Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Поколение и культивирование первичных человеческие кератиноциты от взрослых кожи

17K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56863

⸱

22 декабря 2017 г.

1Department of Dermatology, Aarhus University Hospital

В этой статье

Краткое содержание

Человеческая кожа выступает в качестве первой линии обороны против внешней среды. Мы представляем метод для изоляции первичных человеческие кератиноциты от взрослых кожи. Эти изолированные кератиноцитов полезны в многочисленных экспериментальных установок и являются весьма подходящую модель для изучения молекулярных механизмов в биологии кожного в витро.

Аннотация

Основная функция кератиноцитов является предоставить структурной целостности эпидермиса, тем самым сохраняя механический барьер с внешним миром. Кроме того кератиноциты играют важную роль в инициации, техническое обслуживание и регулирование эпидермальный иммунных реакций, будучи частью иммунной системы реагировать антигенной стимулы быстрый, неспецифические способом. Здесь мы описываем протокол для изоляции первичных человеческие кератиноциты от взрослых кожи и продемонстрировать, что эти клетки реагируют на кальций индуцированной терминала дифференциации, определяемой выражением рост дифференциации маркер involucrin. Кроме того мы показываем, что изолированные кератиноцитов реагировать ИЛ 1β-индуцированной активации внутриклеточных сигнальных путей, как измеряется активации p38 MAPK путь. Взятые вместе, мы описываем метод для изоляции и культивирование первичных человеческие кератиноциты от взрослых кожи. Потому что кератиноцитов тип преобладает ячейки в эпидермисе, этот метод является полезным для изучения молекулярных механизмов в биологии кожного в витро.

Введение

Кожа является большой орган человеческого тела и служит защитным барьером против внешней среды. Кожа состоит из двух основных слоев: дермы и эпидермиса, где эпидермис представляет внешний слой кожи. Наиболее распространённый тип ячейки в эпидермис является кератиноцитов, состоящий из более чем 95% массы1,клетки2. Кератиноциты ведутся на различных стадиях дифференцировки в эпидермисе и организованы в базальной, остистых, гранулированных и ороговевшем слои, которые соответствуют конкретные этапы дифференцировки3. Основная функция кератиноцитов является предоставить структурной целостности эпидермиса, тем самым производить нетронутыми барьер с внешним миром.

Кератиноциты, также представляют собой первую линию обороны против патогенов в коже и поэтому играют важную роль в врожденный иммунный ответ4,5. Воздействие кератиноцитов на внешние раздражители приводит к активации внутриклеточных сигнальных путей и впоследствии, производство целого ряда различных воспалительных медиаторов, включая цитокины, chemokines и противомикробные пептиды. Эти белки кератиноцитов производные участвуют в воспалительной реакции путем набора и активация иммунных клеток, таких как дендритные клетки, нейтрофилов и конкретных T клетки6,7. Таким образом потому что кератиноцитов играют решающую роль в многочисленных биологических процессах, обоснование техника, представленная здесь заключается в том, сформировать в vitro модель для изучения биологии кожи. Первичный кератиноцитов культур, полученных от крайней плоти новорожденных часто используются для изучения кожи биологии8,9. Однако с техникой, описанных здесь, кератиноциты от обоих полов получаются, что приводит к более высокой биологического разнообразия клеток.

Здесь мы представляем подробный протокол для изоляции и генерация первичных человеческие кератиноциты от взрослых кожи, включая техническое обслуживание и замораживания кератиноцитов. Общая цель этого метода заключается в генерации первичных человеческие кератиноциты, который может использоваться в качестве модели для изучения кожный биологии в пробирке.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Коллекция образцов кожи от здоровых взрослых добровольцев, переживает пластической хирургии требует одобрения от этического Комитета в принимающих учреждениях. Этот протокол был одобрен региональной этического Комитета региона Midtjylland, Дания (M-20110027). Метод, описанный здесь является производным от аналогичных исследований, Maciaq и др. 10 и11Лю и Карасака.

1. изоляция кератиноцитов из человеческой кожи

  1. Начните путем делать следующие решения: 50 мл раствора 0,25% трипсина и 0,1% глюкозы в DPBS. Mix и фильтрации стерилизации (0,2 мкм) решение. Подготовка 10 мл RPMI 1640 + 2% раствор FBS, 50 мл DPBS и кератиноцитов сыворотки свободной среды (KSFM). Добавьте KSFM добавки и 250 мкл гентамицина в 500 мл KSFM. Предварительно теплой решения до 37 ° C перед использованием.
  2. Соберите кожи от здоровых взрослых добровольцев, переживает пластической хирургии. Кожных проб используется приблизительно 10 см x 15 см, но может изменяться в размерах. Охлаждения кожи под перевозки путем транспортировки образцов кожи в коробке из пенопласта, содержащего элемент охлаждения. При необходимости, образец кожи может храниться при температуре 4 ° C на ночь.
  3. Удалите жир из под кожи разделе Использование стерилизованные ножницы, скальпели и пинцет.
  4. Пряжка из секции кожи (приблизительно 10 см x 15 см) на стерильные Обложка верхней пластины с помощью иглы. Во-первых Очистите кожу сухой стерильный марлевый тампон. Затем очистите кожу с помощью стерильный марлевый тампон с 70% этиловом спирте.
  5. С помощью ног рубанок, вырезать из верхнего слоя секции кожи (эпидермис) и положил его в 9 см Петри. Затем сразу же добавьте 25 мл раствора DPBS/трипсина/глюкозы (подготовленный на этапе 1.1) Петри. Инкубируйте 30 мин при температуре 37 ° C.
  6. С помощью пипетки удалить решение DPBS/трипсина/глюкозы из Петри и добавляют 10 мл RPMI 1640 + 2% FBS для инактивации трипсина.
  7. Теперь с помощью двух щипцы, выпуск эпидермальных клеток в среду, мягко очищая и агитировать эпидермиса и дермы отсек участков кожи.
  8. Фильтр суспензию эпидермальных клеток через металлический фильтр (размер отверстия 1 мм) и собирать в 50 мл трубки. Добавьте остальные разделы кожи Тюбик 50 мл, содержащие 10 мл RPMI 1640 без FBS и вихревые для 10 s. фильтра, подвеска через металл фильтр в Тюбик 50 мл, содержащего суспензию клеток эпидермиса. Добавьте DPBS в суммарный объем 50 мл.
  9. Центрифуга суспензию клеток для 10 мин на 450 x g при комнатной температуре.
  10. Удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле эпидермальных клеток в приблизительно 10 мл 37 ° C KSFM в зависимости от размера ячейки Пелле. Подсчет количества ячеек, используя Трипановый синий окрашивания метода под микроскопом. Количество клеток, полученных из раздела 10 x 15 см кожи — примерно 50-100 х 106 клеток. Каждый настой культуры2 75 см передачи 8 х 106 клеток вместе с 12 мл 37 ° C KSFM. Осторожно встряхните культуры колбы для обеспечения равномерного распределения клеток.
  11. Инкубируйте кератиноцитов в инкубаторе 37 ° C с 100% влажность и 5% CO2. Изменения среды после 2 дней и три раза в неделю. Проход клетки при 70-80% притока, который занимает около 2 недель в зависимости от скорость распространения keratinocytes культуры.

2. пассированый кератиноцитов

  1. Тепла соответствующее количество 0,05% раствор трипсина-ЭДТА до 37 ° C в инкубаторе. Использование 4,5 мл 0,05% раствора трипсина-ЭДТА для колбу культуры2 75 см.
  2. Удаление среднего из клетки и добавить 4,5 мл/75 см2 культуры колбу предварительно разогретую 0,05% раствор трипсина-ЭДТА в клетки. Место культуры колбу в инкубатор (37 ° C) и после примерно 5 минут, проверьте под микроскопом клетки начали рыхление.
  3. Когда примерно 50% клеток ослаблены, мягко ударил культуры колбу против руку, чтобы ослабить оставшиеся ячейки. Затем чтобы инактивировать трипсина, добавить 6 мл RPMI 1640 + 2% FBS (37 ° C) до 75 см2 культуры колбу и передачи суспензии клеток с 50 мл трубки.
  4. Промойте культуры колбы с 3 мл RPMI 1640 + 2% FBS и добавить 50 мл трубки. Центрифуга клетки для 10 мин на 450 x g при комнатной температуре.
    1. Ресуспензируйте гранулированных клетки в 10 мл KSFM (37 ° C). Подсчитать количество ячеек и передачи 3 х 106 клеток колбу культуры2 150 см вместе с 20 мл KSFM (37 ° C). Осторожно встряхните флакон культуры для обеспечения равномерного распределения клеток. Заморозить клетки, когда культура является 80-90% вырожденная, которая занимает около 4-6 дней в зависимости от скорость распространения keratinocytes (см. раздел 3, замораживание протокол ниже). Разверните кератиноцитов сформировать соответствующие замороженные запасы.

3. Замораживание кератиноцитов

  1. Тепла соответствующее количество 0,05% раствор трипсина-ЭДТА до 37 ° C в инкубаторе. Используйте 9 мл 0,05% раствора трипсина-ЭДТА для колбу культуры2 150 см.
  2. Удаление среднего из клетки и добавить 9 мл/150 см2 культуры колбу предварительно разогретую 0,05% раствор трипсина-ЭДТА в клетки. Место культуры колбу в инкубатор (37 ° C) и после примерно 5 минут, проверьте под микроскопом клетки начали рыхление.
  3. Когда примерно 50% клеток ослаблены, мягко ударил культуры колбу против руки для того, чтобы ослабить оставшиеся ячейки. Затем чтобы инактивировать трипсина, добавить 12 мл RPMI 1640 + 2% FBS (37 ° C) до 150 см2 культуры колбу и аспирационная суспензии клеток с 50 мл трубки.
  4. Промойте культуры колбы с 6 мл RPMI 1640 + 2% FBS и добавить 50 мл трубки. Центрифуга для трубы для 10 мин на 450 x g при 4 ° C. Подготовьте ледяной клеток замораживание среднего (KSFM + 10% ДМСО).
  5. Ресуспензируйте Пелле клеток в KSFM + 10% ДМСО, подсчитать количество ячеек и заморозить клетки на плотности 6 х 106 клеток/мл с помощью методов криоконсервирования стандартных медленного замораживания12.
  6. Храните кератиноцитов в жидком азоте (паровой фазы) до готовой к использованию.

4. оттаивания и культивирования замороженных кератиноцитов

  1. Быстро разморозить соответствующие замороженных флаконов в ванну воды 37 ° C. Для очистки наружной cryovial используйте 70% этиловом спирте. Передать соответствующее количество клеток (примерно 15 000 клеток/см2) культуры колбу и сразу же добавить подогретым роста среднего (KSFM) культуры колбу.
    Любой размер колбы культуры могут использоваться в зависимости от настройки эксперимента.
  2. Используйте 5 мл питательной среды для культуры колбу 25 см2 .
Количество клеток добавил, что колбу культуры могут отличаться, потому что рост клеток варьируется от доноров для доноров. Инкубируйте клетки в инкубаторе 37 ° C с 100% влажность и 5% CO2.
  • Изменения среды после 2 дней и три раза каждую неделю с использованием свежих подогретым KSFM.
    Примечание: Наши данные показали, что в среднем 95% клеток, изолированных в протоколе описаны здесь являются позитивными для кератиноцитов маркер cytokeratine-1413.

    • Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Результаты

    Кальций индуцированной терминала дифференциация
    Человеческие кератиноциты проходят терминала дифференциация по обращению с кальция14,,1516. Основная человеческие кератиноциты были изолированы и культивировали как описано в протоколе выше. Когда примерно 50-60% притока, клетки были стимулируется с кальцием (1,2 мм) или автомобиль и фотографии клетки были приняты на день 0, 1 и 2. Рисунок 1...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Обсуждение

    Здесь мы описываем, как легко изолировать первичной человеческие кератиноциты от взрослых кожи и как их культуры в пробирке. Эта модель может иметь широкое применение для исследования биологии эпидермальных клеток и может быть полезным для исследователей, заинтересованных в изучении кожных заболеваний.

    Некоторые из преимуществ протокола, описанные здесь является то, что в отличие от кератиноцитов, изолированных от новорожденных крайней плоти, полученные из претерпевает обрезания у нов...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Раскрытие информации

    . Автор не имеет никакого конфликта интересов.

    Благодарности

    Автор хотела бы поблагодарить за их техническую поддержку Annette Blak Расмуссен и Кристин Мюллер

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Материалы

    Список материалов, использованных в этой статье
    ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
    KSFMThermoFisher Scientific17005-034Среда для культивирования клеток
    KSFM ДобавкиThermoFisher Scientific37000-015Добавки для KSFM
    DPBSThermoFisher Scientific14190-144DPBS без кальция и магния
    DMSOSigma-AldrichD8418Диметилсульфоксид
    ГентамицинThermoFisher Scientific15710-049Добавка к среде для культивирования клеток
    Стерилизационный фильтрSartorius16534Шприцевой фильтр с размером пор 0,2 мкм; m
    ТрипсинSigma-AldrichT7409Используется для трипсинизации клеток
    ГлюкозаSigma-AldrichG7528-RPMI-1640
    ThermoFisher Scientific61870-010-FBS
    ThermoFisher Scientific16000044Используется для инактивации трипсина
    Щипцы-Можно использовать
    Ножницы--Ножницы любой фирмы можно использовать
    СкальпельSwann Morton0501Скальпели любой фирмы можно использовать
    70% этанол--
    Марлевые салфеткиNOBAMED875420Марлевые подушечки любого поставщика можно использовать
    Рубанк для ногCredo Solingen1510Строгальный станок от любого поставщика можно использовать
    ЧашкиПетри TPP93100Чашки Петри от любого поставщика могут быть использованы
    Металлический фильтр---Внутренний диаметр отверстия 1 мм Металлический фильтр
    75 см<суп>2 колбы для культурNUNC156499-150
    см<суп>2 колбы для культурTTP90151-0,05
    % раствор трипсина-ЭДТАThermoFisher Scientific25300-062Используется для трипсинизации клеток при пассировании
    -щипцы любой компании -

    Ссылки

    1. Barker, J. N., Mitra, R. S., Griffiths, C. E., Dixit, V. M., Nickoloff, B. J. Keratinocytes as initiators of inflammation. Lancet. 337 (8735), 211-214 (1991).
    2. Nickoloff, B. J., Turka, L. A. Keratinocytes: key immunocytes of the integument. Am J Pathol. 143 (2), 325-331 (1993).
    3. Fuchs, E., Raghavan, S. Getting under the skin of epidermal morphogenesis. Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).
    4. Bos, J. D., Kapsenberg, M. L. The skin immune system Its cellular constituents and their interactions. Immunol Today. 7 (7-8), 235-240 (1986).
    5. Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nat Rev Immunol. 9 (10), 679-691 (2009).
    6. Albanesi, C., Scarponi, C., Giustizieri, M. L., Girolomoni, G. Keratinocytes in inflammatory skin diseases. Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 4 (3), 329-334 (2005).
    7. Gilliet, M., Lande, R. Antimicrobial peptides and self-DNA in autoimmune skin inflammation. Curr Opin Immunol. 20 (4), 401-407 (2008).
    8. Rohani, M. G., Pilcher, B. K., Chen, P., Parks, W. C. Cdc42 inhibits ERK-mediated collagenase-1 (MMP-1) expression in collagen-activated human keratinocytes. J Invest Dermatol. 134 (5), 1230-1237 (2014).
    9. Meephansan, J., Tsuda, H., Komine, M., Tominaga, S., Ohtsuki, M. Regulation of IL-33 expression by IFN-gamma and tumor necrosis factor-alpha in normal human epidermal keratinocytes. J Invest Dermatol. 132 (11), 2593-2600 (2012).
    10. Maciag, T., Nemore, R. E., Weinstein, R., Gilchrest, B. A. An endocrine approach to the control of epidermal growth: serum-free cultivation of human keratinocytes. Science. 211 (4489), 1452-1454 (1981).
    11. Liu, S. C., Karasek, M. Isolation and growth of adult human epidermal keratinocytes in cell culture. J Invest Dermatol. 71 (2), 157-162 (1978).
    12. Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation. J Tissue Eng Regen Med. 10 (10), E354-E364 (2016).
    13. Otkjaer, K., et al. IL-20 gene expression is induced by IL-1beta through mitogen-activated protein kinase and NF-kappaB-dependent mechanisms. J Invest Dermatol. 127 (6), 1326-1336 (2007).
    14. Watt, F. M. Involucrin and other markers of keratinocyte terminal differentiation. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 100s-103s (1983).
    15. Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 33s-40s (1983).
    16. Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
    17. Carlson, M. W., Alt-Holland, A., Egles, C., Garlick, J. A. Three-dimensional tissue models of normal and diseased skin. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 19 Unit 19.19 (2008).
    18. Kamsteeg, M., et al. Type 2 helper T-cell cytokines induce morphologic and molecular characteristics of atopic dermatitis in human skin equivalent. Am J Pathol. 178 (5), 2091-2099 (2011).
    19. van den Bogaard, E. H., et al. Crosstalk between keratinocytes and T cells in a 3D microenvironment: a model to study inflammatory skin diseases. J Invest Dermatol. 134 (3), 719-727 (2014).
    20. Raaby, L., et al. Langerhans cell markers CD1a and CD207 are the most rapidly responding genes in lesional psoriatic skin following adalimumab treatment. Exp Dermatol. , (2017).

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Перепечатки и разрешения

    Теги

    Выделение кератиноцитовкультура эпидермальных клетоккальций-индуцированная дифференцировкастимуляция IL-1 бетаактивация p38 MAPKтрипсинизациясреда KSFMзаморозка клетокмодель биологии кожи
    Поколение и культивирование первичных человеческие кератиноциты от взрослых кожи
    Связаться с нами
    Порекомендовать библиотеке

    Конфиденциальность

    Условия использования

    Политики

    © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.