Экспериментальный протокол для обнаружения митохондриальной функции в гепатоцитах, подвергшихся воздействию органохлорных пестицидов

Summary

Понимание влияния экологических органохлоринных пестицидов (OCPs) на митохондриальную функцию в гепатоцитах имеет важное значение для изучения механизма OCPs вызывает нарушения обмена веществ. В настоящем документе представлены подробные методы обнаружения печеночным митохондриальной функции.

Abstract

В настоящем документе представлены подробные методы обнаружения печеночным митохондриальной функции для лучшего понимания причины метаболических нарушений, вызванных экологическими органохлоринными пестицидами (OCPs) в гепатоцитах. Клетки HepG2 подвергались воздействию гексахлороциклогексана (З-ГХГ) в течение 24 ч при эквивалентной дозе внутреннего воздействия в общей популяции. Ультраструктура в гепатоцитах была исследована с помощью электронной микроскопии передачи (TEM), чтобы показать повреждение митохондрий. Митохондриальная функция была дополнительно оценена по интенсивности митохондриальной флуоресценции, уровням аденозина 5'-трифосфата (АТФ), скорости потребления кислорода (OCR) и митохондриальному мембранальному потенциалу (MMP) в клетках HepG2, инкубированных С-ГХГ. Интенсивность митохондрий флуоресценции после окрашенных митохондриального зеленого флуоресцентного зонда наблюдалась с помощью микроскопии флуоресценции. Реакция люциферина-люциферазы была использована для определения уровней АТФ. MMP был обнаружен катионом красителя JC-1 и проанализирован под цитометрией потока. OCR измерялся с помощью внеклеточного анализатора потока. Таким образом, эти протоколы были использованы в обнаружении митохондриальной функции в гепатоцитах с для исследования повреждений митохондрий.

Introduction

Влияние органохлорных пестицидов (OCPs) на здоровье, например, репродуктивное вмешательство, иммунологическая токсичность, метаболические изменения были^{ранее изучены 1,,2,,3}. Методы обнаружения клеточного метаболизма и выявления митохондриальной дисфункции позволили ученым понять роль митохондриальной функции^,,,(т.е.митохондриальных уровней STAT3,^{лактата, пирувата, соотношения лактата к пирувату,}коэнзима No10, митохондриальной утечки протонов, биоэнергетики, биогенеза и^{динамики) в}

Protocol

Все эксперименты и протоколы экспериментов проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами и были одобрены местным комитетом по этике Нанкинского медицинского университета.

1. Митохондриальная ультраструктура TEM

1. Сбор клеток HepG2
   1. Семенные клетки HepG2 в 100 мм посуде. Хранить по 37 градусов по Цельсию и 5% CO₂.
   2. Дайджест клеток с 0,25% ЭДТА в 1,5 мЛЕП трубки.
   3. Центрифуга при температуре 1000 x г в течение 3 мин при комнатной температуре (RT). Откажитесь от супернатанта.
   4. Соберите 4-6 х 10⁵ клеток HepG2.
2. До....

Results

Митохондрии cristae клеток HepG2 подвергаются К-ГХГ были заметно повреждены. Рассеянные митохондрии были слегка заметно расширены, неправильной формы, и митохондриальный хребет исчез с относительно ненормальной митохондриальной архитектурой(рисунок 1).

Средняя митохондриальная зеленая интенсивность флуоресценции, которая представляет собой митохондрии, снизилась в клетках HepG2, подвергшихся воздейс.......

Discussion

Решающее значение для успеха протокола обнаружения имеет использование различных экспериментальных методов, которые были охвачены исследования от фенотипа к механизму. В этом исследовании клетки HepG2 были откоучались в DMEM с пенициллином и стрептомицином и 10% сыворотки крупного рогатого скота плода. Когда клетки достигли 40-50% слияния, З-ГХГ (0, 10, 100 нг/мл) были добавлены и инкубированы в течение 24 ч. Во-первых, мы использовали TEM, который показал ультраструктурные изменения в гепатоцитах, вызванные репрезентати.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Просвечивающий электронный микроскоп	FEI	Tecnai G2 Spirit Bio TWIN	Высококонтрастная визуализация с высоким разрешением, Наблюдение и визуализация с низкой дозой, Наблюдение за низкой температурой, Выдающиеся аналитические характеристики, Автоматизация для удобства и производительности
Mito-Tracker Green	Beyotime	C1048	Mito-Tracker Green - это митохондриальный зеленый флуоресцентный зонд, который можно использовать для митохондриального флуоресцентного окрашивания живых клеток.
Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп	Zeiss	700B	Конструкция компактна, стабильна, световой путь самый короткий, высокая точность света, творческие технологии и сложные технологии сканирования вместе для  создания идеального трехмерного изображения образца.
Набор для расширенного анализа АТФ	Beyotime	S0027	Набор для расширенного анализа АТФ может быть использован для определения уровня АТФ (аденозин-5'-трифосфата) в обычных растворах, клетках или тканях. Образцы клеток и тканей могут быть разделены для завершения пробоподготовки, чувствительность обнаружения до 0,1 нмоль/л, хемилюминесценция может поддерживаться в течение 30 минут.
Люминометр		Berthold Centro LB 960	Люминометр представляет собой хемилюминесцентный детектор, сам испытуемый образец может быть светлым, не нуждается в стимуляции. Люминометр – это прибор, который обнаруживает хемилюминесценцию.
Набор для анализа белка BCA	Beyotime	P0012	Набор для анализа белка BCA является одним из наиболее часто используемых методов определения концентрации белка.
Многорежимный считыватель	TECAN	InfiniteM200	Многорежимный считыватель может использоваться для определения согласия белка.