Method Article

Создание Cardiomyocyte изучить роль сотовой архитектуры в биологии систем Cardiomyocyte геометрическая модель структурно реалистичные конечных элементов

DOI:

10.3791/56817

⸱

April 18th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cell Structure and Mechanobiology Group, University of Melbourne, 2Systems Biology Laboratory, Melbourne School of Engineering, University of Melbourne, 3Department of Biomedical Engineering, University of Melbourne, 4School of Mathematics and Statistics, Faculty of Science, University of Melbourne, 5Department of Engineering Science, University of Auckland, 6Advanced Microscopy Facility, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne, 7ARC Centre of Excellence in Convergent Bio-Nano Science and Technology, University of Melbourne, 8School of Medicine, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, University of Melbourne, 9Living Systems Institute, University of Exeter

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает Роман метод для создания пространственно подробные конечно-элементной модели внутриклеточных архитектуры кардиомиоцитов из электронной микроскопии и confocal микроскопии изображений. Сила этой пространственно подробные модели показано с помощью тематических исследований в сигнализации кальция и биоэнергетика.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С появлением трехмерных (3D) изображения технологии, такие как электронная томография серийный блок лицо сканирующей электронной микроскопии и конфокальная микроскопия, научное сообщество имеет беспрецедентный доступ к большим наборам данных в суб микрометра резолюции, которые характеризуют архитектурных ремоделирования, что сопровождает изменения в функции cardiomyocyte в здоровье и болезни. Однако эти наборы данных были использованы для изучения роли сотовой архитектуры ремоделирования cardiomyocyte функции. Целью настоящего Протокола является наметить способы создания точной конечно-элементной модели cardiomyocyte с помощью электронной микроскопии высокого разрешения и confocal микроскопии изображений. Подробную и точную модель сотовой архитектуры имеет значительный потенциал для обеспечить новое понимание cardiomyocyte биологии, больше, чем только эксперименты можно набрать. Сила этого метода заключается в его способности вычислительно предохранитель информацию от двух разнородных изображений условия ультраструктуры cardiomyocyte развивать одной единой и подробные модели cardiomyocyte. Этот протокол описывает шаги для интеграции электронная томография и confocal микроскопии изображений взрослых мужчин кардиомиоцитов крыс Wistar (имя для конкретной породы альбинос крысы) разработать половину Саркомер элементную модель cardiomyocyte. Процедура создает 3D элементную модель, содержащую точные, с высоким разрешением изображения (порядка ~ 35 Нм) распределения митохондрий, миофибрилл и рианодиновыми рецептор кластеры выпустить необходимые кальций для cardiomyocyte сокращение от sarcoplasmic ретикулярной сети (SR) в Миофибриллы и цитозольной отсек. Модель, созданная здесь, как иллюстрации не включать детали архитектуры поперечно трубочка или sarcoplasmic сети ретикулярные и поэтому является минимальным модель cardiomyocyte. Тем не менее, модель может применяться уже в на основе моделирования расследование роли клеточной структуры в сигнализации и митохондриальной Биоэнергетика кальция, который иллюстрируется и обсудили с помощью двух тематических исследований, которые представлены после подробный протокол.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Муфта (ECC) возбуждения сокращение в самом сердце относится к важной и сложной муфты между электрического возбуждения cardiomyocyte мембраны и последующих механическое сокращение ячейки во время каждого сердцебиение. Математические модели играют ключевую роль в разработке количественных понимания взаимосвязанных биохимических процессов, которые регулируют потенциал действия1, цитозольной кальция, сигнализации2, биоэнергетика3и последующие поколение сократительной силы. Такие модели также успешно предсказал изменения пульса, когда один или несколько из этих биохимических процессов претерпевают изменения4,5. Все было признано высоко организованной Ультраструктура cardiomyocyte играть критически важную роль в нормальной сократительной функции клетки и всем сердцем. Действительно изменения морфологии и организации компонентов сердечной ультраструктуры происходят параллельно биохимические изменения в условиях заболевания как гипертрофия6, сердечной недостаточности7и8Диабетическая кардиомиопатия. Ли эти структурные изменения являются незначительными, адаптивной или патологических ответы на изменение биохимических условий по-прежнему во многом неизвестным9. По своей сути тесную связь между формой и функцией в биологии означает, что экспериментальные исследования самостоятельно не может обеспечить более глубокое понимание чем корреляции между структурной реконструкции и cardiomyocyte функции. Новое поколение математических моделей, которые могут включать структурные Ассамблея субклеточном компонентов, а также хорошо изучены биохимические процессы, являются необходимыми для разработки всеобъемлющей, количественное понимание взаимосвязи между структурой, биохимии и сократительной силы кардиомиоцитов. Этот протокол описывает методы, которые могут использоваться для создания структурно точных конечных элементов модели кардиомиоцитов, который может использоваться для таких расследований.

В последнее десятилетие наблюдается значительный прогресс в 3D электронной микроскопии10, конфокальная11и микроскопии суперразрешением12 , которые обеспечивают беспрецедентное, с высоким разрешением понимание нано- и микро масштабе Ассамблеи субклеточном компоненты cardiomyocyte. Недавно эти наборы данных были использованы для создания вычислительных моделей cardiomyocyte Ультраструктура13,14,,1516. Эти модели использовать налаженные инженерного моделирования метод, называемый метод конечных элементов17, для создания конечных элементов вычислительной сетки над какие биохимические процессы и cardiomyocyte схватки могут быть смоделированы. Однако эти модели ограничены резолюции и подробно, что микроскопии метод может предоставить в наборе данных изображения. К примеру электронной микроскопии может генерировать нанометрового уровня детализации структуры клеток, но это трудно определить специфических белков в пределах изображения, которые будут необходимы для создания модели. С другой стороны, супер резолюции оптической микроскопии могут обеспечить высокий контраст изображения с разрешением порядка 50 Нм только выбрать несколько молекулярных компонентов клетки. Только путем включения дополнительной информации от этих изображений форм можно один реально изучить чувствительность функции изменения в структуре. Корреляционные света и электронной микроскопии до сих пор не является обычной процедурой и она по-прежнему будет страдать ограничение что только ограниченное число компонентов могут витражи в представлении иммунофлюоресценции и коррелирует с видом электронной микроскопии.

Этот протокол представляет новый подход18 , которая использует19 статистические методы для анализа и вычислений предохранитель световой микроскопии информации на пространственное распределение каналов иона с электронной микроскопии информацию о других сердечных Ультраструктура компоненты, такие как миофибрилл и митохондрии. Это производит элементную модель, которая может использоваться с биофизические модели биохимических процессов для изучения роли cardiomyocyte субклеточном Организации на биохимические процессы, которые регулируют cardiomyocyte сужением. Например этот протокол может использоваться для создания моделей из здоровых и Стрептозотоцин индуцированной сахарным диабетом культивировании для изучения влияния структурной реконструкции на функции сердечной клетки, которая наблюдается в диабетической животных моделей8. Дополнительным преимуществом статистического характера представленных метода также иллюстрируется в протоколе: метод может генерировать несколько экземпляров конечных элементов геометрии, которые тесно имитировать экспериментально наблюдаемого изменения клеточной структуры.

Как обзор, протокол шаги включают: (i) подготовка сердечной ткани для электронной микроскопии для создания 3D изображения с достаточным разрешением и контрастностью; (ii) восстановления и сегментация 3D изображения стеков данных электронной микроскопии с помощью реконструкции 3D электронная микроскопия и анализ изображений программное обеспечение под названием IMOD20; (iii) использование iso2mesh21 для генерации сетки конечных элементов, используя сегментирована данные в качестве входных данных; (iv) использование Роман алгоритм и коды для картирования распределения ионных каналов на сетки конечных элементов.

Посылка подхода к каждый шаг описан в рамках протокола, и представитель результаты предоставляются в сопутствующих данных. Обзор приводится указание, как созданный пространственно подробные модели могут использоваться для изучения пространственной динамики кальция во время ECC, а также митохондриальной биоэнергетики. Обсуждаются некоторые из текущих ограничений протокола, а также новые события, которые идут по их преодолению и дальнейшего продвижения количественное понимание роли клеточной структуры к биологии сердечной системы. Рассматривается также как эти методы могут быть обобщены для создания модели конечных элементов других типов клеток.

Пользователи этого протокола может пропустить шаг 1 и реконструкции частью шаг 2, если они имеют доступ к ранее существовавших стек изображений электронной микроскопии. Пользователи, которые намерены приобретать их данных в сотрудничестве с более опытными microscopists электрон, возможно, пожелает обсудить и сравнить фиксации и окраски процедуры на шаге 1 с экспертом, чтобы определить оптимальный протокол для приобретения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все методы, описанные здесь были одобрены университета Окленда животных по этике и Калифорнийского университета Сан-Диего институционального ухода за животными и использования Комитета, где был первоначально разработан протокол ткани.

1. Экспериментальная подготовка

  1. Подготовка решения штока 0,15 и 0,3 М натрия cacodylate буферов при рН 7,4 согласно таблице 1.
  2. Подготовить глютаральдегид фиксатором (2% параформальдегида (PFA) + 2,5% глютаральдегид дубильной кислоты 0,2% в 0,15 М натрия cacodylate buffer, рН 7,4) с использованием компонентов, перечисленных в таблице 1.
    1. Растворите 2 g порошка ПФА в 20 мл дистиллированной воды при температуре 60 ° C на конфорку при постоянном перемешивании.
    2. Добавьте 1 М растворе NaOH до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.
    3. Подождите, пока температура раствора не ниже 40 ° C, а затем добавить 10 мл в низкотемпературном растворе глютаральдегида и 20 мл 0,3 М натрия cacodylate.
    4. Добавить 0,2 г дубильной кислоты и растворить его в решение.
    5. Добавьте 50 мл cacodylate натрия 0,15 М.
    6. Хранить три или четыре 20 мл флаконов сцинтилляционные фиксатором в холодильнике при температуре 4 ° C, или на льду, если используется в тот же день.
  3. Готовят раствор Tyrode в с 20 мм 2,3-butanedione monoxime (BDM), по рецепту в таблице 1.
  4. Постройте Langendorff аппарат внутри вытяжной шкаф.
    1. Зажим два 100 мл Пластиковый шприц-тюбиков для двух разных реторты стоит, около 70 см в высоту от подставку.
    2. Подключите Пластиковый шприц-тюбиков и соединитель трубки с помощью 3 мм внутреннего диаметра труб и трехходовой кран, как показано на рисунке 1.
    3. Установите канюля наружный диаметр 3 мм в нижней части трубы, где сердце будет связано для перфузии фиксации разъема.
  5. Заполните шприц-тюбиков с Tyrode в раствор и фиксирующие решения при 37 ° C.
    1. Удалите пузырьки воздуха внутри трубы, передавая шприц решения через них.

2. приобретение данных электронной микроскопии ультраструктуры Cardiomyocyte

  1. Подготовьте животное для обрезания и химической фиксации сердца.
    Примечание: Этот протокол подробно описаны шаги для обработки взрослых мужчин крыс Wistar (имя для конкретной породы альбинос крысы) сердечной ткани. Протокол может потребовать изменения, когда сердечной ткани поступает из других видов.
    1. Анестезировать животного, рассматривая крыса (200-250 г по массе тела) с 0,5 мл 250 ед/мл гепарина через внутрибрюшинной инъекции. Подождите 10 минут, а затем лечить Крыса с внутрибрюшинного введения Пентобарбитал (210 мг/кг веса тела).
    2. Подтвердите надлежащей степени анестезии, тестирование мыс щепотку рефлекс.
    3. Усыпить животных на шейки матки дислокации.
    4. Урожай, сердце, с использованием процедур вскрытия похож на ранее опубликованных статей JoVE22,23, затем поместите его в ледяной засолены.
    5. Изолировать восходящей части аорты и иглу. Убедитесь, что кончик канюлю сидит чуть выше полу лунного клапан, где ветви коронарных артерий. Привяжите нить плотно вокруг восходящей части аорты.
    6. Подключите канюлю к гравитации инициативе Langendorff аппарат работает на ~ 70 см над основанием системы (рис. 1).
    7. Поверните кран на системе Langendorff perfuse сердце с Tyrode в решения, в том числе 20 мм БДМ (ингибитор миозина) для 2-3 мин.
    8. Поверните кран начать перфузии с фиксатором параформальдегида 2%, глютаральдегид 2,5% и 0,2% дубильной кислоты в 0,15 М cacodylate натрия при 37 ° C за 10 мин. В случае успеха, сердце будет повернуть Бледно-коричневый и стать жесткой и резиновой.
    9. С помощью лезвия бритвы, вскрыть блоков ткани от левого желудочка (боковой) бесплатные стены и получить ткани блокирует около 1 мм3 размер.
    10. Храните образцы в предварительно охлажденным 20 мл флаконов сцинтилляционные же фиксатором на льду 2 h. хранить столько образцов максимально во флаконах и убедитесь, что образцы погружали в решении.
      Предупреждение: Важно сохранить образцы холодного до и после 100% обезвоживания шаг ниже.
  2. Дальнейшей фиксации и окрашивания образцов для электронной микроскопии.
    1. Залить 100 мл 0,15 М натрия cacodylate буфера в стеклянный стакан и остудить на льду.
    2. Подготовьте равных объемах 4% осмия тетраоксид и 0,3 М cacodylate натрия, с последующим добавлением 0,08 г Ферроцианид калия сделать метал пятно раствор, содержащий 2% Ферроцианид калия в 2% осмия тетраоксид и 0,15 М натрия cacodylate. Прохладный решение на льду.
    3. Пипетка фиксатор и заменить его на достаточно холодные 0,15 М натрия cacodylate буфер погружаться проб в пробирки. Место флаконов на льду на 5 мин.
    4. Повторите шаг 2.2.3 еще четыре раза с 0,15 М cacodylate натрия для удаления избыточных фиксатором.
      Предостережение: Не используйте Пипетки стеклянные потому что крошечные осколки могут попасть в выборку и может испортить Ножи алмазные при резании блока ткани. Это важно для предварительного охлаждения всех решений на льду перед их добавлением в образце. Важно также, что образец остается покрыта решения все время (очень короткие периоды частичного покрытия, продолжительностью не более чем на несколько секунд может кратко переносится во время решения обменов). При мытье или замене решения, добавьте новое решение быстро после удаления предыдущего решения. Держите сцинтилляционные флаконов на льду между моет. Обратите внимание, что этот шаг не является время чувствительной, блоков ткани могут быть вымыты немного дольше, если это необходимо.
    5. Заменить натрия cacodylate буфер с ледяной хэви-метал пятно раствором и хранить его на льду на ночь. Убедитесь, что Ферроцианид смешивается хорошо встряхнув флакона вручную; решение должно черным.
      Предупреждение: Работа в вытяжной шкаф при выполнении этот шаг, потому что осмий является токсичным.
    6. Разбавляют 4% водный уранила ацетат (UA) раствор (Таблица 1) до 2%, с использованием равных объемах запасов UA решения и двойной дистиллированной воды и охладить его на льду.
    7. Замените охлаждают льдом 0,15 М натрия cacodylate буфер пятно хэви-метал и пусть образца Инкубируйте 5 мин на льду.
    8. Повторите шаг 2.2.7 еще четыре раза на льду, чтобы смыть пятно решение любой избыток хэви-метал.
    9. Промойте образцы четыре раза, с периодом ожидания 2-мин между ними в очищенной воде (двойной дистиллированной является достаточно).
    10. Заменить очищенная вода с ледяной 2% UA и пусть образец Инкубируйте 60-120 мин на льду.
    11. Остыть 5 ампул сцинтилляционные 20 мл этанола (достаточно, чтобы потопить образцы) на льду, который будет использоваться на шаге обезвоживания. 6 флаконов имеют увеличение доли этанола в дистиллированной воде: 20%, 50%, 70%, 90% и 100%.
    12. Залейте чистый ацетон в еще один флакон 20 мл сцинтилляции и прохладный на льду вместе с флакона этанолом.
    13. Промойте образцов в очищенной воде четыре раза с периодами ожидания 2 минут на льду мыть избыток UA.
  3. Обезвоживает образцов в этиловом спирте.
    1. Обезвоживает в серии холодного этанола, последовательно заменив решения внутри флакона пример следующим образом, на льду: 20% этанола для 10 мин; 50% этанола для 10 мин; 70% этанол 10 мин; 90% этанола для 10 мин; затем дважды в 100% этанола за 10 мин.
    2. Переход образца до комнатной температуры, заменив окончательный 100% этанола с охлаждением чистый ацетон и место флакон образца на стенде лаборатории комнатной температуре втечение 10 мин.
    3. Выполните одно больше 10 мин мыть в чистый ацетон при комнатной температуре для удаления конденсата, что наблюдается в рамках флаконов. Во время инкубации, составляют решения ацетон/смолы.
    4. Замените чистый ацетон во флаконах 50: 50 чистый ацетон и эпоксидной смолы (с пропорциями для эпоксидной смолы компонентов как указано заводом-изготовителем). Используйте все компоненты из той же партии. Оставьте на ночь смолы заполненный образец флаконов на ротор.
  4. Внедрите образцы смолы.
    1. Замените 75% смолы (25% ацетона) 50: 50 смолы и Инкубируйте 3 h, последовали дальнейшие инкубации/проникновения в 100% смолы для 4 ч при комнатной температуре.
    2. Замените свежей смолой 100% 100% смолы и оставить образец флаконов на ночь для глубокого проникновения смолы в образцах тканей.
    3. Взять образцы из флаконов и поместить их в контейнеры, которые являются печи чистые и имеют плоское основание; алюминий или серебряная фольга, выпечки чашки может использоваться для этой цели, например.
    4. Осторожно налить (чтобы избежать перемещения образцов) свежей смолой над образцы (таким образом внедрить образцы смолы) и полимеризации смолы и образцов в духовке при 60 ° C в течение 48 часов.
  5. Переориентировать смолы блоков ячеек изображения в поперечном сечении.
    1. Получите 1 мкм секции толщиной теста с использованием ultramicrotome с ножом стекла для оценки ориентации клетки24блоков смолы.
    2. Пятно толщиной испытания секций для 20 s с 1% толуола синий и 1% буры.
    3. Изучите мышечных клеток ориентации под микроскопом светлые области.
    4. Основываясь на ориентацию, выведено из образов разделов цветного теста, переориентировать продольно или косо ориентированных (аналогично рис. 2A) смолы блоки, чтобы обеспечить, что клетки подвергаются нож стекла так, что они будут сокращены в поперечном ( Аналогично Рисунок 2B).
  6. Разделах ткани изображения с помощью томографии электрона.
    1. Получить тонкий секции (~ 300 Нм) переориентирована ткани блоков с помощью алмаза нож и передачи секции на медной сетки25.
    2. Пятно толстые секции с 2% UA и Сато свинец25.
    3. Примените коллоидных частиц золота на обеих сторонах разделы25.
    4. Получите наборы серии единого или двойного оси наклона проецируемого изображения от-70 ° до + 70 °25.
  7. Для реконструкции стека 3D изображений (серия 2D изображения, которые обеспечивают 3D-информацию в разделе томография одного электрона) использовать IMOD20 клеток. Этот реконструированный стек будет дробиться на следующем шаге.

3. сегмент миофибрилл и митохондрий регионов из набора данных 3D изображения EM

  1. Выполните программу IMOD «3dmod».
  2. В рамках 3dmod графический интерфейс пользователя, введите адрес «.rec» или «.mrc» файл, который содержит 3D реконструкции изображений набора данных ячейки (созданного на шаге 2.7) в поле с надписью «изображение файл(ы):», затем нажмите «OK».
  3. В меню «Файл», выберите пункт Новая модель, а затем сохраните файл с соответствующим именем, с помощью «Сохранить модель как»... пункт меню «Файл».
    Примечание: Объект в IMOD может содержать коллекцию сегментирована компонентов, которые составляют «объект». По умолчанию новая модель содержит новый объект с идентификатором «#1».
  4. Под «Специальных» меню выберите «Инструменты рисования». Это откроет новую панель инструментов, аналогичный показанному на рисунке 3A.
    Примечание: Существует несколько инструментов, которые могут быть использованы для создания контуров вокруг границ различных органеллы. Дополнительная помощь по пути использования этих инструментов можно найти в документации по20 IMOD.
  5. Выберите параметр «Лепить» в меню «Инструменты рисования» и наведите указатель мыши в окне изображения; круговой контур, сосредоточены на указателя мыши появится.
  6. Удерживая среднюю кнопку мыши над митохондрий (тёмные файлов изображений, как показано по демаркации с зеленым контурных линий на рисунке 3A), перетащите периметр круга контура в форме его границы.
  7. После того, как завершится оконтуривание границы митохондрий, отпустите среднюю кнопку и повторите шаги 3.6 для каждого митохондрий в данных. Каждый контур будет автоматически распознаваться IMOD как новый контур в том же объекте.
  8. Под «Edit | Объект «меню, выберите «Новый» для создания нового объекта. Это будет автоматически увеличить общее количество объектов на один и присвоить этот номер в новый объект.
  9. Повторите шаги, 3,6 и 3,7 сегмента и сохранять контуры миофибриллы.
  10. Повторите шаг 3,8, последовал шаг 3,6, сегмент границы ячейки также.
  11. Сохраните файл модели в меню «Файл».
  12. Выполните следующие команды в окне командной строки для преобразования каждого объекта, группировка в двоичный маски, как показано на рисунке 4A-C.
    1. Извлечение объекта из модели «imodextract объект modelfile outputmodelfile» где «объект» — номер объекта, чтобы извлечь.
    2. Создать маску для этого объекта: imodmop-маска 255 outputmodelfile imagefile outputmask.mrc
    3. Преобразуйте файл в tif стека: mrc2tif -s outputmask.mrc outputmask.tif

4. Создание сетки конечных элементов с сегментированным компонентов

  1. Iso2mesh-это свободно распространяемая программа MATLAB преобразовать TIFF стеки изображений в объемный четырехгранный конечных элементов сетки. Скачать и добавьте iso2mesh в MATLAB путь от iso2mesh.sourceforge.net.
  2. Скачайте исходные коды и данных для моделирования RyR кластеров на сетку из https://github.com/CellSMB/RyR-simulator сайт github.
  3. Запустите приложение CardiacCellMeshGenerator MATLAB (рис. 5).
  4. Загрузите компонент маски различные органеллы в MATLAB, используя три кнопки на верхней левой стороне GUI.
  5. Создайте еще один двоичный образ стека, который разграничивает пробелы между миофибрилл и митохондрий как показано на рисунке 6A.
    1. Откройте ImageJ.
    2. С помощью файла | Открыть диалоговое окно, нагрузки tiff стеки миофибрилл и митохондрий в программу.
    3. Инициировать плагин добавлением изображения, выбрав «процесс | Калькулятор плюс».
    4. Выберите стек изображений Миофибриллы i1, митохондрии изображение стека как i2 и выбрать «Добавить» оператора. Нажмите кнопку «ОК».
    5. После того, как новый стек изображений, представляющий результат 4.5.4 появляется, выберите «Редактировать | Инвертировать» для создания стека изображений похож на рисунке 6A.
  6. Загрузите файл, содержащий двоичное изображение стека разрывов между миофибрилл и митохондрии, нажав на кнопку «RyRGapsFile» по программе CardiacCellMeshGenerator.
  7. Нажимаем «Создать сетку» на GUI. Это вызовет iso2mesh команды v2m с параметром «cgalmesh» для создания тетраэдрической сетки похож на рисунке 4E. Три файла будет выводиться в конце этого шага: файл .ele, файл .face и .node файл, который будет содержать список узлов, которые составляют элементы, узлы, которые составляют лица и координаты узлов , соответственно.

5. математически карта пространственно различной плотности ионных каналов интерес на сетки конечных элементов.

  1. Генерировать необходимые материалы для RyR-симулятор, нажав кнопку с надписью создать RyR-симулятор входов на GUI.
    Примечание: Кнопка будет вызывать функцию generateRyRsimulatorInputs.m, которая использует следующие данные из шага 4 для создания входы:
    (1) outDir: расположение выходных файлов, которые необходимы для моделирования RyR кластера.
    (2) imres: пикселей в трех направлениях стеки изображений.
    (3) myofibril_file: файл, содержащий двоичное изображение стека как показано на Рисунок 4B.
    (4) sarcolemma_file: файл, содержащий двоичное изображение стека как показано на Рисунок 4A.
    (5) ryrgaps_file: файл, содержащий двоичное изображение стека как показано на рис 5A.
    1. После выполнения этой функции, проверьте, что были созданы следующие файлы в каталог, указанный как outDir путь:
    • d_axial_micron.txt, который представляет осевое расстояние между позицией z-диска и остальная часть пикселов в стек изображений.
    • d_radial_micron.txt, который представляет евклидово расстояние (за исключением осевой компонент) от каждого пикселя в наборе возможных мест RyR кластера точек на плоскости z диска.
    • W_micron.txt, который представляет список пространственных координат всех доступных позиций для RyR кластеров присутствовать.
    • Оставшиеся 3 файлы в папке содержат суффикс «_pixel» вместо «_micron» для обозначения, что значения в этих файлах были написаны в виде координат пиксела.
  2. Имитировать RyR кластера распределений в стеке бинарного образа миофибрилл.
    1. Нажмите кнопку с надписью «Open RyR симулятор в R» инициировать программу R.
    2. На R-gui, выберите «файл | Open» и найдите файл «параметры. R» в пакете RyR-тренажер (RyR-симулятор / / параметры источника. R).
    3. Также откройте файл ryr симулятор параллель. R, (расположен в RyR-симулятор/источник/ryr симулятор параллель. R). сред, как Rstudio (https://www.rstudio.com) или простой интерфейс командной строки может использоваться, например с помощью команды R64 в окне оболочки или команды.
    4. Измените параметры в настройках. R файл как описано ниже:
      1. Установить адрес папки, содержащей файлы, перечисленные в 5.1.2 для экспериментально полученных конфокальное изображение стека RyR кластеров и миофибрилл Path2.
        Примечание: Github хранилища папки ввода файлы/мастер ячейка уже содержит файлы, которые были созданы для стека ранее собранные изображения.
      2. Задать Path4 в адрес папки, где хранятся файлы, которые были созданы на шаге 5.1.2.
      3. Установите точку Path3 в папку, где пользователь хочет имитируемых места RyR кластера должен быть сохранен.
      4. Значение N количество кластеров RyR, чтобы быть смоделированы в модели (обычно в диапазоне от 200 до 300).
      5. Установите etol, терпимости, Настройка, разница между экспериментально измеренная пространственного распределения RyR кластеров и модель моделировать пространственное распределение RyR кластеров.
      6. Задать numIter, чтобы ограничить количество попыток, которые RyR-симулятор следует принять, чтобы найти шаблон имитируемых кластера RyR, который удовлетворяет etol значение.
        Примечание: Значения для etol и numIter установлены типичные значения параметров. R файла.
      7. Установить количество различных моделей кластеров RyR, которые пользователь хочет, чтобы имитировать numPatterns (как правило, это полезная практика имитации 99 шаблоны для статистических доверия).
      8. Задать numCores возможность использования нескольких потоков ЦП (ядра) для быстрее параллельной обработки с R для имитации точки модели.
    5. Проверьте, что следующие пакеты устанавливаются с помощью пакетов установщика gui в снег, doSNOW, doparallel, foreach, итераторы и rgl R:.
    6. Выполнение симулятор, введя следующую команду в окне командной R: источник (' путь к ryr симулятор параллель. R', chdir = TRUE)
      Примечание: RyR-симулятор программы выводится список файлов .txt (будет создан файл numPatterns), которые содержат списки координат в N строк и 3 столбцов, которые представляют x, y и z координаты N моделировать RyR кластеров.
  3. Карта как пространственной плотности на вычислительные модели с помощью CardiacCellMeshGenerator.
    1. Выбрав кнопку с надписью «Выберите файл точек RyR», выбрать имитируемых RyR кластера распределения текстовый файл от тех, которые были производства по RyR-симулятор.
    2. Выполните «RyR плотность Mapper» на GUI в MATLAB. Это будет карта пространственного расположения имитируемых RyR кластеров в txt-файл в шаге 5.3.1 на сетки конечных элементов, который был создан в шаге с помощью метода, называемого сферической ядра интенсивности оценщик метод264.8.
      Примечание: Результатом этого шага является файл с расширением .txt, который содержит список значений для числовых плотности ионного канала на единицу объема сферических на каждом из узлов вычислительной сетки.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рисунок 2 через Рисунок 7 обеспечивают представитель результаты нескольких ключевых шагов в настоящем протоколе: (i) визуализации и переориентации блоков ткани для поперечного сечения электронной микроскопии просмотров; (ii) создание стека изображений 3D электронной микроскопии; (iii) сегментации субклеточном Ультраструктура для органеллы интерес; (iv) создание сетки конечных элементов с помощью iso2mesh; (v) имитация реалистичны...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вышеупомянутый Протокол описываются ключевые шаги для создания Роман элементного геометрическая модель ультраструктуры cardiomyocyte. Этот метод позволяет вычислительных слияние различных микроскопии (или, в принципе, другие данные) условия для разработки более всеобъемлющей модели вычислений cardiomyocyte динамики, которая включает в себя детали архитектуры пространственных клеток. Существует в настоящее время нет других доступных для создания такой модели cardiomyocyte протокол.

Шаг 1 излага...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Королевского общества Новой Зеландии Марсден быстро начать Грант 11-UOA-184, человека границ науки программы исследовательский грант RGP0027/2013 и Австралийский исследовательский совет обнаружения проекта Грант DP170101358.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Materials
Calcium ChlorideSigma-AldrichC8106
Magnesium ChlorideSigma-AldrichM2393
Бикарбонат натрияSigma-AldrichS5761
ХлоридкалияSigma-AldrichP5405
ДекстрозаSigma-AldrichD9434
Гидроксид натрияSigma-AldrichS8045
ПробенецидSigma-AldrichP8761
2,3-бутандион моноксимSigma-AldrichB0753
25% Глутаральдегид EM Grade (флакон 500 мл)Merck354400-500ML
ПараформальдегидSigma-AldrichP6148
Дубильная кислотаSigma-Aldrich403040-500G100г
Какодилат натрияSigma-AldrichC0250
Фосфатно-солевой буфер (PBS)Sigma-AldrichP4593
Тетраоксид осмияSigma-Aldrich75632-10ML4% в воде, бутылка 5 мл (или бутылка 10 мл также доступно)
Uranyl AcetateEM Sciences2240025 г флакон
Ферроцианид калияMerck Millipore104973
толуоловый синийSigma-AldrichT3260
БураSigma-AldrichS9640также называемый боратом натрия
ЭтанолSigma-Aldrich792780Разбавленный в разное процентное соотношение. чистая вода
АцетонEM SciencesRT10017
Набор смолEM Sciences14040ACM Durcupan хорошо работает
Соляная кислотаSigma-AldrichH98921Нормальный раствор
Equipment
UltramicrotomeLeicaEM UC7
Transmission electron микроскопThermoFisher ScientificTecnai F30http://www.leica-microsystems.com/
Ретортная стойкаProscitechT752
ТрубкиBioStrategy75831-346для перфузионного аппарата Лангендорфа, диаметр 3 мм рекомендуется, но не является обязательным
Запорные краныSDRQP13813для трубок Лангендорфа; продукт является только примером, пользователь может выбрать любой
зажимы для реторт-стендовProscitechT715
Пластиковые шприцыSDRQPC1108для растворов на аппарате Лангендорф
Канюляция шелковый шов, 7-0TeleFlex15B051000для завязывания сердца на лангедорфском аппарате
КанюляИзготовлена из 3 мм наружного диаметра стальной иглы
Резиновый коврик для чашки ПетриProscitechH068для использования в качестве разделочной доски при рассечении неподвижного сердца
Бритвенные лезвияProscitechL056для разрезания неподвижного сердца на мелкие блоки для обработки
ЭМ Стеклянные бутылкиBioStrategy89000-236для хранения растворов при фиксации и обработке тканей для ЭМ
СтаканыBioStrategy213-0477для временного хранения растворов и во время перфузии
Сцинтилляционные флаконыBioStrategy548-2170для образцов тканей при обработке ЭМ
Набор для препарированияProscitechT161для вскрытия животных
Шприцевые фильтрыProscitechWS3-02225Sдля очистки уранила ацетата
Алюминиевая/серебряная фольга ФормыИз любого магазина хлебобулочных изделий
Dupont Diamond knifeBioStrategy102680-780версия с углом 35 градусов дает лучшие срезы.
Коллоидное золотоBBI SolutionsEM. GC1515 нм коллоидное золото
EM сеткиProscitechGCU150различные размеры могут быть протестированы: GCU150h, GCU200h например
Пластиковые пипеты для утилизацииProscitechLCH20лучше всего использовать пластиковые одноразовые материалы, особенно при работе со смолой
Программное обеспечение
SerialEMУниверситет Боулдерадля сбора томографии
MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/matlab.html
IMODUniversity of Boulderalignation and segmentation
iso2meshдоступно на http://iso2mesh.sourceforge.net
Fiji или аналогичное программное обеспечение для обработки изображенийImageJFiji is Just Image J доступнона https://fiji.sc для обработки двоичных изображений стеки
RyR-Simulator коды/данныеCellSMB группадоступна по адресу https://github.com/CellSMB/RyR-simulator
CardiacCellMeshGeneratorCellSMB группапоставляется с RyR-Simulator в папке "gui-version"
R-statistics softwareR-projectСкачать из https://www.r-project.org
spatstatR-projectinstall через программу R
rglR-projectinstall через программу
R doparallelR-projectinstall через программу R
foreachR-projectinstall через программу
R doSNOWR-projectinstall через
итераторыпрограммы Rinstall через программу R
Sodium Chloride Sigma-Aldrich 746398 класса EM для выпечки image project

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Noble, D., Rudy, Y. Models of cardiac ventricular action potentials: iterative interaction between experiment and simulation. Phil. Trans. R. Soc. A: Math., Phys. and Eng. Sci. 359 (1783), 1127-1142 (2001).
  2. Williams, G. S. B., Smith, G. D., Sobie, E. A., Jafri, M. S. Models of cardiac excitation-contraction coupling in ventricular myocytes. Math. Biosci. 226 (1), 1-15 (2010).
  3. Beard, D. A., Vendelin, M. Systems biology of the mitochondrion. Am. J. Phys. - Cell Phys. 291 (6), C1101-C1103 (2006).
  4. Crampin, E. J., Smith, N. P. A Dynamic Model of Excitation-Contraction Coupling during Acidosis in Cardiac Ventricular Myocytes. Biophys. J. 90 (9), 3074-3090 (2006).
  5. Li, L., Louch, W. E., et al. Calcium Dynamics in the Ventricular Myocytes of SERCA2 Knockout Mice: A Modeling Study. Biophys. J. 100 (2), 322-331 (2011).
  6. Shimizu, I., Minamino, T. Physiological and pathological cardiac hypertrophy. J. Mol. Cell. Cardiol. 97, 245-262 (2016).
  7. Wei, S., Guo, A., et al. T-tubule remodeling during transition from hypertrophy to heart failure. Circ. Res. 107 (4), 520-531 (2010).
  8. Jarosz, J., Ghosh, S., et al. Changes in mitochondrial morphology and organization can enhance energy supply from mitochondrial oxidative phosphorylation in diabetic cardiomyopathy. Am. J. Phys. - Cell Phys. 312 (2), C190-C197 (2017).
  9. González, A., Ravassa, S., Beaumont, J., López, B., Díez, J. New Targets to Treat the Structural Remodeling of the Myocardium. J. Am. Coll. Cardiol. 58 (18), 1833-1843 (2011).
  10. Hayashi, T., Martone, M. E., Yu, Z., Thor, A., Doi, M. Three-dimensional electron microscopy reveals new details of membrane systems for Ca2+ signaling in the heart. J. Cell Sci. , (2009).
  11. Soeller, C., Crossman, D., Gilbert, R., Cannell, M. B. Analysis of ryanodine receptor clusters in rat and human cardiac myocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (38), 14958-14963 (2007).
  12. Soeller, C., Baddeley, D. Super-resolution imaging of EC coupling protein distribution in the heart. J. Mol. Cell. Cardiol. 58 (1), 32-40 (2013).
  13. Yu, Z., Holst, M. J., et al. Three-dimensional geometric modeling of membrane-bound organelles in ventricular myocytes: bridging the gap between microscopic imaging and mathematical simulation. J. Struct. Biol. 164 (3), 304-313 (2008).
  14. Hake, J., Edwards, A. G., et al. Modelling cardiac calcium sparks in a three-dimensional reconstruction of a calcium release unit. J. Physiol. 590 (18), 4403-4422 (2012).
  15. Soeller, C., Jayasinghe, I. D., Li, P., Holden, A. V., Cannell, M. B. Three-dimensional high-resolution imaging of cardiac proteins to construct models of intracellular Ca2+ signalling in rat ventricular myocytes. Exp. Physiol. 94 (5), 496-508 (2009).
  16. Kekenes-Huskey, P. M., Cheng, Y., Hake, J. E. Modeling effects of L-type Ca2+ current and Na+-Ca2+ exchanger on Ca2+ trigger flux in rabbit myocytes with realistic t-tubule geometries. Front. in Physiol. 3, 1-14 (2012).
  17. Zienkiewicz, O. C., Taylor, R. L. The finite element method. 1, Butterworth-Heinemann. (2000).
  18. Rajagopal, V., Bass, G., et al. Examination of the effects of heterogeneous organization of RyR clusters, myofibrils and mitochondria on Ca2+ release patterns in cardiomyocytes. PLoS Comp. Biol. 11 (9), e1004417(2015).
  19. Illian, J., Penttinen, A., Stoyan, H., Stoyan, D. Statistical Analysis and Modelling of Spatial Point Patterns. Statistical Analysis and Modelling of Spatial Point Patterns. , John Wiley & Sons. Chichester, UK. 1-534 (2008).
  20. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer Visualization of Three-Dimensional Image Data Using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
  21. Fang, Q., Boas, D. A. Tetrahedral mesh generation from volumetric binary and grayscale images. Proc. ISBI. , 1142-1145 (2009).
  22. Aune, D. J., Herr, S. E., Menick, D. R. Induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in langendorff perfused rat hearts. J. Vis. Exp. (101), e52908(2015).
  23. Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (114), (2016).
  24. Hagler, H. K. Ultramicrotomy for biological electron microscopy. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 369 (Chapter 5), 67-96 (2007).
  25. He, W., He, Y. Electron tomography for organelles, cells, and tissues. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 1117 (20), 445-483 (2014).
  26. Diggle, P., Marron, J. S. Equivalence of smoothing parameter selectors in density and intensity estimation. J. Am. Stat. Assoc. 83 (403), 793-800 (1988).
  27. Ghosh, S., Crampin, E. J., Hanssen, E., Rajagopal, V. A computational study of the role of mitochondrial organization on cardiac bioenergetics. Proc. EMBC. , 2696-2699 (2017).
  28. Pinali, C., Kitmitto, A. Serial block face scanning electron microscopy for the study of cardiac muscle ultrastructure at nanoscale resolutions. J. Mol. Cell. Cardiol. 76, 1-11 (2014).
  29. Hussain, A., Hanssen, E., Rajagopal, V. A Semi-Automated Workflow for Segmenting Contents of Single Cardiac Cells from Serial-Block-Face Scanning Electron Microscopy Data. Microsc Microanal. 23 (S1), 240-241 (2017).
  30. Pinali, C., Bennett, H., Davenport, J. B., Trafford, A. W., Kitmitto, A. Three-dimensional reconstruction of cardiac sarcoplasmic reticulum reveals a continuous network linking transverse-tubules: this organization is perturbed in heart failure. Circ. Res. 113 (11), 1219-1230 (2013).
  31. LeGrice, I. J., Hunter, P. J., Smaill, B. H. Laminar structure of the heart: a mathematical model. Am. J. Physiol. 272 (5 Pt 2), H2466-H2476 (1997).
  32. Jayasinghe, I. D., Cannell, M. B., Soeller, C. Organization of ryanodine receptors, transverse tubules, and sodium-calcium exchanger in rat myocytes. Biophys. J. 97 (10), 2664-2673 (2009).
  33. Jayasinghe, I. D., Crossman, D. J., Soeller, C., Cannell, M. B. Comparison of the organization of t-tubules, sarcoplasmic reticulum and ryanodine receptors in rat and human ventricular myocardium. Clinic. Exp. Pharmacol. P. 39 (5), 469-476 (2012).
  34. Bradley, C., Bowery, A., et al. OpenCMISS: a multi-physics & multi-scale computational infrastructure for the VPH/Physiome project. Prog. Biophys. Mol. Bio. 107 (1), 32-47 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Finite Element ModelCardiomyocyte ArchitectureElectron TomographyConfocal MicroscopyCellular ArchitectureCalcium SignalingMitochondrial BioenergeticsRyR Cluster SimulationImage SegmentationMesh Generation

Related Articles