Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Фермент инженерии Сплит TET2 для химико индуцибельной ДНК Hydroxymethylation и эпигеномные Ремоделирование

6.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56858

⸱

18 декабря 2017 г.

 ,  , 
1Centre for Epigenetics and Disease Prevention, Department of Molecular and Cellular Medicine, Institute of Biosciences and Technology, College of Medicine, Texas A&M University, 2Centre for Translational Cancer Research, Department of Medical Physiology, Institute of Biosciences and Technology, College of Medicine, Texas A&M University

В этой статье

Краткое содержание

Представлены подробные протоколы для внедрения инженерных Сплит TET2 фермента (сидр) в клетки млекопитающих для химических hydroxymethylation индуцибильный ДНК и эпигеномные ремоделирования.

Аннотация

Метилирование ДНК является стабильной и наследственные эпигеномные изменения в геноме млекопитающих и участвует в регуляции экспрессии генов для контроля клеточных функций. Реверсирование метилирование ДНК, или ДНК деметилирования, при посредничестве десять-одиннадцать транслокация (тет) белка семьи dioxygenases. Хотя широко сообщалось, что аномальные метилирование ДНК и деметилирования, связанные с пороки развития и рак, как эти эпигеномные изменения непосредственно вносить последующие изменения в ген выражение или болезнь прогрессии остается неясным, в основном из-за отсутствия надежных инструментов для точного добавления или удаления ДНК изменения в геноме определенным временным и пространственным разрешением. Чтобы преодолеть это препятствие, мы разработали Сплит TET2 фермента для включения временного контроля 5-метилцитозин (5мс) окисления и последующей реконструкции эпигеномные государств в mammalian клетках простым добавлением химических веществ. Здесь мы описываем методы для введения химико индуцибельной epigenome ремоделирования инструмент (сидр), основанный на инженерных Сплит TET2 фермента, в клетках млекопитающих и количественного химического индуцибельной производство 5-Гидроксиметилцитозин (5hmC) с иммуноокрашивания, проточной цитометрии или пробирного дот блот. Этот химико индуцибельной epigenome ремоделирования инструмент найдет широкое применение в допросе сотовых систем без изменения генетического кода, а также зондирующего epigenotype−phenotype отношений в различных биологических систем.

Введение

Метилирование ДНК, главным образом относится к добавлением метильной группы углерода 5 позицию цитозина сформировать 5-метилцитозин (5мс), катализируемые ДНК метил трансферазы (DNMTs). 5мс выступает в качестве основных эпигеномные Марк в геноме млекопитающих, который часто сигнализирует транскрипционный анализ репрессий, инактивации х и глушителей1transposon. Реверсирование метилирование ДНК при посредничестве десять Эльфийская транслокация (тет) белка семьи. ТЕТ ферментов принадлежат железа (II) и 2-oxoglutarate зависит от dioxygenases, которые катализируют последовательных окисления 5мс 5-Гидроксиметилцитозин (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) и 5-carboxycytosine (5caC). ТЕТ опосредованной 5мс окисления накладывает дополнительный слой эпигеномные контроля над геном млекопитающих. Открытие тет вызвал повышенный интерес в области эпигеномные раскрыть биологические функции тет белков и их основных продуктов каталитического 5hmC. 5hmC является не только промежуточным во время тет опосредованной ДНК деметилирования active2,3,4, но также действует как эпигеномные стабильной Марк5,6,7,8 . Хотя ДНК hydroxymethylation отличается высокой корреляцией с экспрессии генов и аномальные изменения в ДНК hydroxymethylation связаны с некоторыми человека расстройств9,10,11, причинно-следственных отношений эпигеномные изменения на ДНК и фенотипы часто остаются сложной должен быть создан, который частично может объясняться отсутствием надежного инструмента точно добавить или удалить модификации ДНК генома на определенных временных и пространственных резолюции.

Здесь мы приводим использование химико индуцибельной epigenome Ремоделирование инструмент (сидр) для преодоления препятствий, стоящих перед исследования причинно-следственных связей между hydroxymethylation и Джин транскрипция ДНК. Дизайн основан на предположении что каталитического домен TET2 (TET2CD) может быть разделен на две неактивные фрагментов при выраженных в mammalian клетках и ферментативные функции может быть восстановлена на основе химически индуцибельной димеризации подхода ( Рисунок 1A). Создать систему Сплит TET2CD, мы выбрали шесть мест в TET2CD, состоящий из региона богатые Cys и складку двунитевая β-спираль (DSBH), на основе сообщенных Кристаллическая структура комплекса TET2-ДНК, что не хватает низкой сложности региона12. Синтетический ген кодирования rapamycin индуцибельной димеризации модуль FK506 связывания белка 12 (FKBP12) и FKBP rapamycin связывающий домен (FRB) млекопитающих цель rapamycin14,15, наряду с самостоятельной расщепления пептидов T2A Полипептид последовательности16,17, индивидуально был вставлен в выбранной Сплит сайтов в TET2CD. Выбор TET2 в качестве нашей инженерной целевой основывается на следующих соображениях. Во-первых, соматические мутации в TET2 с сопутствующей снижением ДНК hydroxymethylation часто наблюдаются в человека расстройств, включая миелоидного расстройств и рака10, который обеспечивает полезную информацию на чувствительных участках следует избегать для вставки. Во-вторых большая часть TET2 катализатора домена, особенно низкой сложности региона, является необязательным для ферментативные функции12, что позволило нам выработать свернутого Сплит TET2 индуцибильный эпигеномные изменения. После проверки более 15 конструкций, конструкции, которые выставлены высоким rapamycin индуцибельной восстановление ферментативной активности в системе млекопитающих был выбран и назначил сидр18. Мы здесь описывают использование mCherry тегами сидр достичь индуцибельной ДНК hydroxymethylation и эпигенетические ремоделирования с rapamycin и представить три метода для проверки сидр опосредованной 5hmC производства в системе сотовой модели HEK293T.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. клетки культуры, плазмида Transfection и химической индукции

  1. Культура на линию (например, человеческих эмбриональных почки HEK293T клеток) адэрентных клеток в среде Дульбекко изменение орла (DMEM), дополнены 10% тепло инактивированная плода бычьим сывороточным, 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина при 37 ° C с 5% CO2.
  2. Transfect клетки с Сидр плазмиды.
    1. По крайней мере в 18 h перед трансфекции, семян 0,3 x 106 клеток в 2,5 мл соответствующих DMEM за хорошо в пластине 6-Ну и инкубации клеток при 37 ° C ночь до 60-80% confluency.
    2. Предварительно теплой трансфекции реагента к комнатной температуре перед использованием.
    3. Место 250 мкл концентрированного препарата сыворотки свободной среды в стерильную пробирку.
      Примечание: Эта сумма рассчитана на 6-ну тарелку с 80% confluency. При необходимости, пропорционально регулировать средних сумм в соответствии с размерами плит или числа клеток.
    4. Добавить 2,5 мкг плазмида кодирования сидр18 или каталитического домен TET2 (TET2CD как положительный контроль)12,13 в сыворотке бесплатно средство и осторожно перемешать, закупорить.
    5. 7.5 мкл Реагента трансфекции разбавленные смеси ДНК и осторожно перемешать, закупорить.
    6. Инкубируйте смесь при комнатной температуре для 20-30 мин.
    7. Изменить подогретым СМИ и добавить смесь каплям скважин и осторожно встряхивайте пластину культуры клеток равномерно распределить трансфекции реагента и ДНК смесь.
    8. Инкубировать клетки и смесь, на ночь, а затем заменить трансфекции реагента, содержащие СМИ с 2 мл свежего полный DMEM.
  3. Химической индукции
    1. Разбавить 2 мм запаса rapamycin (растворяют в ДМСО) к концентрации 20 мкм в необходимости полного среднего.
    2. 20 мкл разбавленного rapamycin transfected клеток в 2 мл среднего до конечной концентрации 200 Нм.
      Примечание: После инкубации в течение 48 часов, клетки готовы для количественной оценки 5hmC поколения или любые другие нисходящие приложения. При необходимости, эффективности индукции может контролироваться путем принимать вне клетки каждые 3 ч для дальнейшего 5hmC количественную оценку как описано ниже и показано на рисунке 1.
    3. Для улучшения количественной оценки эффективности индукции 5hmC семя отдельных скважин для мониторинга клетки каждые 3 часа.

2. Количественная оценка Rapamycin индуцированной 5hmC производства иммуноокрашивания

  1. 5hmC иммунофлюоресценции пятнать
    Примечание: Добавьте достаточное количество фиксации раствор, состоящий из параформальдегида 4%, 0,2% поверхностно-активных веществ (таких как Тритон X-100) в PBS с 3 N HCl, чтобы охватить все клетки в пластине. Например 500 мкл раствора будет достаточно хорошо в пластине 6-хорошо. Выполните все шаги при комнатной температуре.
    1. Чтобы исправить клетки, добавьте параформальдегида 4% в PBS rapamycin лечение клетки 15 мин при температуре. Для контрольной группы используйте клетки, выражая mCherry сидр без rapamycin лечения. Не агитировать.
      Предупреждение: Параформальдегида является токсичным. Надевайте соответствующую защиту.
    2. Выбросите фиксирующие решения. Инкубируйте фиксированные ячейки с 0,2% ПАВ в PBS для 30 мин для разрушения клеточной мембраны.
    3. Отменить решение permeabilization. Добавить 3 N HCl permeabilized клеток и инкубировать на 15 минут, чтобы денатурировать ДНК.
    4. Выбросите HCl. Добавить 100 мм трис-HCl буфера (рН 8.0) в клетки для 10 мин для нейтрализации рН.
    5. Отменить все решение. Вымыть клетки тщательно с PBS для 3 - 5 раз. Тщательно удалите PBS.
      Примечание: Добавьте достаточное количество PBS для каждого шага мыть. Например 1 мл PBS является достаточно для 6-ну пластины.
    6. Заблокировать ячейки, добавив блокирующем буфере, состоящий из 1% BSA и 0,05% ПАВ (например Tween-20) в PBS для 1 h с нежным встряхивания.
    7. Отмена блокировки решение. Добавьте разбавленные 5hmC антитела (1: 200) в клетки и проинкубируйте 2 ч при комнатной температуре или на ночь при 4 ° C.
    8. Вымойте клетки с PBS три раза за 15 мин.
    9. Добавьте разбавленные Флюорофор (FITC)-конъюгированных вторичное антитело (1: 200) в клетки и инкубировать в течение 1 ч.
    10. Вымойте клетки с PBS три раза широко для удаления остаточного антител.
    11. Добавьте 250 нг/мл 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) пятно ядро для 5 минут удалить окрашивание раствора.
    12. Смонтируйте слайд или стекло дно культуры блюдо с immunostained ячейками для конфокальная томография. Представитель результат был показан на рисунке 1B.
  2. Проточная цитометрия
    Примечание: Используйте круглые 96-луночных днище для выполнения следующей процедуры окрашивания. Как правило 150 мкл реагентов является достаточным для каждой скважины.
    1. Ресуспензируйте transfected и rapamycin индуцированной клетки в буфере СУИМ (PBS с 1% BSA, 2 мм ЭДТА). Для контрольной группы используйте сидр выражая клетки без rapamycin лечения.
    2. Исправить и разрушения клеток, как описано в шаге 2.1.
    3. Добавьте 2 N HCl в клетки, чтобы денатурировать ДНК для 10 мин.
    4. Отменить HCl. нейтрализовать и блок ячеек, как описано в шаге 2.1.
    5. Добавьте разбавленные анти 5hmC антитела (1: 200) в клетки и инкубировать 1 час при комнатной температуре или на ночь при 4 ° C.
    6. Вымойте клетки с СУИМ буфера три раза. Тщательно удалите буфер СУИМ.
    7. Добавьте разбавленные Флюорофор (FITC)-конъюгированных вторичное антитело (1: 400) для активации флуоресценции клеток, сортировка (FACS) анализ и инкубировать 1 час при комнатной температуре.
    8. Вымойте клетки с СУИМ буфера три раза.
    9. Образцы готовы для анализа СУИМ. Представитель результат был показан на рисунке 1 c-D.

3. дот блот Assay для количественной оценки 5hmC и 5-метилцитозин (5мс) составляет

  1. Изолируйте геномной ДНК из transfected и rapamycin индуцированной клеток с использованием коммерческих комплект экстракции ДНК. Для контрольной группы используйте сидр transfected клеток без rapamycin лечения.
  2. Тепло вакуумной печи до 80 ° C и предварительно вымочить нитроцеллюлозную мембрану в дистиллированной двойной H2O, а затем в 6 x буфер солевой раствор натрия цитрата (SSC) за 10 мин.
  3. Загрузите 60 мкл равных сумм к пластине 96-луночных ПЦР ДНК (всего 2 мкг в буфере TE). 30 мкл буфера TE (10 мм трис-HCl, 1 мм ЭДТА, pH 8.0), остальные скважины.
  4. Сделайте два раза серийных разведений вертикально на пластину 96-луночных путем передачи 30 мкл раствора на строку 1 на ту же позицию столбца в строке 2. Снова перемешать и передачи 30 мкл раствора скважин в последующей строке до достижения границы.
Удалите последние 30 мкл.
  • 20 мкл 1 M NaOH и 10 мм ЭДТА в каждой скважине, печать пластину и нагревать смесь для 10 мин при 95 ° C до полностью денатурировать дуплекс ДНК.
  • Сразу же охладить вниз образцы на льду и добавьте 50 мкл ледяной ацетата аммония 2 М (рН 7,0) и инкубировать на льду за 10 мин.
    Примечание: Шаги 3,7-3.10 предполагает использование вакуума.
  • Соберите точка блот аппарат с предварительно замоченные мембраны и удалить остаточные буфера, используя полный вакуум.
  • Вымойте мембраны, добавив 200 мкл буфера TE для каждой скважины точка блот аппарата. Включите пылесос для удаления TE буфера.
  • Загрузите денатурированной ДНК (подготовлен в предыдущих шагах 3.1-3.6) для каждой скважины точка блот аппарата. Включите пылесос для удаления решения.
  • Вымойте мембраны, добавив 200 мкл 2 x SSC и удаление остаточного решения, полностью с помощью вакуума.
  • Разберите аппарат блот точка, вывезти мембраны и промойте весь мембраны с 20 мл 2 x SSC.
  • Просушите мембрана для 20 мин.
  • Выпекать мембраны при 80 ° C в вакууме за 2 ч.
  • Добавьте решение блокировки (5% обезжиренное молоко в TBST) мембраны и инкубировать 1 час при комнатной температуре.
  • Отмена блокировки решение. Добавьте разбавленные 5hmC (1:5, 000) или 5мс (1:1, 000) антител к мембране и инкубировать на ночь при 4 ° C.
  • Промойте мембрану с TBST три раза за 10 мин для удаления остаточного антител. Тщательно удалите TBST.
  • Добавить HRP-конъюгированных вторичные антитела (1:10, 000 для анти кролик HRP(5hmC) или 1:3,000 для борьбы с мыши HRP(5mC)) мембраны и инкубировать 1 час при комнатной температуре.
  • Промойте мембрану с TBST три раза за 10 мин.
  • Добавьте ECL Западной промокательной субстрата мембраны для визуализации 5hmC сигналов с помощью детектора хемилюминесценции. Представитель результат был показан на рисунке 1E.

    • Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Результаты

    Конверсионные индуцибельной 5мс 5hmC можно проверить с помощью иммуноокрашивания на уровне одной ячейки, cytometry анализ потока на популяции transfected клеток (mCherry положительных) или более количественный пробирного дот блот, как показано на рисунке 1. Каталитического домен TET2 или TET2CD, были использованы на протяжении всего исследования как позитивный элемент управления. Раздел ссылок 18-20 для более подробной информации относительно картирования ген...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Обсуждение

    Здесь мы продемонстрировали использование инженерных Сплит TET2 фермента для достижения временной контроль над hydroxymethylation ДНК. После открытия тет семьи 5-methycytosine dioxygenase многие исследования были проведены расшифровать биологические функции тет белков и их основных продуктов каталитического 5hmC1,2,3, 4,5,6<...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Раскрытие информации

    Авторы заявляют не конкурирующих финансовых интересов.

    Благодарности

    Мы благодарим финансовой поддержки от национальных институтов здравоохранения Грант (R01GM112003 YZ), Фондом Уэлч (BE-1913 до YZ), американского общества рака (RSG-16-215-01 КЭ в YZ), профилактики рака и исследовательский институт штата Техас (RR140053 для YH, RP170660 для YZ), Американская ассоциация сердца (16IRG27250155 для YH) и Джон S. Dunn фонд программы совместных исследований премии.

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Материалы

    Список материалов, использованных в этой статье
    ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
    Липофектамин 2000 Реагент для трансфекцииThermo Fisher Scientific11668027
    рапамицинSigma-Aldrich37094
    Параформальдегид, 16% растворVWR100503-916
    Triton X-100Amresco0694-1L
    Соляная кислотаAmresco0369-500ML
    Альбумин, BovineAmresco0332-100G
    Tween 20Amresco0777-1L
    5-гидроксиметилцитозин (5-hmC) антитело (pAb)Active Motif39769
    козий анти-кролик IgG (H+L) Перекрестно-адсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11008
    4,6-диамидино-2-фенилиндолд (DAPI)Biotium40043
    SVAC1E SHEL LAB Экономичная вакуумная печь, 0,6 куб. фута (17 л)SHEL LABSVAC1E
    UltraPure SSC, 20XThermo Fisher Scientific15557036
    Bio-Dot аппаратBIO-RAD1706545
    антитело против 5-5-метилцитозина (5mC), клон 33D3MilliporeMABE146
    Anti-mouse IgG, HRP-связанное антителоCell Signaling Technology7076S
    Anti-rabbit IgG, HRP-связаннаяпередачи сигналов7074S
    West-Q Pico Dura ECL SolutionGendepotW3653-100
    технология антител

    Ссылки

    1. Li, E., Zhang, Y. DNA methylation in mammals. Cold Spring Harbor Perspectv Biol. 6 (5), a019133(2014).
    2. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
    3. He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).
    4. Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).
    5. Spruijt, C. G., et al. Dynamic readers for 5-(hydroxy)methylcytosine and its oxidized derivatives. Cell. 152 (5), 1146-1159 (2013).
    6. Lio, C. W., et al. Tet2 and Tet3 cooperate with B-lineage transcription factors to regulate DNA modification and chromatin accessibility. eLife. 5, e18290(2016).
    7. Kellinger, M. W., et al. 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription. Nat Struct Mol Biol. 19 (8), 831-833 (2012).
    8. Su, M., et al. 5-Formylcytosine Could Be a Semipermanent Base in Specific Genome Sites. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (39), 11797-11800 (2016).
    9. Ko, M., et al. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468 (7325), 839-843 (2010).
    10. Huang, Y., Rao, A. Connections between TET proteins and aberrant DNA modification in cancer. Trends Genet. 30 (10), 464-474 (2014).
    11. Lu, X., Zhao, B. S., He, C. TET family proteins: oxidation activity, interacting molecules, and functions in diseases. Chem Rev. 115 (6), 2225-2239 (2015).
    12. Hu, L., et al. Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation. Cell. 155 (7), 1545-1555 (2013).
    13. Hashimoto, H., et al. Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA. Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).
    14. Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. J. Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex. J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).
    15. Clackson, T., et al. Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10437-10442 (1998).
    16. Ibrahimi, A., et al. Highly efficient multicistronic lentiviral vectors with peptide 2A sequences. Hum Gene Ther. 20 (8), 845-860 (2009).
    17. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLoS One. 6 (4), e18556(2011).
    18. Lee, M., et al. Engineered Split-TET2 Enzyme for Inducible Epigenetic Remodeling. J Am Chem Soc. 139 (13), 4659-4662 (2017).
    19. Huang, Y., Pastor, W. A., Zepeda-Martínez, J. A., Rao, A. The anti-CMS technique for genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine. Nat Protoc. 7 (10), 1897-1908 (2012).
    20. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide. Curr Protoc Mol Biol. 109 (21.29), 1-9 (2015).

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Перепечатки и разрешения

    Теги

    5CiDER
    Фермент инженерии Сплит TET2 для химико индуцибельной ДНК Hydroxymethylation и эпигеномные Ремоделирование
    Свяжитесь с нами
    Рекомендовать библиотеке

    Конфиденциальность

    Условия эксплуатации

    Политика

    Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.