Методическая статья

Переходных выражение иностранных генов в клетках насекомых (sf9) для функциональных Assay протеина

12.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56693

⸱

22 февраля 2018 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biotechnology and Animal Science, National Ilan University, 2Department of Agricultural Biology, College of Agriculture Life Sciences, Chonbuk National University, 3Department of Entomology, National Taiwan University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает тепла шок индуцированного белка выражение (система pDHsp/V5-его/sf9 клеток), который может использоваться для выражения инородные белки или оценке анти apoptotic деятельность потенциальных иностранных белков и их усеченного аминокислот кислоты в клетках насекомых.

Аннотация

Переходных ген выражение системы является одним из наиболее важных технологий для выполнения функционального анализа белка в бакуловирусы в vitro клетки культуры системы. Эта система была разработана для Экспресс чужеродные гены под контролем промотора baculoviral в переходных выражение плазмид. Кроме того эта система может применяться для функционального анализа бакуловирусы сам или инородные белки. Наиболее широко и коммерчески доступных временных ген выражение системы является разработана на основе незамедлительного начала гена (IE) промоутер Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). Однако наблюдается низкий уровень экспрессии чужеродных генов в клетках насекомых. Таким образом выражение системы переходных ген был построен для улучшения выражения протеина. В этой системе были построены рекомбинантных плазмид содержат последовательности целевых объектов под контролем промотора дрозофилы теплового шока 70 (Dhsp70). Этот протокол представляет применение этого тепла на основе шок pDHsp/V5-его (V5 epitope с 6 гистидина) /Spodoptera frugiperda клетки (клетки sf9) системы; Эта система доступна не только для экспрессии генов, но и для оценки активности анти apoptotic кандидата белков в клетках насекомых. Кроме того эта система либо transfected с одной рекомбинантных плазмид или совместно transfected два потенциально функционально антагонистических рекомбинантных плазмид в клетках насекомых. Протокол демонстрирует эффективность этой системы и обеспечивает практический случай этой техники.

Введение

Две системах выражения протеина широко использовались для производства белков: системах выражения протеина прокариот (кишечная палочка ген выражение системы) и эукариоты системах выражения протеина. Один из популярных эукариоты системе выражения протеина является бакуловирусы выражение вектор системы (BEVS)1. Baculoviruses впервые были использованы как во всем мире биоконтролирующих агентов сельскохозяйственных и лесных вредителей. В последние несколько десятилетий как биотехнологические инструменты для векторов выражения протеина также были разработаны baculoviruses. Геномы baculoviruses состоят из круговой двуцепочечной ДНК и запечатанная nucleocapsids2. На сегодняшний день, более чем семьдесят бакуловирусы изолятов были виртуализированного3. На основании временной Каскад выражения гена baculoviral в клетки хозяина насекомых, транскрипции гена могут быть разделены на четыре временных каскады, включая немедленное ранний, задержка начале, конце и очень поздно гены4.

BEVSs были определены таким образом, что очень поздно генным стимуляторам (то есть, многогранник или p10 промоутер) были использованы для привода целевых генов, в то время как рекомбинантной бакуловирусы была порождена гомологичная рекомбинация. Выражение иностранных белков в клетках насекомых, рекомбинантных бакуловирусы похож на млекопитающих белков в столб-поступательные изменения (подходит для производства гликопротеин). Таким образом бакуловирусы был широко используется5,6,7. Однако одно ограничение является наличие различных путей N-гликозилирования насекомых клетки7.

Таким образом была разработана новая система бакуловирусы выражение, выражение системы переходных гена. Эта система выражает чужеродные гены под диск baculoviral немедленного начале промоутеров (ie-1 промоутер) в клетках насекомых. С помощью этой системы, целевого белка может быть сразу же выражена под контролем промотора ie-1 во время изменения N-гликозилирования путь в клетках насекомых, что приводит к лучшей олигосахариды, связанный с N7. Кроме того baculoviral немедленно ранняя гены транскрибируются РНК полимеразой II клетки-хозяина и не требуют какой-либо вирусной фактор для активации4. Таким образом иностранные белков может быть выражено в клетках насекомых в течение короткого времени. На сегодняшний день, переходные системы выражения гена является одним из наиболее важных технологий для выполнения функциональных анализов белка в бакуловирусы в vitro клетки культуры системы. Система может применяться для анализа функции бакуловирусы или инородные белки. Один из коммерчески доступных временных ген выражение систем основана на промоутеров немедленного начала гена (IE) Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (OpIE2 и OpIE1 промоутеров).

Однако ниже уровень экспрессии чужеродных генов в клетках насекомых еще была проблема, когда система выражение на основе промоутер переходных гена OpIE была используется8,9,10. Таким образом другой переходных ген выражение системы была построена на основе промоутер дрозофилы тепловой шок белка 70 (БТШ70) ген8,9. Промоутер hsp70 работает более эффективно, чем промоутер baculoviral IE когда индуцированных теплового шока на насекомых клетки10. В этой системе были высказаны генов-мишеней под диск промотора дрозофилы теплового шока 70 (Dhsp70). Чужеродные гены можно легко клонировать в плазмиду выражение переходных генов клонирования методами на основе ПЦР. Кроме того контроль сроков для экспрессии генов может осуществляться тепловой шок индукция.

В настоящем докладе, мы следовать подходу и выразить три различных усечений гена baculoviral (Ингибитор апоптоза 3, iap3 от Lymantria xylina MNPV) с помощью системы выражения на основе шок переходных белка тепла и Далее примените эти выраженной белки на анти apoptotic анализ деятельности. Эта система может либо Экспресс инородные белки быстро или применяться для оценки деятельности анти apoptotic белка в клетках sf9, а также может применяться для других анализов активность белка.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка

  1. Культура клеток насекомых
    1. Подготовка 50 мл среды культуры клеток. Чтобы сделать это, добавьте 500 мкл антибиотиков (амфотерицин B = 0,25 мкг/мл, пенициллин = 100 единицы/мл, стрептомицина = 100 мкг/мл) и 5 мл сыворотки тепла инактивированная плода говядину в среде культуры клеток сыворотки бесплатно (без FBS или антибиотики).
      Примечание: Тепла плода бычьим сывороточным при 65 ° C за 30 минут на водяной бане перед использованием.
    2. Сохранить Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: совок), sf9 насекомых клеток. Отсоединить ОК. 80% клеток от 25 см2 клетки культуры колбу, встряхивая колбу и проверить под световой микроскопии. Затем передать новый флакон культуры клеток2 25 см 50% суспензию клеток и позволяют клеткам прикрепить 15 мин при комнатной температуре. Заменить средство с 5 мл свежего клеток питательной среды и расти в инкубаторе на 28 ° C. Клетки проход каждые 2 до 3 дней в зависимости от роста клеток.
  2. Подготовка плазмиды для transfection клетки
    1. Вставьте фрагменты ДНК целевого объекта (например, непарный xylina гена iap3 в MNPV (LyxyMNPV) и его удаление конструкций) в pDHsp/V5-его на основе ПЦР клонирования метод11. Проверьте роста колоний превращается в колонии PCR с помощью ПЦР Мастер микс (2 X) и pDhsp-F2/Op-IE2R грунтовка набор. Подтвердите плазмида последовательности службой коммерческих последовательности.
      Примечание: В таблице 1 перечислены Праймеры для ПЦР и соответствующей конструкции.
    2. Культура единого виртуализированного колонии бактерий, которые содержат вышеупомянутые плазмида конструкций (шаг 1.2) в 200 мл LB средних содержащие выбранные антибиотики (50 мкг/мл), соответственно.
    3. Извлечь плазмид из искусственного E. coli с помощью Midi плазмида комплекта согласно инструкции производителя12.
  3. Подготовка среднего покрытие путем смешивания 1,5 мл среды культуры клеток и 8,5 мл сыворотки свободных клеток питательной среды.
  4. Подготовить актиномицин Д (АСРТ) клеток питательной среды, добавив 1.5 мкл АСРТ акций (1 мг/мл) в 10 мл среды культуры клеток (конечная концентрация = 150 нг/мл). Хранить при 4 ° C.

2. Переходные белков

  1. Заполнение ячеек
    1. Урожай sf9 клетки, встряхивая колбу культуры, свергнуть осенью суспензии клеток с 50 мл трубки и передать Горяева 10 мкл на P10 пипетки. Подсчет клеток под микроскопом света.
    2. Пластина 3 × 105 sf9 клеток в каждой скважине в 24-ну пластине 15 мин при комнатной температуре. Замените носитель 0,5 мл обшивка среднего.
  2. Трансфекция плазмиды
    1. Разбавить клеток трансфекции реагента: развести 8 мкл Реагента transfection клетки в 100 мкл сыворотки свободных клеток питательной среды и микс от vortexing для 1 s.
    2. Добавить 2 мкг плазмидной ДНК (pDHsp70-Ac-P35/V5-его pDHsp70-лы-IAP3/V5-его или pDHsp70-Ly-IAP3-Бир/V5-его или pDHsp70-Ly-IAP3-кольца/V5-его) в 100 мкл сыворотки свободных клеток питательной среды и микс, vortexing для 1 s (Рисунок 2).
    3. Объединить разреженных плазмида ДНК и разбавленных клеток трансфекции реагента (210 мкл) и смесь vortexing для 1 s. инкубировать 30 мин при комнатной температуре.
    4. Мкл 210 ДНК трансфекции реагент смеси каплям на клетки, P1000 пипетки. Инкубируйте на 28 ° C за 5 ч.
    5. Замените средство покрытия 0,5 мл среды культуры клеток с помощью пипетки P1000. Печать 24-ну пластины с лентой и инкубировать клетки на 28 ° C на 16 h.
  3. Тепловой шок transfected клеток: Положите пластину в ванну воды 42 ° C (плавающие на поверхности воды). Тепло в течение 30 мин и вернуть инкубатор 28 ° C 24-ну пластины.
  4. Определение выражения протеина
    1. После 1 час или 5 h теплового шока Вымойте клетки с 0,5 мл 1 x PBS буфера кратко три раза.
      Примечание: Развести 10 x буфер PBS 1 x PBS буфера путем добавления 1 мл буфера PBS 10 x 9 мл стерилизованное ddH2O
    2. Лизируйте клетки с 40 мкл 1 x SDS загрузки краситель, закупорить вверх и вниз.
      Примечание: Разбавляют 4 x SDS загрузки краситель, смешивая 30 мкл 1 x PBS буфера и 10 мкл 4 x буфер образца SDS.
    3. Тепла образцы протеина в 98 ° C в течение 10 мин в блоке тепла, уменьшается на 1 мин и положить на льду для западной помарки assay.
    4. Западной помарке пробирного
      Следуйте процедуре иммуноблоттинга пробирного эслами и Лухан-13. Запуск Гели SDS-PAGE14: один гель, подвергается Кумасси синий окрашивание (контроль погрузки для проверки, что количество образцов белка, загруженной в каждый хорошо равно в сумме) и другие подвергаются Западной пятно пробирного, согласно эслами и Лухан13 .
    5. Обнаружить V5-тегами синтез белков с кролик антитела анти V5 (5 мг/мл) (1: 5000 разрежения в TBST буфер для рабочей концентрации 1 мкг/мл) и коз анти кролик IgG хрен пероксидазы (ПХ) конъюгата (0,8 мг/мл) (1: 10000 разрежения в TBST буфер для рабочей концентрация 0,08 мкг/мл).
      Примечание: Отрегулируйте процент полиакриламида до 17,5% когда низкомолекулярных белков быть < 17 кДа.

3. анти apoptotic деятельности пробирного

  1. Джин индуцированной клеток апоптоз: повторите вышеупомянутые процедуры от 2.1 до 2.3. Совместное transfect 1 мкг pDHsp/D-rpr/флаг-его плазмидной ДНК (содержащий апоптоз индуктором ген) с 1 мкг плазмидной ДНК [pDHsp70/V5-его вектор (отрицательный контроль), pDHsp70-Ac-P35/V5-его (положительный контроль), pDHsp70-лы-IAP3/V5-его, pDHsp70-Ly-IAP3-Бир/V5-его или pDHsp70-Ly-IAP3-кольца/V5-его, соответственно.]. В 5 ч после термообработки шок проведения пробирного жизнеспособности клеток (рис. 2).
  2. Апоптоз клеток химико индуцированной: повторите вышеупомянутые процедуры от 2.1 до 2.3. В шаге 2.1.2 пластина 1 x 10-6 sf9 клеток в каждой скважине в пластине 6-хорошо. Transfect 4 мкг плазмидной ДНК [pDHsp70/V5-его вектор (отрицательный контроль), pDHsp70-Ac-P35/V5-его (положительный контроль), pDHsp70-лы-IAP3/V5-его, pDHsp70-Ly-IAP3-Бир/V5-его или pDHsp70-Ly-IAP3-кольца/V5-его, соответственно.]. В 5 ч после теплового шока лечить sf9 клетки с 2 мл АСРТ клеток питательной среды для 16 h и проведения пробирного жизнеспособности клеток (рис. 2).
    Примечание: Минимальный объем для покрытия одной скважиной 6-ну плиты-1 мл.
  3. Выполните выше анти apoptotic деятельности пробирного экспериментов, включая 3.1 и 3.2 в triplicates.

4. клетки жизнеспособности пробирного

  1. Промойте обработанные клетки, добавив 1 мл 1 x PBS буфера 1 мин 3 раза. Ресуспензируйте клетки, закупорить 1 мл 1 x PBS буфер, содержащий 0,04% Трипановый синий и пятен на 3 мин при комнатной температуре. Перенесите суспензию клеток в 1,5 мл микропробирок.
    Примечание: Разбавьте раствор 0,4% Трипановый синий, смешивая 9 мл раствора 1 x PBS буфер и 1 мл 0,4% Трипановый синий.
  2. Передача 10 мкл Трипановый синий окрашенных клеток подвеска Горяева с пипеткой P10 и подсчет жизнеспособных нетронутым клеток под микроскопом света.
  3. Статистический анализ
    1. Рассчитать записанные данные и представить в качестве средства ± с.д. для всех счетчиков.
    2. Анализировать данные с помощью студента двустороннее t тест, с помощью Microsoft Excel. Определить статистически значимые данные как P-значение < 0,05.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Полная длина и другие два усечения (Бир и кольцо домены) Ly-IAP3 из LyxyMNPV были оверэкспрессировали в sf9 клетках, основанный на теплового шока на основе pDHsp/V5-его /Spodoptera frugiperda клетки (клетки sf9) системы. PDHsp/V5-его содержится дрозофилы тепловой шок белка промоутер, который управляет экспрессии генов вниз по течению при температуре 42 ° C состояния с помощью сотовой транскрипционный анализ факторов и перевода системы (рис. 1

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Концепция системы тепла на основе шок клеток pDHsp/V5-его/sf9 был впервые описан Клем et al. 19948. Сравнение baculoviral гена промоутер (IE1) и дрозофилы hsp70 показали, что что hsp70 имели более высокую эффективность в клетках комаров10. Кроме того из-за тепловой шок индукция, сроки экспрессии белков может контролироваться точно после термообработки шок. Затем эта система была применена для протеина функциональные анализы креветок и nuc...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Благодарности

Мы благодарим д-ре Лое Цзянь-Horng институт морской биологии, Национальный университет Тайваня океана для предоставления 3 плазмидные конструкции. Это исследование было поддержано на грант 106-2311-B-197-001 - от министерства науки и технологии (большинство).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Антибиотик-антимикотик, 100XGibco15240-062для культуры клеток насекомых
Сертифицированная фетальная сыворотка крупного рогатого скотаBioind04-001-1A
Sf-900 II SFMThermo Fisher10902096бессывороточная среда для клеточной культуры
Sf9 клеткиATCCCRL-1711
25см2 колба для клеточной культурыNunc, Thermo Fisher156340
Микроскопия в инвертированном светеWHITEDWHITED WI-400
RBC HIT Competent CellBiomanRH618-J80Escherichia coli (DH5α)
L.B. Broth (Miller)BiomanLBL407
Агар, бактериологический классBiomanAGR001
ZeocinInvitrogenant-zn-1селекционный антибиотик
PCR Master Mix (2X)ThermoFisherK0171
Geneaid Midi Plasmid Kit (без эндотоксина)GeneaidPIE25
Актиномицин DSIGMAA9415
Центрифужные пробирки Corning 50 млSIGMACLS430829-500EA50 мл пробирки
ГемоцитометрGizmo Supply CoB-CNT-SLDE-V2
24-луночный мультидиверсионныйнунк, Thermo Fisher14247524-луночный планшет
Реагент Cellfectin II ThermoFisher10362100-клеточный реагент трансфектиновый
PBS-Phosphate-Buffered Физиологический раствор (10X) pH 7,4Thermo FisherAM9624
4× SDS Загружающий красительBiomanP1001
Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes)Merck MiliporeIPVH00010PVDF мембраны
Mini Trans-Blot Клеточная системаBIO-RED1703930Блоттинг
Ponceau S растворSIGMA6226-79-5
Anti-V5SIGMAV8137кролик анти-V5 антитела
Козья антикроличья IgG-пероксидаза хрена (HRP)Jackson111-035-003
Tween 20Merck817072
6-луночный мультидиверсионныйнунк, Thermo Fisher145380
0,4 % трипановый синий растворAMRESCOK940-100ML
P10 пипеткаGilsonF144802
P1000 пипеткаGilson
ЛентаСимбиоППС724 луночная лента ( 19 мм&раз; 36 Ф)
F123602

Ссылки

  1. Miller, L. K. Baculoviruses as gene expression vectors. Annual Reviews in Microbiology. 42 (1), 177-199 (1988).
  2. Theilmann, D. A., et al. Family Baculoviridae. Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A. , Springer Press. New York. 1129-1185 (2005).
  3. Nai, Y. S., Huang, Y. F., Chen, T. H., Chiu, K. P., Wang, C. H. Determination of nucleopolyhedrovirus' taxonomic position. Biological Control of Pest and Vector Insects. Shields, V. D. C. , InTech Press. Rijeka. 169-200 (2017).
  4. Friesen, P. D. Regulation of baculovirus early gene expression. The Baculoviruses. Miller, L. K. , Plenum Press. New York. 141-170 (1997).
  5. Smith, G. E., Summers, M., Fraser, M. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Mol. Cell. Biol. 3 (12), 2156-2165 (1983).
  6. Luckow, V. A., Summers, M. D. Trends in the development of baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 6 (1), 47-55 (1988).
  7. Jarvis, D. L., Finn, E. E. Modifying the insect cell N-glycosylation pathway with immediate early baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 14 (1996), 1288-1292 (1996).
  8. Clem, R. J., Miller, L. K. Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and iap. Mol. Cell. Biol. 14, 5212-5222 (1994).
  9. Leu, J. H., Kuo, Y. C., Kou, G. H., Lo, C. F. Molecular cloning and characterization of an inhibitor of apoptosis protein (IAP) from the tiger shrimp, Penaeus monodon. Dev. Comp. Immunol. 32, 121-133 (2008).
  10. Zhao, Y. G., Eggleston, P. E. Comparative analysis of promoters for transient gene expression in cultured mosquito cells. Insect Mol. Biol. 8 (1), 31-38 (1999).
  11. Nai, Y. S., Yang, Y. T., Kim, J. S., Wu, C. Y., Chen, Y. W., Wang, C. H. Baculoviral IAP2 and IAP3 encoded by Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus (LyxyMNPV) suppress insect cell apoptosis in a transient expression assay. Appl. Entomol. Zool. 51, 305-316 (2016).
  12. Geneaid™. Geneaid™ Midi Plasmid Kit & Geneaid™ Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) Instruction Manual Ver. 05.11.17. , Available from: http://www.geneaid.com/sites/default/files/PI13_0.pdf (2017).
  13. Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359(2010).
  14. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2017).
  15. Vucic, D., Kaiser, W. J., Harvey, A. J., Miller, L. K. Inhibition of reaper-induced apoptosis by interaction with inhibitor of apoptosis proteins (IAPs). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 10183-10188 (1997).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи