно 20-40 s), а затем протрите брюшной меха. Тщательно очистите от любых оставшихся для депиляции и остатки крем с 70% этанола и ватные тампоны. Расположите перфорированную стерильные хирургические драпировка над брюшной области.
  10. С помощью асептической техники, потяните кожу вверх и от живота с щипцами Грефе и сделать разрез брюшной срединной ~ 2 см на коже с помощью ножниц Ирис, обеспечивая, что основные мышцы не вырезать.
    Примечание: Приемлемой альтернативой сделать надрез с ножницы пинцет и Ирис Грефе является использовать скальпель, как ранее опубликованы17.
  11. Найти linea alba визуализировать срединной rectus abdominis. Тянуть мышцы и от живота с щипцами Грефе и сделать еще один разрез ~ 2 см срединной там с диафрагмой ножницами, подвергая брюшной полости (матки полупрозрачные и эмбрионы будут видны под). Убедитесь, что лежащие в основе матки и кишечника ткани не вырезать. Сделать только достаточно большой разрез (обычно ~ 2 см) вытащить и разоблачить матки комфортно.
    Примечание: Приемлемой альтернативой сделать надрез с ножницы пинцет и Ирис Грефе является использовать скальпель, как ранее опубликованы17.
  12. С помощью кончика микропипеткой стерильные 10 мкл, отказаться от carprofen (растворяют в стерильной 0,9% физиологического раствора) 4 мг/кг в брюшную полость для обезболивания.
  13. Зажим одна Hartman комаров щипцы на левом краю rectus abdominis разрез. Отдых щипцы на перевернутые Петри слева от разреза, открытостью и в левой части разреза. Зажим другой Хартман комаров щипцы на правом краю разреза rectus abdominis и щипцы на перевернутые Петри справа разрез, открытостью и в правой части разреза. Поместите марлю Губка вокруг области разреза.
  14. С помощью щипцов кольцо (без вложенных предел винт), тяните на матке между любые два соседние эмбрионов без дробления или нанесение любой ткани. Начните потянув все эмбрионы через разрез, укладка их на вершине марлю Губка. Вытягивая из последнего эмбрионов из брюшной полости, убедитесь, не тяните яичников или шейки матки. После разоблачены, важно сохранить матку влажные с теплой соленой. Матки, как правило, содержит между 5 и 8 эмбрионов.
    Примечание: Это можно добавить к физиологическим17пенициллина и стрептомицина.
  15. Подключите калиброванные пипетки Аспиратор трубки Ассамблее (см. перечень материалов) и придать точно 1 мкл раствора ДНК, подготовленных на шаге 2 через стенку матки в боковой желудочек каждого эмбриона. Боковые желудочки появляются как два пятна на спинной конечного мозга эмбриона (патчи темнее, чем окружающие ткани конечного мозга). Используйте большой и указательный пальцы во время микроинъекции и электропорации манипулировать эмбрионов, раскрывая боковых желудочков и позволяя эмбрионов для мягко толкнул стенке матки во время инъекции. Подтверждение успешного инъекции, наблюдая Трипановый синий заполнение бокового желудочка.
  16. Место катода пинцет тип электродов (см. перечень материалов) на матке, прямо над медиальной и хвостовой коры для зрительной коре (ориентация альтернативную областях мозга потребует размещения различных электродов)16, 26. Место анода на матке, только хуже и предшествовавшие голова эмбриона.
  17. Подтвердите, что анодом и катодом соприкасаются матки, окружающие зародыш в соответствующие места. Педаль вызвать доставки пять импульсов 50 мс 50 V (с интервалом в 950 ms) через электроды.
    Примечание: Вводят, отрицательно заряженные ДНК будет двигаться к катоду и будут включены в Вентрикулярная зона клетки ближе к катоду.
  18. Возвращение матки в брюшной полости в ту же ориентацию, которую он был найден. Используйте солевых смазывать матки, в то время как руководящие его вручную и крайне осторожно, стараясь не вытесняют эмбрионов с их позиции в матке.
  19. Закрыть мышцы живота с рассасывающиеся швы (см. перечень материалов) с помощью простой Прерванный строчки, привязав концы с хирургический узел. Делать не клип, который заканчивается слишком близко к узел или узел станет застегнул.
    Примечание: Очень важно шов мышцы живота таким образом, чтобы края раны закрываются полностью закрыты, но не причинив бланширования мышцы. Knots должна быть жесткой, поэтому они не могут быть застегнул.
  20. Закройте слой кожи с рассасывающиеся швы (простой Прерванный стежка, хирургический узел, как шаг 4.19). Нанесите небольшое количество клея ткани для герметизации рану. Примените ткань клей на узлах для предотвращения раскрепление. Для удаления клея ткани вокруг раны, которые могут быть атмосферный микропипеткой используйте микропипеткой.
  21. Более низкие уровни изофлюрановая 0,5-1,5%. Как только ткань клей сухой (тест, прикоснувшись перчатка клей), удалить из изофлюрановая и позволяют женщин самостоятельно восстановить в клетке теплой. Администрировать бупренорфин внутрибрюшинно на 0,03 мг/кг, используя шприц 1 мл с 26G, ½" иглы.
  22. Продолжать следить за мыши до тех пор, пока мышь полностью восстановился и ведет себя нормально (т.е. уход, изучения Кейдж, еды или питья). После восстановления, место женщин обратно в клетке с мужчиной.
    Примечание: Если все шаги, мышь будет обычно восстановить сознание в течение 2 минут и немедленно начать перемещение о клетке, проявляя никаких признаков дискомфорта.
  23. Если мышь демонстрирует признаки дискомфорта (например сгорбившись осанки, выделениями порфирина)33, управлять carprofen на 0,1 мг/мл в области водоснабжения. Если присутствуют несколько признаков дискомфорта, или если дискомфорт сохраняется в течение более чем 4 h несмотря на carprofen администрации, немедленно усыпить мыши управляющими внутрибрюшинной инъекции кетамина (240 мг/кг) - Ксилазина (48 мг/кг)- коктейль acepromazine (1,85 мг/кг), используя шприц 1 мл с 26 G, ½" иглы и следуйте с утвержденным вторичной формой эвтаназии33.
  24. Чтобы увеличить выживание electroporated эмбрионов после рождения, держите клетки в тихом Холдинг номер, свободный от шумов и вибраций. Обогатить окружающей среды с пластиковые иглу, раскроя материалов и пищевые добавки, такие как семена подсолнечника (см. список материалов). Не перемещайте и не нарушить клетки, особенно в течение первых 3 дней после отела.

5. гистологические подготовка для микроскопии флуоресцирования

Примечание: Этот гистология протокол оптимизирован для подготовки ткани от животных старше послеродовой день (P) 13, которые были electroporated в утробе матери. Для подготовки ткани от послеродового молодых животных (P0-P13), рекомендуется следить за всеми шагами (включая transcardial перфузии), хотя мозг должен быть внедрен в агар до подготовки разделов (шаг 5.9). Ткани могут быть даже готовы из эмбрионов в течение 1-2 дней после электропорация, с использованием методов описанных ранее18,20.

  1. Готовят раствор параформальдегида (PFA).
    Примечание: Необходимо готовить свежий PFA, в течение одного дня эксперимента.
    Предупреждение: Параформальдегида токсичных и обрабатываться в Зонта с надлежащие средства личной защиты.
    1. Чтобы сделать 50 мл 4% PFA, жара 40 мл воды до 60 ° C. Добавьте 2 g PFA помешивая стеклянный стержень или перемешивания бар. Добавьте 10 мкл 10 M NaOH каждые 2 мин, пока PFA растворяет.
    2. Добавить 5 мл 10 x PBS и довести решение в окончательный объем 50 мл с водой.
    3. После чего решение до 50 мл, pH 7,4 при необходимости измените с 10 М раствор HCl. разрешить охладить и хранить при 4 ° C.
  2. Усыпить мышь с внутрибрюшинного введения кетамин (240 мг/кг) - Ксилазина (48 мг/кг) - acepromazine (1,85 мг/кг) коктейль с использованием 1 мл шприц с 26G, ½" иглы. Transcardially perfuse 10 или 20 мл ледяной ПБС, следуют 25 или 40 мл свежеприготовленные, ледяной 4% PFA17. Использование более низких объемов для молодых послеродовой (P0-P13) мышах и выше томов для старых мышей (P14 и выше).
  3. Сразу же после перфузии обезглавить тушу мыши между затылочной кости и позвонка C1 с большими ножницами и удаляйте и отбросить большую часть кожи вокруг черепа с помощью ножниц Ирис, особенно кожи окружающих лобной, теменной и затылочной кости. Сохраняют черепа и головного мозга.
  4. Место черепа и мозга в 10 мл 4% ПФА в 50 мл Конические трубки для 24 ч при температуре 4 ° C после исправить ткани. Затем добавить PBS 1 x 30 мл Конические трубки разбавить раствор 1% PFA для хранения при 4 ° C.
    Примечание: Используйте отдельный Конические трубки для каждого черепа и мозга после быть исправлены. Не инкубировать мозга в 1% PFA дольше, чем 2 недели, или флуоресценции начнут исчезать.
  5. Место мозга и черепа на плоской поверхности с одной слойной задачи салфетки, смоченной ПБС. Для удаления любых оставшихся кожи или мембраны, окружающие черепа используйте пинцет (см. список материалов).
  6. С помощью пинцета, сначала удалите затылочной кости, а затем тщательно удалить теменной кости, перемещение пинцетом и далеко от поверхности головного мозга. Осторожно удалите любые мозговых оболочек для предотвращения повреждения коры.
  7. Клин в задней части пинцет под мозга вдоль черепа, чтобы разорвать любые черепных нервов и удалить мозга.
  8. Для молодых послеродовой мозги (P0-P13)
    1. Сделать 25 мл 4% агар, Отопление PBS 1 x 25 мл до 80 ° C. Перемешать и растворить 1 g агар с стеклянный стержень или перемешивания бар).
    2. Прохладный решение до 35 ° C, продолжая размешивать. Место мозга в небольшой контейнер (например крышечка коническая труба 50 мл) и залить раствор Агар мозга. Разрешить агар для упрочнения.
  9. Сделайте вручную с помощью лезвия бритвы краевыми через мозг, примерно 0,5 мм ростральной bregma корональных разрез. Сделать еще один корональных вырезать через мозг примерно 0,5 мм хвостовой зрительной коры. Место пул Цианакрилатный клей с того же диаметра как Ростральные конец мозга в центре вибрирующий микротом предметных стёкол. Поместите ростральной конец мозга на вершине бассейн клея, обеспечивая, что вся ростральной поверхность ткани привязан к предметных стёкол с клеем.
  10. Смонтировать буфера лоток на вибрирующие микротома и зафиксируйте с встроенным зажимной рычаг. Вставьте лезвие в держатель ножа и смонтировать держатель ножа на вибрирующие микротом с встроенным зажимной винт. Безопасные предметных стёкол с мозга на лоток буфера, используя встроенный зажимное устройство. Задать скорость до 5,70 (= 0.285 мм/сек) и настройку частоты до 5,33 (53,3 Гц).
  11. Заполните камеры выше уровня мозга с ПБС и опустите лезвия в PBS. Начнете принимать 100 мкм коронковой части через ткани.
  12. Если не требующие дальнейшей обработки, например, 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ядерных пятнать или иммуногистохимия.
    1. Используете тонкой кистью наконечником для передачи разделы непосредственно с вибрирующей микротом на микроскопа, монтаж разделы 4-6 на каждый слайд.
    2. Разрешить секций для просушки на влагу от решения с тонкой кистью наконечником, таким образом, чтобы срезы мозга больше не дрейф на слайдах.
    3. Затем, место одна капля mountant (см. перечень материалов) по каждому разделу на слайде.
    4. Аккуратно заложить 24 x 50 мм coverslip на вершине, обеспечение того, чтобы 1) без воздушных пузырей формы на разделы, 2 разделы не двигаться, и 3 mountant полностью охватывает область между слайд и coverslip. Разрешить mountant вылечить в течение 24-48 часов.
  13. Пятно ядер с DAPI для гистологического исследования кортикальной пластинки
    1. Использование тонкой кистью наконечником для передачи каждого раздела в раствор, содержащий 10 мкг/мл DAPI (см. перечень материалов) разводят в однократном ПБС от Стоковый раствор (20 мг/мл DAPI в воде).
    2. Инкубировать в растворе DAPI 5 мин при комнатной температуре, а затем использовать тонкой кистью наконечником для передачи секции от DAPI раствор ПБС и инкубировать в однократном ПБС втечение 5 мин при комнатной температуре. Передать секции, две еще раз свежие ПБС втечение 5 мин. Затем с помощью тонкой кистью наконечником, передачи секции на микроскопа, выполните шаги 5.11.2-5.11.4 и продолжить с шага 5.13.
  14. Тепло чашку Петри стекла, содержащие Valap (равных частей вазелин, ланолин и парафина) на горячей плите на медленном огне настройки до тех пор, пока полностью растаял. Печать предоставляемые чистки на расплавленный Valap края слайдов.
  15. Чтобы проверить флуоресценции в ткани, использовать световой микроскоп или конфокального микроскопа (см. перечень материалов) и достаточное для просмотра Флюорофор набора фильтров (например DAPI: возбуждения 325-375 Нм, выбросов 435-485 Нм; GFP: возбуждения 450-490 Нм, выбросов 500-550 Нм)17. Конфокальный изображения могут быть приняты с низким (4 X, числовая апертура, NA = 0,20), средне-(20 X, NA = 0,75) и мощных (60 X, NA = 1,40) цели.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Сингл построить GFP. CRE (см. перечень материалов) была electroporated на E15.5 и визуализированы на P14. В зависимости от концентрации конструкции и объем впрыска Разреженный или плотной результат можно получить22,26. Например внутримышечно по 1 мкл 2 мг/мл GFP. Результаты КРР в разреженных распределения помеченных клеток, некоторые из которых могут быть ярко (рис. 1A) и локализованных в слой II/III ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы представляем сочетание в утробе матери электропорации с КРР рекомбиназа floxed мышей для создания мозаики мозговой ткани. Преимуществом этого подхода является, что новая линия мыши не нужно создаваться каждый раз разных клеточных подтип направлены: электропорация в утробе матери могут использоваться для целевой возбуждающих нейронов, ингибирующих нейронов и глии в зависимости от времени и расположение электропорации15,16,

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.

Благодарности

Авторы благодарят щедрой поддержке Департамента биологии университета Джеймс Мэдисон и Джеймс Мэдисон университета свет микроскопии и визуализации объекта. Д-р Марк л Gabriele за полезные рекомендации относительно подготовки молодых послеродовой ткани, и Drs. Джастин Браун и Кори л Cleland щедрой координации хирургических материалов и пространства. Это исследование финансировалось частично совместный исследовательский грант 4-ва, партнерством для продвижения Содружества Вирджинии (G.S.V.) и по Вирджинии Академии от науки малых проекта исследовательский грант (G.S.V.). Поддержка была щедро предоставляемые Бетти Джо любящий Батлер ' 58 пожертвований для Undergraduate исследований стипендию (K.M.B.), Фаррелл летних исследований стипендию (K.M.B.), Джеймс Мэдисон университета второго века стипендию (K.M.B.), Джеймс Столетия стипендии университета Мэдисона (для C.J.H.), Университет Джеймса Мэдисона Люси Робинсон Поиск ' 30 Мемориал стипендию (Z.L.H.) и Джеймс Мэдисон университетский колледж науки и математика Грант факультет (для G.S.V.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
C57BL/6J мышиЛаборатория Джексона#000664См. "1. Настройка мыши" (шаг 1.1, "мыши дикого типа")
GFP. Cre пустой векторAddGene#20781См. "2. Настройка ДНК» (шаг 2.1 «Единая конструкция ДНК, которая кодирует Cre-рекомбиназу, а также флуоресцентный маркер»). GFP. Cre пустой вектор был подарком от Тайлера Джекса.
pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)AddGene#69138См. "2. DNA setup" (шаг 2.1 "система "Supernova") и http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) был подарком от Такудзи Ивасато.
pK031.TRE-Cre (Supernova)AddGene#69136См. "2. DNA setup" (шаг 2.1 "система "Supernova") и http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Сверхновая) была подарком от Такудзи Ивасато.
pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)AddGene#85006См. "2. DNA setup" (шаг 2.1 "система "Supernova") и http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) был подарком от Такудзи Ивасато.
Набор EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)Qiagen#12362См. "2. ДНК-установка» (шаг 2.3 «набор для очистки плазмид без эндотоксинов»)
Порошок трипанового синего цвета, биореагент маркиSigmaT6146-5GСм. «2. Настройка ДНК" (шаг 2.5 "трипановый синий")
Хлорид натрия, ACS, 2,5 кгVWRBDH9286-2,5 кгСм. "2. Настройка ДНК" (шаг 2.5 "NaCl")
Хлорид калия, ACS, 500 гVWR#97061-566См. "2. ДНК-установка" (шаг 2,5 "KCl")
Натрия фосфат двухосновный, ReagentPlus, 100 гSigma-AldrichS0876-100GСм. "2. ДНК" (шаг 2.5 "Na2HPO4")
Фосфат калия моноосновный, ReagentPlus, 100 гSigma-AldrichP5379-100GСм. "2. Настройка ДНК" (шаг 2,5 "KH2PO4")
Соляная кислота, реагент ACS, 500 млFisher ScientificA144-500См. "2. Настройка ДНК" (шаг 2.5 "HCl")
P-97 Съемник микропипетокSutter InstrumentP-97См. "3. Настройка пипетки" (шаг 3.1 "стеклянный капиллярный съемник")Желоб
шириной 3,0 мм нитьSutter InstrumentFT330BСм. "3. Настройка пипетки" (шаг 3.1 "Съемник стеклянных капилляров")
Тонкостенные стеклянные капилляры, 4", 1 / 0,75 OD/IDWorld Precision InstrumentsTW100-4См. "3. Настройка пипетки" (шаг 3.1.1 "стеклянный капилляр")
Однослойные салфетки Soft-Tech, 4,5 "PhenixLW-8148См. "3. Настройка пипетки» (шаг 3.2.1 «однослойная рабочая протирка»); можно использовать другие однослойные салфетки (например, Kimwipes).
Щипцы Грефе, 7 см, прямые, 0,7 мм 1x2 зубьяWorld Precision Instruments#14140См. "4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.1 "Щипцы Грефе")
Ножницы с диафрагмой, 11,5 см, прямые, 12 упаковокWorld Precision Instruments#503708-12Смотрите "4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.1 "Ножницы для радужной оболочки")
Hartman Mosquito Щипцы, 9 см, прямой, 12-packWorld Precision Instruments#503728-12См. "4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.1 "Москитные щипцы Хартмана")
Губки общего назначения нетканые губки, 2" x 2", 4-слойныйMedrepexpress#2204-cСм. "4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.1 "Нетканые марлевые губки")
Щипцы с кольцевым наконечником, 10 см, прямые, 2,2 мм IDWorld Precision Instruments#503203См. "4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.1 "щипцы с кольцевым наконечником")
Чашки Pyrex petri в комплекте, O.D. × В 100 мм и раз; 20 ммSigma-AldrichCLS3160102-12EAСм. "4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.1 "Чашки Петри")
Плоский поднос для инструментов, нержавеющая сталь, 13-5/8" x 9-3/4" x 5/8"AmazonB007SHGAHAСм. "4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.1 "поднос из нержавеющей стали")
Платиновый твицертрод, 5 ммBTX#45-0489См. "4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.3 и 4.16 "электроды типа пинцера")
ECM 830 Ножная педальBTX#45-0211См. "4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.3 и 4.17 "ножная педаль")
ECM 830 ГенераторBTX#45-0052См. "4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.3 "генератор")
Система анестезии изофлураном для одного животного с малым индукционнымбоксом Harvard Apparatus#72-6468См. "4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.4 и 4.6 "носовой конус", шаг 4.4 "индукционная камера")
Офтальмологическая мазьHanna Pharmaceutical Supply Co#0536108691См. "4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.7 "ветеринарная офтальмологическая мазь")
Space Gel (AIMS)VWR#95059-640См. "4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.8 "Запечатанный мешочек заполнен перенасыщенным солевым раствором")
Гель-крем для снятия волос, формула для чувствительныхVeet#062200809951Смотрите "4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.9 "крем для депиляции")
10 мкл Low Retention Tip Starter (960 наконечников/шт)Phenix Research ProductsTSP-10LKITСм. "4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.12 "стерильные 10&микро; L наконечник для микропипетки")
Аспираторные трубки в сборе для калиброванных микрокапиллярных пипетокSigma-AldrichA5177См. "4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.15 "Сборка аспираторной трубки")
Плетеный рассасывающийся шовный материал, 4-0, игла NFS-2(FS-2), 27"MedrepexpressMV-J397См. "4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.19 "Рассасывающиеся швы")
" ЛиквиВет Рапид» Тканевый клейМедрепэкспрессВГ3см. "4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.20 "тканевый клей")
Шприцы для подкожных инъекций, полипропилен, наконечник замка Люэра, емкость 1,0 млSigma-AldrichZ551546-100EAСм. "4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.21 "Шприц 1 мл")BD
Precisionglide шприц с иглами калибра 26, L 1/2 in.Sigma-AldrichZ192392-100EAсм. "4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.21 "26G, ½ ” игла")
Nestlets Nesting MaterialAncareNES3600см. "4. Внутриутробная электропорация» (шаг 4.24 «Материалы для гнездования»)
Семена подсолнечника, черное масло, стерильныйBio-ServS5137См. «4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.24 "Семена подсолнечника")
Параформальдегид, 97%Альфа Аэсар А11313См. "5. Гистология" (шаг 5.1.1 "PFA")
Экономичный пинцет #3, 11 см, наконечники 0,2 x 0,4 ммWorld Precision Instruments#501976См. "5. Гистология" (шаг 5.5 "пинцет")
Порошок агараAlfa Aesar#10752См. "5. Гистология" (шаг 5.8.1 "агар")Лезвия
бритвы с одним лезвием, лезвие #9Stanley Tools#11-515См. "5. Гистология" (шаг 5.9 "лезвие бритвы с одним лезвием")
Диск для образцов S D 50 ммLeica#14046327404См. "5. Гистология" (шаг 5.9 "вибрирующий микротомный диск для образцов")
Буферный лоток S сборкаLeica#1404630132См. "5. Гистология" (шаг 5.10 "буферный лоток")
VT1000 S VibratomeLeica#14047235612См. "5. Гистология" (шаг 5.10 "Вибрационный микротом")
Лезвия бритвы с двойным лезвиемPersonnaBP9020см. "5. Гистология" (шаг 5.10 "лезвие")Держатель
ножа SLeica#14046230131См. "5. Гистология" (шаг 5.10 "держатель ножа")
Studio Elements Golden Taklon с короткой ручкой, круглая щетка, наборB0089KU6XEсм. "5. Гистология" (шаг 5.12.1 "кисть с тонким кончиком")
Superfrost Plus SlidesУслуги электронной микроскопии#71869-11См. "5. Гистология" (шаг 5.12.1 "предметное стекло микроскопа")
ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 млThermofisherP36970См. "5. Гистология" (шаг 5.12.3-5.12.4 "монтант")
Покровное стекло, 24 x 50 мм, No 1Phenix Research ProductsMS1415-10См. "5. Гистология" (шаг 5.12.4 "покровное стекло")
4′,6-Диамидино-2-фенилиндола дигидрохлорид (DAPI)Sigma-AldrichD9542См. "5. Гистология" (шаг 5.13.1 "DAPI")Стационарный
вертикальный микроскопOlympusBX51WIсм. "5. Гистология" (шаг 5.15 "световой микроскоп")
Лазерный сканирующий конфокальный микроскопNikonTE2000/C2siсм. "5. Гистология" (шаг 5.15 "конфокальный микроскоп")4x
объектив, NA = 0.20Nikon CFI Plan Apo Lambda4X См. "5. Гистология" (шаг 5.15 "маломощный объектив")
объектив 20x, NA = 0.75NikonCFI Plan Apo Lambda 20XСм. "5. Гистология" (шаг 5.15 "объектив средней мощности")
объектив 60x, NA = 1.40NikonCFI Plan Apo VC 60X OilСм. "5. Гистология» (шаг 5.15 «объектив высокой мощности»)
волос Amazon

Ссылки

  1. Southwell, D. G., Froemke, R. C., Alvarez-Buylla, A., Stryker, M. P., Gandhi, S. P. Cortical plasticity induced by inhibitory neuron transplantation. Science. 327 (5969), 1145-1148 (2010).
  2. Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. J. Neurosci. 27 (15), 4014-4018 (2007).
  3. Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. A Target Cell-Specific Role for Presynaptic Fmr1 in Regulating Glutamate Release onto Neocortical Fast-Spiking Inhibitory Neurons. J. Neurosci. 33 (6), 2593-2604 (2013).
  4. Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network. J. Neurosci. 34 (9), 3413-3418 (2014).
  5. McConnell, M. J., et al. Mosaic Copy Number Variation in Human Neurons. Science. 342 (6158), 632-637 (2013).
  6. McConnell, M. J., et al. Intersection of diverse neuronal genomes and neuropsychiatric disease: The Brain Somatic Mosaicism Network. Science. 356 (6336), eaal1641(2017).
  7. Gu, H., Marth, J. D., Orban, P. C., Mossmann, H., Rajewsky, K. Deletion of a DNA polymerase beta gene segment in T cells using cell type-specific gene targeting. Science. 265 (5168), 103-106 (1994).
  8. Hodges, J. L., et al. Astrocytic Contributions to Synaptic and Learning Abnormalities in a Mouse Model of Fragile X Syndrome. Biol. Psychiatry. (17), 1-11 (2016).
  9. Young, P., Qiu, L., Wang, D., Zhao, S., Gross, J. Single-neuron labeling with inducible cre-mediated knockout in transgenic mice. Nat. Neurosci. 11 (6), 721-728 (2011).
  10. Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic Analysis with Double Markers in Mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
  11. Hippenmeyer, S., et al. Genetic mosaic dissection of Lis1 and Ndel1 in neuronal migration. Neuron. 68 (4), 695-709 (2010).
  12. De la Rossa, A., Jabaudon, D. In vivo rapid gene delivery into postmitotic neocortical neurons using iontoporation. Nat. Protoc. 10 (1), 25-32 (2015).
  13. Lu, W., Bushong, E. A., Shih, T. P., Ellisman, M. H., Nicoll, R. A. The cell-autonomous role of excitatory synaptic transmission in the regulation of neuronal structure and function. Neuron. 78 (3), 433-439 (2013).
  14. Duan, Y., et al. Semaphorin 5A inhibits synaptogenesis in early postnatal- and adult-born hippocampal dentate granule cells. eLife. 3, 1-24 (2014).
  15. Dixit, R., et al. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957(2011).
  16. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024(2011).
  17. Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. In utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity. J. Vis. Exp. (120), (2017).
  18. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
  19. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nature protocols. 1 (3), 1552-1558 (2006).
  20. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  21. Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 10 (3), 1027-1032 (2007).
  22. Pacary, E., et al. Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation. J. Vis. Exp. (65), e4163(2012).
  23. Mizuno, H., et al. NMDAR-Regulated Dynamics of Layer 4 Neuronal Dendrites during Thalamocortical Reorganization in Neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
  24. Luo, W., et al. Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Sci. Rep. 6, 35747(2016).
  25. Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice. Lab animal. 38 (9), 305-310 (2009).
  26. Vidal, G. S., Djurisic, M., Brown, K., Sapp, R. W., Shatz, C. J. Cell-Autonomous Regulation of Dendritic Spine Density by PirB. eNeuro. 3 (5), 1-15 (2016).
  27. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS ONE. 7 (4), 1-5 (2012).
  28. Andreu-Agullo, C., Maurin, T., Thompson, C. B., Lai, E. C. Ars2 maintains neural stem-cell identity through direct transcriptional activation of Sox2. Nature. 481, 195-198 (2011).
  29. Scotto-Lomassese, S., et al. Fragile X mental retardation protein regulates new neuron differentiation in the adult olfactory bulb. J. Neurosci. 31, 2205-2215 (2011).
  30. Plasmids 101: A Desktop Resource. , 3rd ed, Addgene. Cambridge, Massachusetts. (2017).
  31. Pipette Cookbook. , rev. ed, Sutter Instrument Company. Novato, California. (2015).
  32. Cuddington, B., Verschoor, M., Mossman, K. Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses. J. Vis. Exp. (93), e52232(2014).
  33. Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg, Illinois. (2013).
  34. Anderson, S. A., Eisenstat, D. D., Shi, L., Rubenstein, J. L. R. Interneuron Migration from Basal Forebrain to Neocortex: Dependence on Dlx Genes. Science. 28 (5337), 474-476 (1997).
  35. Parker, J. M., Austin, J., Wilkerson, J., Carbone, L. Effects of Multimodal Analgesia on the Success of Mouse Embryo Transfer Surgery. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 50 (4), 466-470 (2011).
  36. Kim, J. -Y., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo. Eur. J. Neurosci. 37 (8), 1203-1220 (2013).
  37. Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5. J. Vis. Exp. (45), e2047(2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Вызывая Cre-lox рекомбинации в мыши головного мозга путем электропорации в утробе матери
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.