Методическая статья

Количественное измерение γ-Secretase опосредованной амилоида прекурсоров протеина и вырез декольте в платформах Assay репортера Cell-based Люцифераза

6.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56795

⸱

25 января 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Neurobiology, Institute of Cellular and Organismic Biology, Academia Sinica

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Мы были успешно созданы две зависящие от субстрата γ-secretase анализов. Обе ячейки на основе анализов, представленные здесь предназначены для количественного определения γ-secretase ферментативную деятельность через выход Светлячок Люцифераза репортеров.

Аннотация

Мы разработали пару на основе ячеек Репортер ген анализов количественно измерить γ-secretase расщепление различных субстратов. Эта рукопись описывает процедуры, которые могут быть использованы для мониторинга γ-secretase опосредованной расщепления APP-C99 либо насекают, используя систему репортер Люцифераза Gal4 промоутер driven Светлячок. Эти анализы были созданы стабильно совместно transfecting HEK293 клеток с Gal4 приводом Люцифераза Репортер ген и фрагмента Gal4/VP16-тегами C-терминал приложения (APP-C99; CG клетки), или Gal4/VP16-тегами Notch-ΔE (NΔE; НГ клетки). С помощью этих анализов репортер параллельно, мы показали, что ингибитор ErbB2, CL-387,785, преференциально может подавить γ-secretase расщепление APP-C99 в CG клеток, но не NΔE в клетках нг. Дифференциальный ответы, выставлены CG и нг клетками, когда лечение с CL-387,785, представляют предпочтительным характерные для γ-secretase модуляторы, и эти ответы находятся в явном противоречии с Пан-ингибированием γ-secretase, индуцированных DAPT. Наши исследования обеспечивают прямые доказательства того, что в сотовой связи может быть продифференцированным γ-secretase деятельность, направленную на различных подложках. Поэтому эти новые анализы могут быть полезными инструментами в лекарственных препаратов для повышения АД терапии.

Введение

Олигомерные формы амилоид β (значения) считается основной причиной нейродегенеративные в мозгах пациентов, страдающих от болезни Альцгеймера (AD)1. Пептиды значения производятся поэтапно расщепления белка амилоида прекурсоров (APP), сначала β-secretase, а затем γ-secretase2. В последнее десятилетие терапевтические подходы к лечению AD были сосредоточены на предотвращении производства значения3. Большинство исследований были сосредоточены на увеличение активности α-secretase, который может препятствовать γ-secretase расщепление APP и тем самым уменьшение производства значения, или ингибирование β-и/или γ-secretase деятельности4. К сожалению неселективной ингибирование β - и γ-secretases результатов в неизбежные побочные эффекты, которые из-за вмешательства в функционирование других физиологических субстратов β - и γ-secretase5,6. Что касается γ-secretase ингибиторы недавние исследования сообщили открытие целого ряда химических и генетические модуляторы, которые можно регулировать производство значения пока оказывает незначительное влияние на основные γ-secretase опосредованной обработки паз7 ,8,9,10,11,12, однако, успешной терапии еще не разработана. Таким образом систематическое экраны являются дальнейшие обнаружить роман генетических и химические модификаторы, которые избирательно могут модулировать γ-secretase опосредованной обработки приложения.

Γ-Secretase известно расщеплять более чем 90 различных якорь мембранных белков. Среди этих субстратов-паз, чья деятельность имеет решающее значение для определения судьбы клетки и дифференциация во время развития13. Выборочно модулирует γ-secretase катализированное приложение обработки в отсутствие затрагивающих Notch обработки будет иметь существенно важное значение для минимизации связанных с Notch побочные эффекты ингибиторов γ-secretase, и считается, что эта избирательность является основным фактором, который будет диктовать биологической эффективности потенциальных γ-secretase Модуляторы для хронического лечения AD. Там был ряд arylsulfonamide производные, такие как GSI-953 (begacestat) и BMS-708163 (avagacestat), которые были найдены на выставку мощным и селективного торможения γ-secretase14,15. Предыдущие исследования показали, что дифференциального ингибирование γ-secretase расщепление APP и паз можно наблюдать с помощью количественной основе ELISA пробирного в сочетании с проверкой в естественных условиях с помощью данио рерио16. Кроме того были созданы на основе ячеек пробирного парадигмы для решения потенциальных субстрата избирательность γ-secretase к APP и Notch17,18. С помощью протоколов похож на описанных здесь, мы недавно обнаружили новый класс (D)-leucinamides, который мощно модулировать γ-secretase расщепление APP с Notch щадящие избирательности19. Вместе Эта коллекция исследований обеспечивает доказательства в концепция поддерживает понятие, что субстрат избирательности/доступность γ-secretase может быть предметом химических модуляции и экспериментальной проверки. Однако эти платформы пробирного часто полагаются на относительно низкой пропускной способности отсчетов и трудоемких подходов, которые могут не соответствовать промышленных стандартов для программ обнаружения наркотиков.

Мы недавно созданных на основе ячеек Люцифераза Репортер ген анализов, которые могут количественно определить каталитической активности γ-secretase сторону двух различных субстратов, 99-амино кислоты C-терминал фрагмент приложения (APP-C99) и внеклеточного удалить домен Notch пептида (NΔE). APP-C99 и NΔE широко использовался как прямой субстратов γ-secretase в различных анализов. Для создания однородной и последовательной Люцифераза Репортер ген анализов для расщепления γ-secretase APP-C99 или NΔE, мы получили одну ГЭС производные стабильной клеточная линия (CG), конститутивно выражает Gal4 промоутер driven Светлячок Люцифераза репортер ( Gal4-Luc) и Gal4/VP16-тегами APP-C99 синтез белка (C99-GV). Кроме того мы создали еще один ГЭС производные стабильной клеточная линия (НГ), конститутивно выражает Gal4-люк и Gal4/VP16-меткой NΔE (NΔE-GV). С помощью этих анализов Роман субстрата конкретных γ-secretase, мы теперь предоставляют метод для количественного определения и отличать каталитической активности γ-secretase к различных субстратов (APP-C99 в клетках CG), или NΔE в клетках нг. Кроме того анализы конкретного субстрата γ-secretase были разработаны для способствовать высоким содержанием скрининг платформ. Эти вновь созданные γ-secretase анализов может проложить путь для открытия модуляторы Роман γ-secretase, которые могли бы улучшить когнитивные функции, подавляя значения производства без вызывая нежелательных ингибирование паз для обработки следующего поколения объявления.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Измерение сигналов Люцифераза репортер, который соответствует γ-Secretase расщепление APP-C99 или NΔE

Примечание: Обратитесь к предыдущей публикации для подробного описания поколения CG и нг клетки20,21.

  1. Семя нг или CG клетки (20, 000 клеток/хорошо) на 96-луночных планшетов на окончательный объем 200 мкл/скважины в среднего роста, которая состоит из Дульбекко изменение средних орла (DMEM) плюс 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 5 мкг/мл blasticidin, 250 мкг/мл антибиотик (например zeocin) и 200 мкг/мл hygromycin б.
    1. Подсчет количества ячеек с Горяева.
    2. Передать увлажненные CO2 инкубатора планшет и инкубировать и при 37 ° C на ночь.
  2. Удалите из каждой скважины 100 мкл среднего роста.
  3. Добавить 100 мкл/хорошо роста средних, содержащий 2 мкг/мл тетрациклина с либо 0,2% диметилсульфоксида (ДМСО), 2 мкм CL-387,785, 2 мкм N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butylester (DAPT) или других связанных с ErbB1/ErbB2 ингибиторов.
  4. Инкубируйте обработанной CG или нг клетки в планшет при 37 ° C в течение 24 ч.
  5. Удаление 150 мкл/хорошо роста среднего из планшетов.
  6. Добавьте 50 мкл/хорошо Люцифераза пробирного реагента (см. Таблицу материалы).
  7. Передать планшет Считыватель микропланшетов люминесценции.
    1. Поддерживать планшет при комнатной температуре на 5 мин с нежным агитации.
  8. Определить Firefly Люцифераза (FL)-излучаемый люминесценции, используя предварительно определенные программы, хранящиеся в Считыватель микропланшетов люминесценции.
    1. Открыть инструмент контроля программного обеспечения (см. Таблицу материалов для деталей инструмент).
    2. Выберите из меню «Tool», «Luminometry».
      1. Под «параметры» выберите «Нет фильтра» для фильтра выбросов, галочку «Normal» для выбросов диафрагмы, введите '1' для подсчета времени и нажмите кнопку «OK» чтобы настроить чтение люминесценции.
    3. На вкладке «Управления» прокрутите список активных протоколов и выберите предварительно протокол для чтения люминесценции.
    4. На вкладке «Live дисплей» определить масштаб в раскрывающемся списке и выберите «Логарифм» или «Linear» для типа.
    5. На вкладке «Температура» выберите «Off» для плиты обогрева.
    6. Нажмите кнопку «Пуск» выполнять чтение люминесценции.
    7. При необходимости, экспортируйте результаты в формате таблицы, с использованием «Проводник», встроенные в программное обеспечение управления.

2. Количественная оценка активности γ-Secretase

  1. Определите люминесценции сигнал, излучаемый CG или нг клетки лечат 0,1% ДМСО в среднего роста, содержащие 1 мкг/мл тетрациклин только как 100% относительной γ-secretase деятельности.
    1. Оценка фон свечения от CG или нг клеток, рассматривая клетки с среднего роста, который не содержит тетрациклина.
  2. Нормализовать Люцифераза сигналы от CG или нг клеток, которые культивировали с среднего роста, содержащие 1 мкг/мл тетрациклин и либо 1 мкм CL-387,785 или 1 мкм DAPT с Люцифераза сигнал излучаемый ДМСО лечение CG или нг клетки (100% относительной γ-secretase деятельности, как определены в 2.1).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Ингибирование ErbB2, CL-387,785 дифференциально может способствовать обработки APP-C99 Γ -secretase не затрагивая вырез декольте
Создать на основе ячеек assay который можно количественно измерить протеолитического расщепления субстрата конкретной γ-secretase, мы порожденных линии клеток HEK293-производные CG стабильного сотрудничества transfection по тетрациклин индуцибельной C-смертельно Gal4/VP16-тегами APP-C99 и Gal4 промоутер drive...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Многообещающие результаты пробу этап 1b иммунотерапии aducanumab для AD твердо установили решающую роль Aβ в патогенезе AD22 и предположить, что анти Aβ подходы по-прежнему жизнеспособной стратегии развития анти ад наркотиков. Здесь мы описываем анализов на основе ячеек для количественной оценки γ-secretase катализированное протеолиза APP-C99 и NΔE с помощью Светлячок Люцифераза репортер систем. APP-C99 и NΔE являются двумя наиболее изученной γ-secretase субстратов и вместе представляют патогенных...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Авторы благодарят основной фонд Институт клеточной и организмический биологии, Синика, за технической поддержкой. Это исследование было поддержано Министерством науки и технологии, Тайвань (наиболее 103-2320-B-001-016-MY3 к ю.-ф. L.), программа для трансляционного инноваций биофармацевтических развития – технология поддержки платформы оси схеме (NP7 к ю.-ф.л.) и Синика (на ю.-ф.л.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Считыватель люминесцентных пластин VictorLightPerkinElmer2030-0010
Класс II, тип 2 Кабинет биологической безопасностиThermo Scientific1300 Series A2
CL-387,785EMD Calbiochem233100-1MG
DAPTMerck565770
Dulbecco' s Модифицированная среда Eagle (DMEM)Thermo Fisher12100046основной компонент питательной среды
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Thermo Fisher16000044
БластицидинThermo FisherA1113903
ЦеоцинThermo FisherR25005
Гигромицин BGibco10687010
ГемоцитомерSigma-AldrichBR717805
Nunc156545
тетрациклинаSigmaT7660
Диметилсульфоксид (ДМСО)SigmaD2650
Steady-Glo люциферазный реагентPromegaE2510
Увлажненный CO2 инкубаторRevcoUltima II
T-REx293 клеточная линияInvitrogenR71007
Wallac 1420 версия программного обеспечения 3.0PerkinElmerпрограммное обеспечение для управления люминесцентным микропланшетным ридером
96-луночный микропланшет Aldrich

Ссылки

  1. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Mol Med. 8 (6), 595-608 (2016).
  2. Wolfe, M. S., Guenette, S. Y. APP at a glance. J Cell Sci. 120 (Pt 18), 3157-3161 (2007).
  3. Karran, E., Mercken, M., De Strooper, B. The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer's disease: an appraisal for the development of therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 10 (9), 698-712 (2011).
  4. Citron, M. Alzheimer's disease: strategies for disease modification. Nat Rev Drug Discov. 9 (5), 387-398 (2010).
  5. Vassar, R., Kovacs, D. M., Yan, R., Wong, P. C. The beta-secretase enzyme BACE in health and Alzheimer's disease: regulation, cell biology, function, and therapeutic potential. J Neurosci. 29 (41), 12787-12794 (2009).
  6. Parks, A. L., Curtis, D. Presenilin diversifies its portfolio. Trends Genet. 23 (3), 140-150 (2007).
  7. Kukar, T. L., et al. Substrate-targeting gamma-secretase modulators. Nature. 453 (7197), 925-929 (2008).
  8. Kounnas, M. Z., et al. Modulation of gamma-secretase reduces beta-amyloid deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Neuron. 67 (5), 769-780 (2010).
  9. Thathiah, A., et al. The orphan G protein-coupled receptor 3 modulates amyloid-beta peptide generation in neurons. Science. 323 (5916), 946-951 (2009).
  10. Flajolet, M., et al. Regulation of Alzheimer's disease amyloid-beta formation by casein kinase I. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (10), 4159-4164 (2007).
  11. Eisele, Y. S., et al. Gleevec increases levels of the amyloid precursor protein intracellular domain and of the amyloid-beta degrading enzyme neprilysin. Mol Biol Cell. 18 (9), 3591-3600 (2007).
  12. He, G., et al. Gamma-secretase activating protein is a therapeutic target for Alzheimer's disease. Nature. 467 (7311), 95-98 (2010).
  13. Haapasalo, A., Kovacs, D. M. The many substrates of presenilin/gamma-secretase. J Alzheimers Dis. 25 (1), 3-28 (2011).
  14. Gillman, K. W., et al. Discovery and Evaluation of BMS-708163, a Potent, Selective and Orally Bioavailable gamma-Secretase Inhibitor. ACS Med Chem Lett. 1 (3), 120-124 (2010).
  15. Hopkins, C. R. ACS chemical neuroscience molecule spotlight on Begacestat (GSI-953). ACS Chem Neurosci. 3 (1), 3-4 (2012).
  16. Yang, T., Arslanova, D., Gu, Y., Augelli-Szafran, C., Xia, W. Quantification of gamma-secretase modulation differentiates inhibitor compound selectivity between two substrates Notch and amyloid precursor protein. Mol Brain. 1, 15(2008).
  17. McKee, T. D., Loureiro, R. M., Dumin, J. A., Zarayskiy, V., Tate, B. An improved cell-based method for determining the gamma-secretase enzyme activity against both Notch and APP substrates. J Neurosci Methods. 213 (1), 14-21 (2013).
  18. Basi, G. S., et al. Amyloid precursor protein selective gamma-secretase inhibitors for treatment of Alzheimer's disease. Alzheimers Res Ther. 2 (6), 36(2010).
  19. Liao, Y. F., Tang, Y. C., Chang, M. Y., Wang, B. J., Hu, M. K. Discovery of small molecular (D)-leucinamides as potent, Notch-sparing gamma-secretase modulators. Eur J Med Chem. 79, 143-151 (2014).
  20. Liao, Y. F., Wang, B. J., Cheng, H. T., Kuo, L. H., Wolfe, M. S. Tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1beta, and interferon-gamma stimulate gamma-secretase-mediated cleavage of amyloid precursor protein through a JNK-dependent MAPK pathway. J Biol Chem. 279 (47), 49523-49532 (2004).
  21. Wang, B. J., et al. ErbB2 regulates autophagic flux to modulate the proteostasis of APP-CTFs in Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (15), E3129-E3138 (2017).
  22. Sevigny, J., et al. The antibody aducanumab reduces Abeta plaques in Alzheimer's disease. Nature. 537 (7618), 50-56 (2016).
  23. Golde, T. E., Koo, E. H., Felsenstein, K. M., Osborne, B. A., Miele, L. gamma-Secretase inhibitors and modulators. Biochim Biophys Acta. 1828 (12), 2898-2907 (2013).
  24. Coric, V., et al. Targeting Prodromal Alzheimer Disease With Avagacestat: A Randomized Clinical Trial. JAMA Neurol. 72 (11), 1324-1333 (2015).
  25. Mitani, Y., et al. Differential effects between gamma-secretase inhibitors and modulators on cognitive function in amyloid precursor protein-transgenic and nontransgenic mice. J Neurosci. 32 (6), 2037-2050 (2012).
  26. Penninkilampi, R., Brothers, H. M., Eslick, G. D. Pharmacological Agents Targeting gamma-Secretase Increase Risk of Cancer and Cognitive Decline in Alzheimer's Disease Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis. J Alzheimers Dis. 53 (4), 1395-1404 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

APPNotchHEK293CL 387 785DAPT

Похожие статьи