Методическая статья

Assay простой Cell-based иммунофлюоресценции для выявления аутоантител против рецептора N-метил D-аспартат (NMDA) в крови

DOI:

10.3791/56676

⸱

9 января 2018 г.

 , 
1Department of Psychiatry, Chang Gung Memorial Hospital-Linkou, 2Department and Graduate Institute of Biomedical Sciences, Chang Gung University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы ectopically выразил NR1 Субблок NMDA-рецепторов, отмеченных Зеленый флуоресцирующий белок в человеческих эмбриональных клеток (HEK293) как антиген для выявления аутоантител против NMDA-рецепторов в крови пациентов с подозрением с аутоиммунным энцефалита. Этот простой метод могут быть пригодны для скрининга целей в клинических условиях.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наличие Анти NMDA-рецептора аутоантител может вызвать различные Психоневрологическая симптомы в пострадавших пациентов, называется Анти NMDA рецепторы аутоиммунных энцефалита. Выявление конкретных аутоантител против NMDA-рецепторов в крови и спинномозговой жидкости (CSF) имеет важное значение для точной диагностики данного состояния. NMDA-рецепторов является ионный канал комплекс белков, который содержит четыре подразделения, включая два обязательных NMDA рецепторы Субблок 1 (NR1) и один или два NMDA-рецептора Субблок 2A (NR2A), NMDA рецепторы Субблок 2B (NR2B), NMDA рецепторы субъединица 2C (NR2C), или NMDA-рецептора Субблок 2D (NR2D). Эпитоп Анти NMDA-рецептора аутоантител было сообщено присутствовать на внеклеточные N-концевой домен NR1 субъединицы NMDA-рецептора. Цель этого исследования заключается в разработке простой на основе ячеек иммунофлюоресценции assay, который может использоваться в качестве скрининг-тест для обнаружения аутоантител против NR1 Субблок NMDA-рецепторов в крови для облегчения клинических и базовые исследования Анти NMDA рецепторы аутоиммунных энцефалит.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анти-NMDA рецепторы аутоиммунных энцефалита — недавно признанных болезни сущность, которая может возникнуть у пациентов всех возрастов и влияет на преимущественно женские пациенты1,2. Это один из наиболее часто диагноз энцефалита среди пациентов с первоначальных неизвестной этиологии энцефалита3. Больных, пострадавших с Анти NMDA-рецептора энцефалита обычно имеют продромальный симптомы головной боли или лихорадки, а затем быстрое развитие изменения уровня сознания и множество острых нервно-психических симптомов, включая возбуждение, раздражительность , тревога, бессонница, галлюцинации, бред, агрессии, причудливых поведений, движение аномалии, вегетативной регуляции и захват нападения4,5. Раннее распознавание этого состояния и своевременного лечения с иммунотерапия являются важными для лучший результат и даже полного восстановления в пострадавших пациентов6. Следовательно предполагается, что Анти NMDA рецепторы аутоиммунных энцефалита следует считать важным дифференциальной диагностики пациентов с острой или новое наступление психотического функции7,8.

Помимо клинических особенностей выявление аутоантител против NMDA-рецепторов в крови и спинномозговой жидкости имеет важное значение для точной диагностики Анти NMDA рецепторы аутоиммунных энцефалита9. Большинство из иммунологических тестов для обнаружения Анти NMDA рецепторных аутоантитела доступны в нескольких научно-исследовательских лабораториях10,11, и есть только один assay коммерчески доступных на основе ячеек иммунофлюоресценции для скрининга Анти NMDA-рецептора аутоантител12. Цель этого исследования заключается в разработке простой собственными силами на основе ячеек иммунофлюоресценции assay, который может быть удобно использовать в лаборатории для проверки наличия Анти NMDA рецепторы аутоантител для облегчения клинических исследований Анти NMDA-рецептора аутоиммунная энцефалит. NMDA-рецепторов — это heterotetramer ионный канал комплекс белков конкретно выражена в головном мозге. Он изготовлен из двух обязательных NR1 субблоков и сочетание одной или двух подразделений NR2A, NR2B, NR2C или NR2D13. Предыдущие исследования сообщили, что в внеклеточной N-концевой домен NR1 Субблок5основные epitope мишенью антитела. Следовательно в этом протоколе, мы выражаем человеческий рекомбинантный белок NR1-Субблок NMDA-рецептора, отмеченных Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) в строке эпителиальных клеток человеческого эмбриона почек (HEK293) и разработать на основе ячеек иммунофлюоресценции проба для выявления класса IgG Анти NMDA рецепторы аутоантител в крови.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было одобрено институциональных обзора Совет из Чанг Gung Мемориальный госпиталь в Linkuo, Таоюань, Тайвань (102-2577A3).

1. Подготовка NR1-GFP выражение плазмиды

  1. Смесь 10 нг NR1-GFP плазмида с 100 мкл сведущие клетки штамма кишечной палочки DH5α в стерильных 1,5 мл центрифуга трубки, накапайте смесь осторожно вверх и вниз 4 - 6 раз и инкубировать трубку на льду за 20 мин.
  2. Инкубировать трубки при 42 ° C за 1 мин на водяной бане, извлеките трубку из водяной бани, добавить 1 мл lysogeny бульон (LB) среднего в трубку и инкубировать трубки при 37 ° C в инкубаторе с встряхивания в течение 1 ч.
  3. Распространения 50 мкл смесь на плиту LB агар, содержащий ампициллина (0,1 мг/мл) и инкубировать пластину агар фунтов при 37 ° C в инкубаторе одночасье.
  4. Выбрать один колонии от ночи LB агар пластины с помощью стерильных кончика, и вихрем кончиком в в бактериальной культуры трубка, содержащая 5 мл LB средних и ампициллин (0,1 мг/мл). Инкубируйте трубки при 37 ° C в инкубаторе с встряхивания на ночь.
  5. Аликвота 3 мл ночи бактериальной культуры в 500 мл флакон, содержащий 250 мл стерильного LB среднего и ампициллин (0,1 мг/мл). Инкубируйте настой при 37 ° C при встряхивании. Регулярно проверяйте оптической плотности (OD) бактериальной культуры на длине волны 600 нм с помощью спектрометра, до тех пор, пока OD600 достигает 0,6-1,0.
    Примечание: Смешайте хорошо 800 мкл ночи бактериальной культуры с 200 мкл глицерин подготовить глицерин запас и хранить запас глицерина до-80 ° C для использования в будущем.
  6. Подготовить NR1-GFP выражение плазмид бактериальной культуры 250 мл
    1. Собирать клетки центрифугированием при 6000 x g 15 мин при 4 ° C.
    2. Ресуспензируйте Пелле бактерий в 10 мл ресуспендирования буфер, содержащий РНКазы A; Вихрь тщательно до тех пор, пока не комок рассматривается.
    3. Добавить 10 мл буфера lysis бактерий подвеска, нежно инвертировать смесь 4 - 6 раз и инкубировать lysate при комнатной температуре (RT) за 5 мин.
    4. Добавить 10 мл предварительно охлажденные осадков буфера lysate, осторожно перевернуть смесь 4 - 6 раз.
    5. Залить lysate в ствол картриджа фильтра с крышкой; Подождите 10 минут на RT.
    6. Снимите колпачок с напорный патрубок картриджа, вставьте картридж поршень и осторожно нажмите на поршень. Собирать отфильтрованных lysate в 50 мл трубки.
    7. Добавить 2,5 мл несвободных буфер от производителя для отфильтрованных lysate, перемешать смесь, инвертирование трубки примерно в 10 раз и инкубировать смесь на льду за 30 мин.
    8. Применить отфильтрованные lysate смесь в столбец Фильтр, который был предварительно достижение равновесного уровня с 10 мл уравновешивания буфера. Разрешить столбце для слива самотеком.
    9. Промойте колонку с 30 мл буфера мыть дважды, а затем элюировать ДНК из столбца с помощью 15 мл Элюирующий буфер.
    10. Добавить 10,5 мл (0,7 томов) изопропанол eluted дна буфер, хорошо перемешать и центрифуги смеси на 20000 x г за 30 мин при 4 ° C.
    11. Осторожно декантируют супернатанта, раз помыть лепешка ДНК с 5 мл эндотоксинов бесплатно 70% этанол и центрифуги на 20000 x g за 10 мин.
    12. Декант супернатанта, сухие гранулы для 5-10 мин в химические вытяжки и растворяют гранулы в 300-500 мкл буфера эндотоксинов бесплатно.
    13. Определите концентрацию плазмиды путем измерения поглощения раствора УФ 260/280 Нм, используя спектрофотометр.
      Примечание: Подготовьте выражение плазмида GFP, используя тот же протокол.

2. transfection клеток HEK293 с NR1-GFP выражение плазмиды

  1. Аликвота 200 мкл раствора желатина 2% каждому хорошо плиты 48-ну культуры и инкубировать пластины при 37 ° C по меньшей мере 30 мин.
  2. Аспирационная раствор желатина из клеток 5 х 104 HEK293 хорошо и семян в 200 мкл клеток питательной среды, содержащие 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) в каждом хорошо. Инкубируйте пластины при 37 ° C в увлажненные инкубатора, поставляется с 5% CO2 на ночь.
    Примечание: Клетки были подсчитаны с помощью Горяева.
  3. На следующий день, заменить отработанного питательной среды с 200 мкл свежей питательной среды, содержащие 10% FBS в колодец.
  4. Для каждого отдельного хорошо, подготовить раствор А, смешивая 100 нг NR1-tGFP плазмиду с 20 мкл питательной среды и B решение путем смешивания 0,8 мкл Реагента трансфекции с 20 мкл питательной среды. Умножьте количество скважин, необходимо подготовить общий объем для каждого эксперимента.
  5. Готовят раствор C, смешивая A и B и инкубировать смеси на RT для 20-30 мин.
  6. Аликвота 40 мкл раствора C для каждой хорошо содержащие клетки HEK293, вихревой мягко пластину и инкубировать пластины при 37 ° C в увлажненные инкубатора, поставляется с 5% CO2 на ночь.
  7. Проверьте в выражении NR1-GFP рекомбинантных белков в клетки хозяина под флуоресцентный микроскоп с увеличением 40 X-200 X (возбуждения/выбросов: 482/502 Нм) и провести пробу на основе ячеек иммунофлюоресценции.
    Примечание: Transfect плазмиды выражение гена GFP в HEK293 клетки, используя тот же протокол.

3. cell-based иммунофлюоресценции Assay

  1. Аспирационная отработанного среднего из скважин, затем промыть каждой скважины с 200 мкл фосфата буфер солевой (PBS), три раза.
  2. Добавить 200 мкл раствора параформальдегида 4% в каждой скважине; Инкубируйте пластину в РТ за 15 мин.
  3. Аспирационная параформальдегида решение из скважин и мыть каждый хорошо с 200 мкл PBS три раза.
  4. Добавить 200 мкл 10% обезжиренного молока в PBST (0.1% Tween-20 в PBS) решение каждой хорошо и инкубировать пластину на RT 1 h с нежным встряхивания.
  5. Аспирационная 10% обезжиренное молоко в PBST растворе из колодца, а затем промыть лунки с 200 мкл PBST раз.
  6. Инкубируйте скважин с разбавленной плазмы (1: 100 в PBST) как основного антитела с нежным тряски в РТ за 1 ч.
    Примечание: Плазма получается из крови пациентов, предположительно имеют аутоиммунные энцефалита.
  7. Аспирационная разбавленной плазмы из скважин и мыть каждый хорошо с 200 мкл PBST три раза.
  8. 200 мкл коза против человека, который IgG проспряганное с Alexa Fluor 594 (1:1, 000 разрежения в PBST) для каждой скважины и инкубировать пластину культуры на RT с нежным встряхивания в течение 1 ч.
  9. Аспирационная анти человека коза, IgG проспряганное с Alexa Fluor 594 решения и мыть каждый хорошо с 200 мкл PBST три раза.
  10. Добавьте 100 мкл раствора глицерина (50% глицерина в PBS и картирование по 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)) в каждой скважине.
  11. Наблюдать и изображения клетки под микроскопом флуоресцентные, используя 10 X окуляр и 4 X и 10 X 20 X целей.
    Примечание: Используйте правильный фильтр для каждой краски: для NR1-ГФП (возбуждение/выбросов = 482/502 Нм), для Alexa Fluor 594 (возбуждения/выбросов = 561/594 Нм), для DAPI (возбуждения/выбросов = 358/461 Нм). Проводить отрицательный контроль с использованием клеток ГЭС, выражая GFP таким же образом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В среднем мы могли бы получить 200-300 мкг эндотоксина свободного выражения плазмида NR1-GFP и GFP от 250 мл бактериальной культуры после процедур, описанных в разделе 1 этого протокола. Количество 100 нг/колодец выражение плазмида была использована для transfection клетки HEK293, культивируемых в пластину 48-Ну, как описано в разделе 2 протокола. 24-30 h после transfection клетки выразил NR1-GFP и GFP рекомбинантных белков может быть обнаружен под флуоресцентный Микроскоп.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Есть несколько на основе ячеек иммунологические анализы на экране наличие аутоантител против NMDA рецепторы, сообщили в литературе, включая живой на основе ячеек иммунофлюоресценции пробирного11, фиксированный на основе ячеек иммунофлюоресценции Пробирная9 , и на основе цитометрии потока проба14. Жить на основе ячеек иммунофлюоресценции assay должны выполняться вскоре после подготовки клетки ectopically выражая NR1 белка, в то время как на основе цит...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Чжан Гун медицинский фонд (номер гранта CMRPG3C1771, CMRPG3C1772, CMRPG3E0631, CMRPG3E0632 и CMRPG3E0633).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
GRIN1 (GFP-меченый) - глутаматный рецептор человека, ионотропный, N-метил-D-аспартат 1 (GRIN1), вариант транскрипта NR1-1Origene (Роквилл, Мэриленд, США)RG219368клон NR1-кДНК, меченный С-концевыми последовательностями tGFP
pCMV6-AC-GFPOrigene (Роквилл, Мэриленд, США)PS100010вектор млекопитающих с С-концевой меткой tGFP EndoFree
Plasmid Maxi KitQiagen (Hilden, Германия)12362
Липофектамин 2000 Реагент для трансфекцииInvitrogen (Carlsbad, CA, США)11668-019
Opti-MEM I Восстановленная сывороткаMedium Thermo Fisher31985-070
DMEM, с высоким содержанием глюкозы, пируватThermo Fisher11995-065
Характеристика фетальной сыворотки крупного рогатого скота, происхождение из СШАGE Healthcare Life SciencesSH30071.01
Вторичное антитело козы против человека IgG (H+L), конъюгат Alexa Fluor 594Thermo FisherA-11014
Положительный контроль: антиглутаматный рецептор (тип NMDA)Euroimmun AG, Lü beck,Германия CA 112d-0101
Euroimmun Набор
для анализа

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Linnoila, J. J., Rosenfeld, M. R., Dalmau, J. Neuronal surface antibody-mediated autoimmune encephalitis. Semin Neurol. 34 (4), 458-466 (2014).
  2. Lancaster, E. The diagnosis and treatment of autoimmune Encephalitis. J Clin Neurol. 12 (1), 1-13 (2016).
  3. Pruss, H., et al. Retrospective analysis of NMDA receptor antibodies in encephalitis of unknown origin. Neurology. 75 (19), 1735-1739 (2010).
  4. Leypoldt, F., Armangue, T., Dalmau, J. Autoimmune encephalopathies. Ann N Y Acad Sci. 1338, 94-114 (2015).
  5. Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurol. 7 (12), 1091-1098 (2008).
  6. Titulaer, M. J., et al. Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study. Lancet Neurol. 12 (2), 157-165 (2013).
  7. Chapman, M. R., Vause, H. E. Anti-NMDA receptor encephalitis: diagnosis, psychiatric presentation, and treatment. Am J Psychiatry. 168 (3), 245-251 (2011).
  8. Gable, M., Glaser, C. Anti-n-methyl-d-aspartate receptor encephalitis appearing as a new-onset psychosis: disease course in children and adolescents within the california encephalitis project. Pediatr Neurol. 72, 25-30 (2017).
  9. Dalmau, J., Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Rosenfeld, M. R., Balice-Gordon, R. Clinical experience and laboratory investigations in patients with anti-NMDAR encephalitis. Lancet Neurol. 10 (1), 63-74 (2011).
  10. Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Ann Neurol. 61 (1), 25-36 (2007).
  11. Irani, S. R., et al. N-methyl-D-aspartate antibody encephalitis: temporal progression of clinical and paraclinical observations in a predominantly non-paraneoplastic disorder of both sexes. Brain. 133 (Pt 6), 1655-1667 (2010).
  12. Suh-Lailam, B. B., Haven, T. R., Copple, S. S., Knapp, D., Jaskowski, T. D., Tebo, A. E. Anti-NMDA-receptor antibody encephalitis: performance evaluation and laboratory experience with the anti-NMDA-receptor IgG assay. Clin Chim Acta. 421, 1-6 (2013).
  13. Mayer, M. L. Structural biology of glutamate receptor ion channel complexes. Curr Opin Struct Biol. 41, 119-127 (2016).
  14. Ramberger, M., et al. Comparison of diagnostic accuracy of microscopy and flow cytometry in evaluating n-methyl-d-aspartate receptor antibodies in serum using a live cell-based assay. PLoS One. 10 (3), e0122037(2015).
  15. Wandinger, K. P., Saschenbrecker, S., Stoecker, W., Dalmau, J. Anti-NMDA-receptor encephalitis: a severe, multistage, treatable disorder presenting with psychosis. J Neuroimmunol. 231 (1-2), 86-91 (2011).
  16. Dahm, L., et al. Seroprevalence of autoantibodies against brain antigens in health and disease. Ann Neurol. 76 (1), 82-94 (2014).
  17. Jézéquel, J., et al. Cell- and single molecule-based methods to detect anti-n-methyl-d-aspartate receptor autoantibodies in patients with first-episode psychosis from the OPTiMiSE project. Biol Psychiatry. , (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

HEK293NR1 GFPPBSTDAPI

Похожие статьи