Оценка развития тканей в перелом каллуса во время endochondral кости Исцеление имеет важное значение для мониторинга процесса заживления. Здесь, мы приводим использование магнитно-резонансной томографии (МРТ)-совместимых внешних фиксаторов для мыши бедренной разрешить МРТ сканирование во время регенерации костной ткани у мышей.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В естественных условиях Оценка развития каллуса перелом кости Исцеление у мышей с использованием МРТ совместимое устройство остеосинтеза для мыши бедренной
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Endochondral заживление перелома — сложный процесс, связанных с развитием фиброзной, хрящевой и костной ткани в перелом каллуса. Количество различных тканей в каллуса предоставляет важную информацию о перелом, исцеление прогресса. Доступные в vivo методы продольно контролировать развитие каллусной ткани в доклинических исследованиях заживление перелома с помощью мелких животных включают в себя цифровой радиографии и µCT томографии. Однако обе методики только способны различать минерализованных и не минерализованных ткани. Следовательно невозможно подвергать хряща из фиброзной ткани. В противоположность этому магнитно-резонансная томография (МРТ) визуализирует анатомических структур, основанных на их содержание воды и поэтому сможет неинвазивно идентифицировать мягкие ткани и хрящей в перелом каллуса. Здесь мы сообщают об использовании МРТ совместимых внешних фиксаторов для мыши бедренной разрешить МРТ во время регенерации костной ткани у мышей. Эксперименты показали, что фиксатором и заказ монтажа устройства позволяют повторяющихся МРТ, таким образом позволяя продольного анализа разрушения каллусной ткани развития.
Введение
Заживление перелома вторичные является наиболее распространенной формой заживления кости. Это сложный процесс, подражая конкретные аспекты онтогенезе endochondral окостенение1,2,3. Начале перелом гематома преимущественно состоит из иммунных клеток, грануляция и фиброзной ткани. Напряжения низкой кислорода и высокой биомеханической штаммов препятствовать остеобластов дифференциации на перелом разрыв, но содействовать дифференцировка клеток-предшественников в хондроцитов4,5,6. Эти клетки начинают размножаться в месте травмы сформировать матрицу хрящевой, предоставляя первоначальный стабильность перелом кости. Во время созревания каллуса, хрящевые клетки становятся гипертрофических, проходят apoptosis, или транс-дифференцироваться в остеобластов. Неоваскуляризация в хряща и кости переходной зоне обеспечивает уровни повышенных кислорода, позволяя формирования костной ткани7. После костлявые сокращение разрыва перелом, биомеханические стабильности увеличивается и osteoclastic реконструкции внешнего перелом каллуса происходит получить физиологические кости контур и структура3. Таким образом количество волокнистых, хрящевой и костной ткани в перелом каллуса обеспечивают важную информацию о Кость заживление процесса. Нарушается или задержки исцеления становится видимым путем изменения каллусной ткани развития людей и мышей8,9,10,11. Доступные в vivo методы продольно мониторинга развития каллусной ткани в доклинических перелом, исцеление исследования с использованием мелких животных включают в себя цифровой радиографии и µCT изображений12,13. Однако оба методы только способны различать минерализованных и не минерализованных ткани. В противоположность этому МРТ обеспечивает отличную мягких тканей контраст и поэтому сможет идентифицировать мягкие ткани и хрящей в перелом каллуса.
Предыдущие работы показали многообещающие результаты для послеубойной МРТ в мышах суставных переломов14 и в естественных условиях МРТ в мышей во время intramembranous дефект кости Исцеление15. Однако оба исследования также заявил ограниченного пространственного контраст резолюции и тканей. Мы ранее продемонстрировал осуществимость с высоким разрешением в vivo МРТ для продольной оценки формирования мягких мозолей в мышиных endochondral перелом, исцеление16. Здесь мы приводим протокол для использования МРТ совместимых внешних фиксаторов для остеотомия бедра у мышей с целью мониторинга развития каллусной ткани продольно во время процесса заживления перелома endochondral. Дизайн на заказ монтажа устройства для вставки внешних фиксаторов обеспечивает стандартизированный позицию во время повторного сканирования.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
всех животных эксперименты соблюдение международных правил для ухода и использования лабораторных животных и были утверждены региональными регулирующими органами (№ 1250, Regierungspräsidium Тюбинген, Германия). Все мыши были сохранены в группах от двух до пяти животных в клетке на свет 14-h, 10 h темные Циркадный ритм с водой и продовольствием предоставляемых ad libitum.
1. Подготовка хирургическими материалами и предварительной обработки мышей
- Стерилизируй-отпусти всех хирургических материалов. Используйте автоклавирования температуры 120-135 ° C для 20-30 минут времени стерилизации.
- Покупка C57BL/6 мышей или мышей от другого напряжения, которые находятся между 19-35 g массы тела. Выполните соответствующий уход за животными и экспериментальные протоколы в соответствии с национальные руководящие принципы, одобренные следователем ' s институциональный уход за животными и использования Комитетом. Разрешить минимум 7 дней периода акклиматизации перед началом процедуры.
- Предоставить обезболивание всех мышей через питьевой воды за день до операции до третьего послеоперационные сутки.
2. Хирургические процедуры и применения внешних фиксаторов
- место, мышь в трубку с предустановленной 5-7% изофлюрановая и 60 мл/мин кислорода. После потери постуральной рефлексов удалите мышь из трубки индукции анестезии и поддержания анестезии через вдыхание маска выделения кислорода изофлюрановая и 60 мл/мин 1-3%.
Рефлекс
- Монитор дыхания шаблон и задние лапы во время анестезии. Убедитесь, что частота дыхания составляет около 100 циклов/мин и задние лапы рефлекс отсутствует.
Примечание: количество газа, необходимо зависит от возраста, пола, веса тела и штамм мыши.
- Монитор дыхания шаблон и задние лапы во время анестезии. Убедитесь, что частота дыхания составляет около 100 циклов/мин и задние лапы рефлекс отсутствует.
- До операции, вводить мышь с однократной дозы антибиотиков подкожно (Клиндамицин, 45 мг/кг). Кроме того, для поддержания физиологических баланс жидкости, вводить мышь с подкожной жидкости депо 500 мкл концентрированного солевого раствора (0,9% NaCl).
- Для предотвращения роговицы сушки, применять глазную мазь для мыши глаз. Поместите указатель мыши на нагревательной пластинки при 37 ° C во время анестезии и температуры тела хирургические процедуры для поддержания физиологических.
- Удалить мех из правой задних конечностей и кустарников области хирургического дезинфицирующим средством на основе спирта. Охватывать право задние лапы с небольшой частью стерильные перчатки во избежание нестерильные областей. Вылечить правый задние конечности в три раза. Место стерильные драпировка над всей мышь за исключением области хирургической.
- Надрезать кожу около 1 см продольно вдоль передней стороне правой бедренной кости с помощью скальпеля. Отдельные тупо м. Двуглавая мышца бедра и m. мышц бедра с микро ножниц и пинцет. Вырежьте сухожилие Стороной происхождения на вертела бедренной кости с микро ножницами, чтобы позволить свободный доступ к передне-боковой части кости. Убедитесь, что сохраняется седалищный нерв.
- Позиция внешних фиксаторов (Осевая жесткость 3 Н/мм, рис. 1 A) параллельно к бедренной кости. Бурение скважин через кору с 0,45 мм сверло и место керамической монтажные штыри в скважин вручную. Начните с наиболее проксимальной ПИН, следуют наиболее дистальных PIN-код и два контакта между ними.
- Убедитесь, что нет напряженности, сжатие или касательное напряжение на поясничный во время процедуры установки, в противном случае достигнутые остеотомия разрыв будет недостаточно из-за релаксации фиксаторов.
- Увлажнить кости с небольшим количеством стерильных NaCl, чтобы избежать обезвоживания во время распиловки процедуры.
- Создать 0,4 мм остеотомия через всю кость между двух внутренних контактов с помощью проволока пила Джильи 0.4 мм.
Примечание: При необходимости, колеблющегося микро пила может использоваться для создания остеотомии. Убедитесь в том избежать любой металлической стружки от пилы в районе остеотомия. - Флеш разрыв остеотомия тщательно с 2 мл стерильного NaCl для удаления кости фишек между двумя трещиноватых коре.
- Адаптации мышцы с помощью непрерывного шва с рассасывающимся швом (см. Таблицу материалы). Затем адаптировать кожи, используя прерванный не рассасывающиеся швы (см. Таблицу материалы). Чтобы избежать раны кусаться, не место шва в черепной частью раны.
Примечание: Не используйте клей кожи или клипы, так как мыши обычно удалить его из раны вызывая дальнейшее повреждение кожи. - Чистой зоне хирургические с дезинфицирующим и поместите курсор мыши в его клетке. монитор, мышь и питания достаточно тепла (например, инфракрасный свет) пока она полностью проснуться. контролировать воды, пищи и веса тела после операции, чтобы Убедитесь, что животное не в боль и страдания. Оказывать анальгезии всех мышей через питьевую воду до третьего послеоперационные сутки.
Примечание: Мышей могут быть размещены в группах до четырех животных. - Контролировать мышь ' активность на 1 до 5 дней после операции. В течение этого времени курс мышь должна нести вес на эксплуатируемых конечности. В противном случае, мыши должны быть исключены из дальнейшего анализа.
3. МРТ процедуры и анализ изображений
- перед МРТ сканирование процедуры, обезболивают мыши согласно протоколу в шагах 2.1 и 2.3 и держать частоту дыхания около 100 циклов/мин вставки внешних фиксаторов на правой задних конечностей из мышь, тщательно в устройство на заказ монтажа ( рис. 1 B, C).
- Убедитесь избежать изгиба или сжатие фиксаторов во время этого шага, так как это может помешать заживление перелома.
Примечание: МРТ может проводиться 3 дней после операции, в зависимости от ухода за животными и экспериментальный протокол в кратчайшие сроки.
- Убедитесь избежать изгиба или сжатие фиксаторов во время этого шага, так как это может помешать заживление перелома.
- Место мыши на контролируемой температуре колыбель для введения в устройство МРТ. Прикрепить устройство крепления жестко четырех элементов головки катушки.
- Приобрести МРТ данных с использованием специализированной системы МРТ малых животных высокой поле, работающих на 11,7 т.
Примечание: МРТ данных приобретение геометрия совмещена с бедренной кости, ортогонально к винты.- Приобретать данные, применяя Протон плотность последовательности TSE жир подавлены многослойная (PD-TSE) с помощью приобретения параметры: эхо/повторение время TE = 5,8 МС/TR = 2500 ms, резолюция Δr = 52 × 52 × 350 µm³, поле зрения (FOV) = 20 × 20 мм² и пропускной способности Δω = 150 кГц.
- Примечание: Общая приобретение время 22 фрагментов составляет 36 мин
- Открыть полученные данные с программным обеспечением анализа изображения. Введите размер voxel как 0.05 x 0.05 x 0,35 мм 3. Сегмент различных тканей в каллуса перелом (кости, хрящи, фиброзной ткани/костного) основанный на их интенсивность с полуавтоматической Бинаризация следующим.
- Нажмите " редактировать новое поле метки ", нажмите " добавить материал " и переименовать материал для " мозоль ". Выделить области каллуса от окружающих тканей, основанные на гипо интенсивный сигнал от надкостницы с помощью " Лассо " инструмент.
- Нажмите " добавить материал ". Нажмите кнопку " добавить материал " и переименовать материал для " хряща ". Сегмент хряща с помощью " порог " инструмент и " выбрать только текущий материал " от " мозоль ". Нажмите кнопку " хряща " и " добавить материал ". Повторите эти шаги с " кость " и " костного мозга/фиброзной ткани ".
- Генерировать 3D реконструкций перелом бедра, основанный на данных сегментации ткани, с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Нажмите кнопку " создавать поверхности ", применить " ни " для " сглаживания типа " и нажмите " вид поверхности ".
Примечание: Очень маленькие, гипер интенсивный, окрестности enDS трещиноватых коре, вероятно быть артефакты из-за переход от костлявые мягких тканей. Эти районы должны быть исключены из дальнейшего анализа. Hyper интенсивный областям в середине перелом мозоль на этапе endochondral перелом, исцеление представляют хрящевой ткани. Гипо интенсивный областям на каллуса перелом дистальной остеотомия разрыв на этапе endochondral окостенения и районы с той же интенсивностью на протяжении всей разрушения каллуса на позднее исцеление этапы представляют собой новообразованной костной каллусной ткани. Хотя эти области имеют гипо интенсивный сигнал, интенсивность сигнала от зрелых кости (кора) еще ниже. После порога интенсивности сигнала для костной ткани и хрящевой ткани в перелом каллуса Марк оставшихся ткани как костного мозга и фиброзной ткани. Значения для сегментации ткани: сегментирована костной ткани (включая пожилые коры, Трабекулярная кость и костлявые каллусной ткани) в диапазоне 1-3.3 (сигнал нормализованные интенсивности зрелых коры), костного мозга/фиброзной ткани в диапазоне от 3,4-5.4, и Хрящевые каллусной ткани в пределах 5,5-6.2. - Если необходимо, повторите МРТ продольно во время процесса заживления переломов. Для мониторинга хрящевой каллуса развития, сканировать мышей на дней 10, 14 и 21 после хирургии.
Примечание: Моменты времени может зависеть от ухода за животными и экспериментальный протокол.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Во-первых успех хирургической процедуры могут быть подтверждены анализ МРТ (см. пример на рис. 2). Все четыре булавки должен быть расположен в середине бедра вала. Размер остеотомия зазор должен быть между 0,3-0,5 мм. Если размер остеотомия разрыв варьируется от этих значений, мыши должны быть исключены из дальнейшего анализа.
Во-вторых оценки Продольное сканирование во время разрушения, заживление ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Модификации и устранения неполадок:
Основной целью данного исследования было описать протокол для использования МРТ совместимых внешних фиксаторов для остеотомия бедренной кости в мыши с возможностью мониторинга развития каллусной ткани продольно во время процесса заживления переломов endochondral. Дизайн на заказ монтажа устройства для вставки внешних фиксаторов обеспечивает стандартизированный позицию во время повторного сканирования. Полуавтоматический ткани Сегментация поз...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Автор Романо Маттус является сотрудником RISystem AG Давос, Швейцария, которая производит имплантатов и имплантировать конкретные инструменты, используемые в этой статье. Все другие авторы имеют без финансовых интересов.
Благодарности
Мы благодарим Севиль Essig, Stefanie шрот, Верена Фишер, Katja Prystaz, Ивонн Hägele и Энн Subgang за отличную техническую поддержку. Мы также благодарим немецкого фонда научных исследований (CRC1149, INST40/499-1) и Германии AO травмы фонд для финансирования этого исследования.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Анестезиологическая трубка | FMI, Зеехайм, Германия | ZUA-82-ANA-TUB-Мышиный | |
| наркозный аппарат | FMI, Зеехайм, Германия | ZUA-82-GME-MA | |
| Артериальный щипцы | Aesculap, Туттлинген, Германия | BH104R | |
| Autoclave | Systec, Веттенберг, Германия | DX-150 | |
| Автоклавная упаковка | Stericlin, Фойхтванген, Германия | 2301-04/06/10/12/16 | |
| Avizo software | FEI, Берлингтон, США-Версия | 8.0.1 | |
| BioSpec 117/16 Система магнитно-резонансной томографии BioSpec 117/16 | Bruker Biospin, Эттлинген, Германия | 117/16 | |
| Бульдог зажим | Aesculap, Туттлинген, Германия | BH 021R | |
| Скальпель из углеродистой стали No 11/15 | Aesculap, Туттлинген, Германия | BA211/215 | |
| Керамический монтажный штифт 0,45 мм | RISystem, Давос, Швейцария | HS691490 | |
| Клиндамицин (300 мг / 2мл) | Ratiopharm, Ульм, | Германия-Перевязочные | |
| щипцы 115 мм | Aesculap, Туттлинген, Германия | BD210R | |
| Щипцы для повязки 130 мм | Aesculap, Туттлинген, Германия | BD025R | |
| Сверло с покрытием 0,45 мм | RISystem, Давос, Швейцария | HS820420 | |
| Иглодержатель Durogrip 125 мм | Aesculap, Туттлинген, Германия | BM024R | |
| Foliodrape | Hartmann, Хайденхайм, Германия | 2513026 | |
| Frekaderm | Fresenius, Бад Хомбург, Германия | 4928211 | |
| пила Gigli 0,44 мм | RISystem, Давос, Швейцария | RIS.590.110.25 | |
| Ручная дрель | RISystem, Давос, Швейцария | RIS.390.130-01 | |
| Нагревательная пластина | FMI, Зеехайм, Германия | IOW-3704 | |
| Перчатки Hygonorm | Hygi, Telgte, Германия | 2706 | |
| Isoflurane | Abbot, Лондон, | Великобритания Forene | |
| Micro щипцы 155 мм | Aesculap, Туттлинген, Германия | BD343R | |
| Микроножницы 120 мм | Aesculap, Туттлинген, Германия | FD013R | |
| Mouse FixEx L 0,7 мм | RISystem, Давос, Швейцария | RIS.611.300-10 | |
| Чехол для игл для сверл | Aesculap, Туттлинген, Германия | BL911R | |
| Иглодержатель | Aesculap, Туттлинген, Германия | BB078R | |
| Octenisept | Schü lke, Norderstedt, Германия | 121403 | |
| программное обеспечение Osirix | Pixmeo SARL, Bernex, Швейцария-Version | 4.0 | |
| Oxygen, медицинский класс | MTI, Ульм, Германия-Resolon | ||
| 5/0 | Resorba, Nü rnberg, Германия | 88143 | |
| Солевой раствор 0,9% | Braun, Мельзунген, Германия | 3570350 | |
| Ручка для скальпеля 125 мм | Aesculap, Туттлинген, Германия | BB073R | |
| Ножницы 150 мм | Aesculap, Туттлинген, Германия | BC006R | |
| Запайщик для автоклавной упаковки | Hawo GmbH, Обригхайм, Германия | HM500 | |
| Sterican 27 G | Braun, Мельзунген, Германия | 4657705 | |
| Стерильные хирургические лезвия No 11/15 | Aesculap, Туттлинген, Германия | BB511/515 | |
| Хирургические перчатки | Hartmann, Хайденхайм, Германия | Peha-micron 9425712 | |
| Хирургический свет | Maquet SA, Ardon, Франция | Blue line 80 | |
| Шприцы 5 мл | Braun, Мельзунген, Германия | Injekt 4606051V | |
| Щипцы для тканей 80 мм | Aesculap, Туттлинген, Германия | OC091R | |
| Трамадол 25 мг/л | Grü nenthal, Ахен, Германия | 100мг/мл | |
| Vasofix Безопасность | Braun, Мельзунген, Германия | 4268113S-01 | |
| Vicryl 5-0 | Ethicon, Norderstedt, Германия | V30371 | |
| Visdisic глазная мазь | Bausch & Ломб, Берлин, Германия | 3099559 |
Ссылки
- Claes, L., Recknagel, S., Ignatius, A. Fracture healing under healthy and inflammatory conditions. Nat Rev Rheumatol. 8 (3), 133-143 (2012).
- Einhorn, T. A. The cell and molecular biology of fracture healing. Clin Orthop Relat Res. (355), Suppl S7-S21 (1998).
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nat Rev Rheumatol. 11 (1), 45-54 (2015).
- Augat, P., et al. Local tissue properties in bone healing: influence of size and stability of the osteotomy gap. J Orthop Res. 16 (4), 475-481 (1998).
- Claes, L. E., Heigele, C. A. Magnitudes of local stress and strain along bony surfaces predict the course and type of fracture healing. J Biomech. 32 (3), 255-266 (1999).
- Claes, L. E., et al. Effects of mechanical factors on the fracture healing process. Clin Orthop Relat Res. (355), Suppl 132-147 (1998).
- Hu, D. P., et al. Cartilage to bone transformation during fracture healing is coordinated by the invading vasculature and induction of the core pluripotency genes. Development. 144 (2), 221-234 (2017).
- Hankenson, K. D., Zimmerman, G., Marcucio, R. Biological perspectives of delayed fracture healing. Injury. 45, Suppl 2 8-15 (2014).
- Meyer, R. A., et al. Age and ovariectomy impair both the normalization of mechanical properties and the accretion of mineral by the fracture callus in rats. J Orthop Res. 19 (3), 428-435 (2001).
- Nikolaou, V. S., Efstathopoulos, N., Kontakis, G., Kanakaris, N. K., Giannoudis, P. V. The influence of osteoporosis in femoral fracture healing time. Injury. 40 (6), 663-668 (2009).
- Haffner-Luntzer, M., Kovtun, A., Rapp, A. E., Ignatius, A. Mouse Models in Bone Fracture Healing Research. Current Molecular Biology Reports. 2 (2), 101-111 (2016).
- Garcia, P., et al. Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review. Eur Cell Mater. 26, 1-14 (2013).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Zachos, T. A., Bertone, A. L., Wassenaar, P. A., Weisbrode, S. E. Rodent models for the study of articular fracture healing. J Invest Surg. 20 (2), 87-95 (2007).
- Taha, M. A., et al. Assessment of the efficacy of MRI for detection of changes in bone morphology in a mouse model of bone injury. J Magn Reson Imaging. 38 (1), 231-237 (2013).
- Haffner-Luntzer, M., et al. Evaluation of high-resolution In Vivo MRI for longitudinal analysis of endochondral fracture healing in mice. PLoS One. 12 (3), 0174283(2017).
- Beckmann, N., Falk, R., Zurbrugg, S., Dawson, J., Engelhardt, P. Macrophage infiltration into the rat knee detected by MRI in a model of antigen-induced arthritis. Magn Reson Med. 49 (6), 1047-1055 (2003).
- Al Faraj,, Shaik A, S. ultana, Pureza, A., A, M., Alnafea, M., Halwani, R. Preferential macrophage recruitment and polarization in LPS-induced animal model for COPD: noninvasive tracking using MRI. PLoS One. 9 (3), 90829(2014).
- Rolle, A. M., et al. ImmunoPET/MR imaging allows specific detection of Aspergillus fumigatus lung infection in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 1026-1033 (2016).
- Niemeyer, M., et al. Non-invasive tracking of human haemopoietic CD34(+) stem cells in vivo in immunodeficient mice by using magnetic resonance imaging. Eur Radiol. 20 (9), 2184-2193 (2010).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
