Мы ectopically выразил NR1 Субблок NMDA-рецепторов, отмеченных Зеленый флуоресцирующий белок в человеческих эмбриональных клеток (HEK293) как антиген для выявления аутоантител против NMDA-рецепторов в крови пациентов с подозрением с аутоиммунным энцефалита. Этот простой метод могут быть пригодны для скрининга целей в клинических условиях.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Assay простой Cell-based иммунофлюоресценции для выявления аутоантител против рецептора N-метил D-аспартат (NMDA) в крови
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Наличие Анти NMDA-рецептора аутоантител может вызвать различные Психоневрологическая симптомы в пострадавших пациентов, называется Анти NMDA рецепторы аутоиммунных энцефалита. Выявление конкретных аутоантител против NMDA-рецепторов в крови и спинномозговой жидкости (CSF) имеет важное значение для точной диагностики данного состояния. NMDA-рецепторов является ионный канал комплекс белков, который содержит четыре подразделения, включая два обязательных NMDA рецепторы Субблок 1 (NR1) и один или два NMDA-рецептора Субблок 2A (NR2A), NMDA рецепторы Субблок 2B (NR2B), NMDA рецепторы субъединица 2C (NR2C), или NMDA-рецептора Субблок 2D (NR2D). Эпитоп Анти NMDA-рецептора аутоантител было сообщено присутствовать на внеклеточные N-концевой домен NR1 субъединицы NMDA-рецептора. Цель этого исследования заключается в разработке простой на основе ячеек иммунофлюоресценции assay, который может использоваться в качестве скрининг-тест для обнаружения аутоантител против NR1 Субблок NMDA-рецепторов в крови для облегчения клинических и базовые исследования Анти NMDA рецепторы аутоиммунных энцефалит.
Введение
Анти-NMDA рецепторы аутоиммунных энцефалита — недавно признанных болезни сущность, которая может возникнуть у пациентов всех возрастов и влияет на преимущественно женские пациенты1,2. Это один из наиболее часто диагноз энцефалита среди пациентов с первоначальных неизвестной этиологии энцефалита3. Больных, пострадавших с Анти NMDA-рецептора энцефалита обычно имеют продромальный симптомы головной боли или лихорадки, а затем быстрое развитие изменения уровня сознания и множество острых нервно-психических симптомов, включая возбуждение, раздражительность , тревога, бессонница, галлюцинации, бред, агрессии, причудливых поведений, движение аномалии, вегетативной регуляции и захват нападения4,5. Раннее распознавание этого состояния и своевременного лечения с иммунотерапия являются важными для лучший результат и даже полного восстановления в пострадавших пациентов6. Следовательно предполагается, что Анти NMDA рецепторы аутоиммунных энцефалита следует считать важным дифференциальной диагностики пациентов с острой или новое наступление психотического функции7,8.
Помимо клинических особенностей выявление аутоантител против NMDA-рецепторов в крови и спинномозговой жидкости имеет важное значение для точной диагностики Анти NMDA рецепторы аутоиммунных энцефалита9. Большинство из иммунологических тестов для обнаружения Анти NMDA рецепторных аутоантитела доступны в нескольких научно-исследовательских лабораториях10,11, и есть только один assay коммерчески доступных на основе ячеек иммунофлюоресценции для скрининга Анти NMDA-рецептора аутоантител12. Цель этого исследования заключается в разработке простой собственными силами на основе ячеек иммунофлюоресценции assay, который может быть удобно использовать в лаборатории для проверки наличия Анти NMDA рецепторы аутоантител для облегчения клинических исследований Анти NMDA-рецептора аутоиммунная энцефалит. NMDA-рецепторов — это heterotetramer ионный канал комплекс белков конкретно выражена в головном мозге. Он изготовлен из двух обязательных NR1 субблоков и сочетание одной или двух подразделений NR2A, NR2B, NR2C или NR2D13. Предыдущие исследования сообщили, что в внеклеточной N-концевой домен NR1 Субблок5основные epitope мишенью антитела. Следовательно в этом протоколе, мы выражаем человеческий рекомбинантный белок NR1-Субблок NMDA-рецептора, отмеченных Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) в строке эпителиальных клеток человеческого эмбриона почек (HEK293) и разработать на основе ячеек иммунофлюоресценции проба для выявления класса IgG Анти NMDA рецепторы аутоантител в крови.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Это исследование было одобрено институциональных обзора Совет из Чанг Gung Мемориальный госпиталь в Linkuo, Таоюань, Тайвань (102-2577A3).
1. Подготовка NR1-GFP выражение плазмиды
- Смесь 10 нг NR1-GFP плазмида с 100 мкл сведущие клетки штамма кишечной палочки DH5α в стерильных 1,5 мл центрифуга трубки, накапайте смесь осторожно вверх и вниз 4 - 6 раз и инкубировать трубку на льду за 20 мин.
- Инкубировать трубки при 42 ° C за 1 мин на водяной бане, извлеките трубку из водяной бани, добавить 1 мл lysogeny бульон (LB) среднего в трубку и инкубировать трубки при 37 ° C в инкубаторе с встряхивания в течение 1 ч.
- Распространения 50 мкл смесь на плиту LB агар, содержащий ампициллина (0,1 мг/мл) и инкубировать пластину агар фунтов при 37 ° C в инкубаторе одночасье.
- Выбрать один колонии от ночи LB агар пластины с помощью стерильных кончика, и вихрем кончиком в в бактериальной культуры трубка, содержащая 5 мл LB средних и ампициллин (0,1 мг/мл). Инкубируйте трубки при 37 ° C в инкубаторе с встряхивания на ночь.
- Аликвота 3 мл ночи бактериальной культуры в 500 мл флакон, содержащий 250 мл стерильного LB среднего и ампициллин (0,1 мг/мл). Инкубируйте настой при 37 ° C при встряхивании. Регулярно проверяйте оптической плотности (OD) бактериальной культуры на длине волны 600 нм с помощью спектрометра, до тех пор, пока OD600 достигает 0,6-1,0.
Примечание: Смешайте хорошо 800 мкл ночи бактериальной культуры с 200 мкл глицерин подготовить глицерин запас и хранить запас глицерина до-80 ° C для использования в будущем. - Подготовить NR1-GFP выражение плазмид бактериальной культуры 250 мл
- Собирать клетки центрифугированием при 6000 x g 15 мин при 4 ° C.
- Ресуспензируйте Пелле бактерий в 10 мл ресуспендирования буфер, содержащий РНКазы A; Вихрь тщательно до тех пор, пока не комок рассматривается.
- Добавить 10 мл буфера lysis бактерий подвеска, нежно инвертировать смесь 4 - 6 раз и инкубировать lysate при комнатной температуре (RT) за 5 мин.
- Добавить 10 мл предварительно охлажденные осадков буфера lysate, осторожно перевернуть смесь 4 - 6 раз.
- Залить lysate в ствол картриджа фильтра с крышкой; Подождите 10 минут на RT.
- Снимите колпачок с напорный патрубок картриджа, вставьте картридж поршень и осторожно нажмите на поршень. Собирать отфильтрованных lysate в 50 мл трубки.
- Добавить 2,5 мл несвободных буфер от производителя для отфильтрованных lysate, перемешать смесь, инвертирование трубки примерно в 10 раз и инкубировать смесь на льду за 30 мин.
- Применить отфильтрованные lysate смесь в столбец Фильтр, который был предварительно достижение равновесного уровня с 10 мл уравновешивания буфера. Разрешить столбце для слива самотеком.
- Промойте колонку с 30 мл буфера мыть дважды, а затем элюировать ДНК из столбца с помощью 15 мл Элюирующий буфер.
- Добавить 10,5 мл (0,7 томов) изопропанол eluted дна буфер, хорошо перемешать и центрифуги смеси на 20000 x г за 30 мин при 4 ° C.
- Осторожно декантируют супернатанта, раз помыть лепешка ДНК с 5 мл эндотоксинов бесплатно 70% этанол и центрифуги на 20000 x g за 10 мин.
- Декант супернатанта, сухие гранулы для 5-10 мин в химические вытяжки и растворяют гранулы в 300-500 мкл буфера эндотоксинов бесплатно.
- Определите концентрацию плазмиды путем измерения поглощения раствора УФ 260/280 Нм, используя спектрофотометр.
Примечание: Подготовьте выражение плазмида GFP, используя тот же протокол.
2. transfection клеток HEK293 с NR1-GFP выражение плазмиды
- Аликвота 200 мкл раствора желатина 2% каждому хорошо плиты 48-ну культуры и инкубировать пластины при 37 ° C по меньшей мере 30 мин.
- Аспирационная раствор желатина из клеток 5 х 104 HEK293 хорошо и семян в 200 мкл клеток питательной среды, содержащие 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) в каждом хорошо. Инкубируйте пластины при 37 ° C в увлажненные инкубатора, поставляется с 5% CO2 на ночь.
Примечание: Клетки были подсчитаны с помощью Горяева. - На следующий день, заменить отработанного питательной среды с 200 мкл свежей питательной среды, содержащие 10% FBS в колодец.
- Для каждого отдельного хорошо, подготовить раствор А, смешивая 100 нг NR1-tGFP плазмиду с 20 мкл питательной среды и B решение путем смешивания 0,8 мкл Реагента трансфекции с 20 мкл питательной среды. Умножьте количество скважин, необходимо подготовить общий объем для каждого эксперимента.
- Готовят раствор C, смешивая A и B и инкубировать смеси на RT для 20-30 мин.
- Аликвота 40 мкл раствора C для каждой хорошо содержащие клетки HEK293, вихревой мягко пластину и инкубировать пластины при 37 ° C в увлажненные инкубатора, поставляется с 5% CO2 на ночь.
- Проверьте в выражении NR1-GFP рекомбинантных белков в клетки хозяина под флуоресцентный микроскоп с увеличением 40 X-200 X (возбуждения/выбросов: 482/502 Нм) и провести пробу на основе ячеек иммунофлюоресценции.
Примечание: Transfect плазмиды выражение гена GFP в HEK293 клетки, используя тот же протокол.
3. cell-based иммунофлюоресценции Assay
- Аспирационная отработанного среднего из скважин, затем промыть каждой скважины с 200 мкл фосфата буфер солевой (PBS), три раза.
- Добавить 200 мкл раствора параформальдегида 4% в каждой скважине; Инкубируйте пластину в РТ за 15 мин.
- Аспирационная параформальдегида решение из скважин и мыть каждый хорошо с 200 мкл PBS три раза.
- Добавить 200 мкл 10% обезжиренного молока в PBST (0.1% Tween-20 в PBS) решение каждой хорошо и инкубировать пластину на RT 1 h с нежным встряхивания.
- Аспирационная 10% обезжиренное молоко в PBST растворе из колодца, а затем промыть лунки с 200 мкл PBST раз.
- Инкубируйте скважин с разбавленной плазмы (1: 100 в PBST) как основного антитела с нежным тряски в РТ за 1 ч.
Примечание: Плазма получается из крови пациентов, предположительно имеют аутоиммунные энцефалита. - Аспирационная разбавленной плазмы из скважин и мыть каждый хорошо с 200 мкл PBST три раза.
- 200 мкл коза против человека, который IgG проспряганное с Alexa Fluor 594 (1:1, 000 разрежения в PBST) для каждой скважины и инкубировать пластину культуры на RT с нежным встряхивания в течение 1 ч.
- Аспирационная анти человека коза, IgG проспряганное с Alexa Fluor 594 решения и мыть каждый хорошо с 200 мкл PBST три раза.
- Добавьте 100 мкл раствора глицерина (50% глицерина в PBS и картирование по 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)) в каждой скважине.
- Наблюдать и изображения клетки под микроскопом флуоресцентные, используя 10 X окуляр и 4 X и 10 X 20 X целей.
Примечание: Используйте правильный фильтр для каждой краски: для NR1-ГФП (возбуждение/выбросов = 482/502 Нм), для Alexa Fluor 594 (возбуждения/выбросов = 561/594 Нм), для DAPI (возбуждения/выбросов = 358/461 Нм). Проводить отрицательный контроль с использованием клеток ГЭС, выражая GFP таким же образом.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В среднем мы могли бы получить 200-300 мкг эндотоксина свободного выражения плазмида NR1-GFP и GFP от 250 мл бактериальной культуры после процедур, описанных в разделе 1 этого протокола. Количество 100 нг/колодец выражение плазмида была использована для transfection клетки HEK293, культивируемых в пластину 48-Ну, как описано в разделе 2 протокола. 24-30 h после transfection клетки выразил NR1-GFP и GFP рекомбинантных белков может быть обнаружен под флуоресцентный Микроскоп.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Есть несколько на основе ячеек иммунологические анализы на экране наличие аутоантител против NMDA рецепторы, сообщили в литературе, включая живой на основе ячеек иммунофлюоресценции пробирного11, фиксированный на основе ячеек иммунофлюоресценции Пробирная9 , и на основе цитометрии потока проба14. Жить на основе ячеек иммунофлюоресценции assay должны выполняться вскоре после подготовки клетки ectopically выражая NR1 белка, в то время как на основе цит...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Эта работа была поддержана Чжан Гун медицинский фонд (номер гранта CMRPG3C1771, CMRPG3C1772, CMRPG3E0631, CMRPG3E0632 и CMRPG3E0633).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| GRIN1 (GFP-меченый) - глутаматный рецептор человека, ионотропный, N-метил-D-аспартат 1 (GRIN1), вариант транскрипта NR1-1 | Origene (Роквилл, Мэриленд, США) | RG219368 | клон NR1-кДНК, меченный С-концевыми последовательностями tGFP |
| pCMV6-AC-GFP | Origene (Роквилл, Мэриленд, США) | PS100010 | вектор млекопитающих с С-концевой меткой tGFP EndoFree |
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Hilden, Германия) | 12362 | |
| Липофектамин 2000 Реагент для трансфекции | Invitrogen (Carlsbad, CA, США) | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Восстановленная сыворотка | Medium Thermo Fisher | 31985-070 | |
| DMEM, с высоким содержанием глюкозы, пируват | Thermo Fisher | 11995-065 | |
| Характеристика фетальной сыворотки крупного рогатого скота, происхождение из США | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Вторичное антитело козы против человека IgG (H+L), конъюгат Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher | A-11014 | |
| Положительный контроль: антиглутаматный рецептор (тип NMDA) | Euroimmun AG, Lü beck, | Германия CA 112d-0101 | |
| Euroimmun Набор |
Ссылки
- Linnoila, J. J., Rosenfeld, M. R., Dalmau, J. Neuronal surface antibody-mediated autoimmune encephalitis. Semin Neurol. 34 (4), 458-466 (2014).
- Lancaster, E. The diagnosis and treatment of autoimmune Encephalitis. J Clin Neurol. 12 (1), 1-13 (2016).
- Pruss, H., et al. Retrospective analysis of NMDA receptor antibodies in encephalitis of unknown origin. Neurology. 75 (19), 1735-1739 (2010).
- Leypoldt, F., Armangue, T., Dalmau, J. Autoimmune encephalopathies. Ann N Y Acad Sci. 1338, 94-114 (2015).
- Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurol. 7 (12), 1091-1098 (2008).
- Titulaer, M. J., et al. Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study. Lancet Neurol. 12 (2), 157-165 (2013).
- Chapman, M. R., Vause, H. E. Anti-NMDA receptor encephalitis: diagnosis, psychiatric presentation, and treatment. Am J Psychiatry. 168 (3), 245-251 (2011).
- Gable, M., Glaser, C. Anti-n-methyl-d-aspartate receptor encephalitis appearing as a new-onset psychosis: disease course in children and adolescents within the california encephalitis project. Pediatr Neurol. 72, 25-30 (2017).
- Dalmau, J., Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Rosenfeld, M. R., Balice-Gordon, R. Clinical experience and laboratory investigations in patients with anti-NMDAR encephalitis. Lancet Neurol. 10 (1), 63-74 (2011).
- Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Ann Neurol. 61 (1), 25-36 (2007).
- Irani, S. R., et al. N-methyl-D-aspartate antibody encephalitis: temporal progression of clinical and paraclinical observations in a predominantly non-paraneoplastic disorder of both sexes. Brain. 133 (Pt 6), 1655-1667 (2010).
- Suh-Lailam, B. B., Haven, T. R., Copple, S. S., Knapp, D., Jaskowski, T. D., Tebo, A. E. Anti-NMDA-receptor antibody encephalitis: performance evaluation and laboratory experience with the anti-NMDA-receptor IgG assay. Clin Chim Acta. 421, 1-6 (2013).
- Mayer, M. L. Structural biology of glutamate receptor ion channel complexes. Curr Opin Struct Biol. 41, 119-127 (2016).
- Ramberger, M., et al. Comparison of diagnostic accuracy of microscopy and flow cytometry in evaluating n-methyl-d-aspartate receptor antibodies in serum using a live cell-based assay. PLoS One. 10 (3), e0122037(2015).
- Wandinger, K. P., Saschenbrecker, S., Stoecker, W., Dalmau, J. Anti-NMDA-receptor encephalitis: a severe, multistage, treatable disorder presenting with psychosis. J Neuroimmunol. 231 (1-2), 86-91 (2011).
- Dahm, L., et al. Seroprevalence of autoantibodies against brain antigens in health and disease. Ann Neurol. 76 (1), 82-94 (2014).
- Jézéquel, J., et al. Cell- and single molecule-based methods to detect anti-n-methyl-d-aspartate receptor autoantibodies in patients with first-episode psychosis from the OPTiMiSE project. Biol Psychiatry. , (2017).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
