Протокол для отбора в пробирке и характеризация конкретных групп фталевой кислоты Эстер связывания ДНК аптамеры представлен. Применение выбранного aptamer в электрохимических aptasensor также входит в стоимость номера.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Фталевая кислота Эстер связывания ДНК Aptamer выбор, характеристика и применение к электрохимическим Aptasensor
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Фталекислотные эфиры (Паэс) areone основных групп стойких органических загрязнителей. Конкретных групп обнаружения Паес весьма желательно из-за быстрого роста конгенеров. ДНК аптамеры чаще применялись как признание элементов на биосенсор платформах, но выбор аптамеры целей высокой гидрофобностью малые молекулы, такие как Паес, редко сообщается. Эта работа описывает метод, основанный на шарик, предназначенные для выбора конкретной группе аптамеры ДНК для Паес. Амино-группы функционализированных Дибутилфталат (DBP-NH2) как цель якорь был синтезирован и иммобилизованных на эпоксидной активированный агарозы бусы, позволяя отображения группы фталиевый Эстер на поверхности иммобилизации матрицы, и Поэтому выбор конкретной группе связующих. Константы диссоциации aptamer кандидатов определяется количественным полимеризации цепной реакции в сочетании с магнитной сепарации. Относительный близость и избирательности аптамеры для других Паес были определены конкурентоспособные анализов, где aptamer кандидатов были предварительно ограниченной в DBP-NH2 придают магнитные бусы и выпущен в надосадке после инкубации с протестированных Паес или других потенциальных помех веществ. Конкурентоспособных assay был применен потому, что она предоставила снисходительный сродство сравнения среди Паес, которые не функциональными группами для иммобилизации поверхности. Наконец мы продемонстрировали изготовление электрохимическая aptasensor и использовал его сверхчувствительная и селективного выявления бис(2-этилгексил) фталат. Этот протокол обеспечивает понимание aptamer открытие других гидрофобные малых молекул.
Введение
Наряду с быстрого экономического развития ускорение индустриализации и городского строительства, загрязнения окружающей среды является более суровым, чем когда-либо. Типичными загрязнителями окружающей среды включают в себя ионов тяжелых металлов, токсинов, антибиотиков, пестицидов, эндокринные расстройства и стойких органических загрязнителей (СОЗ). Помимо ионов металлов и токсинов, других загрязнителей являются малые молекулы, что довольно часто состоят из различных родственных соединений. Например, наиболее токсичных СОЗ включают полихлорированных дифенилов (ПХД), полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), полибромированные дифенил эфиров (ПБДЭ), полихлориро....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Библиотека и конструкции праймера и синтез
-
Дизайн первоначальной библиотеки и грунтовки.
Библиотека (0бассейн): 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-N40-CCTTTCTGTCCTTCCGTCAC-3'
Вперед грунтовка (ПС): 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-3'
Фосфорилированных обратный грунтовка (PO4- RP): 5'-PO4- GTGACGGAAGGACAGAAAGG-3' - Синтезировать0бассейн, FP и PO4- RP, используя стандартные фосфорамидит химия18,19,20и очистить все ННО, стандартных высокопроизводительных жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Мы разработан и синтезированных аминогруппы функционализированных Дибутилфталат (DBP-NH2) как цели привязки (Рисунок 1F). Затем мы провели ДНК aptamer выбор Паес, используя DBP-NH2 как объект привязки и после классической целевого метода на основе иммобилизации (рис. 2). В каждом раунде экспериментальный ПЦР проводилось с использованием денатурированного страницы для оптимизации цикла количество PCR (
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Одним из выдающихся преимуществ аптамеры является, что они идентифицируются посредством метода в vitro SELEX, в то время как антитела создаются через immunoreactions в естественных условиях . Таким образом аптамеры могут быть выбраны с желаемой цели специфичности в хорошо продуманных экспериментальных условиях, в то время как антитела являются ограниченными в физиологических условиях.
Чтобы облегчить разделение связанных последовательностей от свободной последовательности, не.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют не конкурирующие финансового интереса.
Благодарности
Мы признательны за финансовую поддержку от национального фонда естественных наук (21675112), проект ключ плана науки и технологии Пекина образования Комиссии (KZ201710028027) и Яньцзин молодой ученый программа Capital Normal University.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| UV-2550 | Shimadzu, Японский | протокол, раздел 3.8.2 | |
| DNA Engnine Thermal Cycler, PTC0200 | BIO-RAD | раздел 3.5.1.2 и 3.5.2 | |
| C1000 Touch | BIO-RAD | раздел 5.3.6 и 6.3 | |
| VMP3 многоканальный потенциостат | Bio-Logic Science, Клэ, Франция | разделы 7.4,7.8 и 7.11 | |
| Эпоксидная активированная сефароза 6B | GE Healthcare (Пискатауэй, Нью-Джерси, США) | 10220020 | аргарозные шарики, раздел 2.3 и 3.3 |
| Dynabeads M-270 магнитные шарики карбоновой кислоты | Invitrogen, США | 420420 | магнитные шарики, раздел 5.2. и 5.3 |
| Premix Taq Hot Start Version Takara | , Далянь, Китай | R028A | полимераза, раздел 3.5.1.1 |
| PARAFILM Герметизирующая мембрана | Bemis, США | PM-996 | раздел 3.6.5 |
| Лямбда-экзонуклеаза | Invitrogen, США | EN0561 | раздел 3.7.1.2. Реакционный буфер 10 × предоставляется поставщиком вместе с λ экзонуклеазой. |
| Dr. GenTLE Носитель осадков | Такара, Далянь, Китай | 9094 | раздел 3.6.2 и 3.8.1 |
| UNIQ-10 PAGE Набор для восстановления ДНК | Sangon Biotech (Шанхай) | B511135 | раздел 4.2 |
| SYBR Золото Гель для нуклеиновых кислот | Invitrogen, США | 1811838 | краситель для нуселиновой кислоты, раздел 3.5.1.5 |
| Премикс SYBR Ex Taq II | Takara, Далянь, Китай | RR820A | полимеразная смесь контаназная полимераза и днтф, раздел 5.3.5 |
| 2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота (MES) | Sigma-Aldrich | CAS: 1132-61-2 | раздел 5.2.1 |
| 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида гидрохлорид (EDC) | Invitrogen, США | CAS: 25952-53-8 | раздел 5.2.2 |
| N-гидроксисукцинимид (NHS) | Sigma-Aldrich | 6066-82-6 | раздел 5.2.3 |
| меркаптогексанол (MCH) | Sigma-Aldrich | CAS: 1633-78-9 | раздел 7.7 |
| Золотой электрод | Shanghai Chenhua | CHI101 | раздел 7.4. - 7.11 |
| трис(2-карбоксиэтил) фосфина гидрохлорид (TCEP) | Sigma-Aldrich | CAS: 51805-45-9 | раздел 7.5 |
| O-(2-меркаптоэтил)-O'-метил-гекса-(этиленгликоль) | Sigma-Aldrich | CAS: 651042-82-9 | раздел 7.7 |
| диэтилгексилфталат (DEHP) | Национальный институт метрологии, Китай | CAS: 117-81-7 | раздел 7.11 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | CAS: 9005-64-5 | полиоксиэтилен(20) сорбаитана монолаурат |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | CAS: 9002-93-1 | неионогенный поверхностно-активный агент |
| PBS | Sigma-Aldrich | P5368 | 10 мМ фосфатный буфер содержит 1 М NaCl, pH 7,4 |
Ссылки
- Vorkamp, K., Riget, F. F. A review of new and current-use contaminants in the Arctic environment: Evidence of long-range transport and indications of bioaccumulation. Chemosphere. 111, 379-395 (2014).
- Net, S., Sempere, R., Delmont, A., Paluselli, A., Ouddane, B.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
