Method Article

Перешнуровка частичное желчных протоков в мышь: контролируемые модель локализованных обструктивного холестаза

DOI:

10.3791/56930

⸱

March 28th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Jichi Medical University, 2Department of Surgery, University of Pittsburgh School of Medicine, 3Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine, 4Department of Pathology, University of Pittsburgh School of Medicine, 5Pittsburgh Liver Research Center, University of Pittsburgh, 6McGowan Institute for Regenerative Medicine, University of Pittsburgh

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем частичное желчных протоков лигирование как модель хирургической травмы печени и регенерации в грызунов.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Грызунов полный желчных протоков перевязки (cBDL) общего желчного протока является установленным хирургическая техника для изучения обструктивного холестаза и желчных путей распространения. Однако долгосрочные эксперименты могут привести к увеличению заболеваемости и смертности. В выберите мышь штаммы с основной болезни печени значимые сопоставления могут проводиться даже с перевязкой один лепесток печени, которые могут уменьшить животных потери и расходы. Здесь мы описываем перевязки (pBDL) частично желчных протоков в мыши, в котором перевязано только левой печени желчных протоков, вызывая непроходимость желчных в левой доле, но не остальных долей. С осторожным микрохирургической техники pBDL эксперименты могут быть экономически эффективными, поскольку unligated мочку служит в качестве внутреннего управления для перевязаны лопастями, при тех же условиях, в то же самое животное. В отличие от cBDL отдельный Шам-управления группа не является необходимым. pBDL очень полезна для непосредственно сравнить локализованные против системные эффекты холестаза и других компонентов, сохраненных желчи. pBDL может также использоваться как новый метод для изучения механизмов, связанных с лекарства и миграции клеток.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хирургическое модели острого повреждения печени и ремонт, как частичной гепатектомии или общего желчного протока перевязки (cBDL), использовали на протяжении десятилетий в грызунов для изучения регенерации печени и pathobiology1,2. В cBDL перевязано общего желчного протока (который истощает все желчи в печени), приводит к обструктивной холестаза, воспаление и фиброза в первые 2-3 недели после операции, с возможного прогрессирования цирроз3. Распространения желчных протоков, transdifferentiation и индукции-резидентов печени прогениторных клеток являются также особенности cBDL4,5. Хотя cBDL разъясняются конкретные механизмы хронической cholangiopathy, которые хорошо изученных с воспроизводимость результатов в мышах одичал типа и тех штаммов с нормальной печень6,7,8, процедура может технически сложных в некоторых моделях трансгенные мыши заболеваний печени, требующих более животных, чем ожидалось, из-за более высокой заболеваемости и смертности желчных препятствий с течением времени. Этот метод также полезен для изучения трансгенных мышей с лежащим в основе печени заболевания, которые могут в противном случае не терпеть стресс длительное время экспериментов курс после cBDL.

pBDL может обеспечить разумную альтернативу помочь преодолеть некоторые из этих проблем. Первоначальный pBDL исследований в мышах одичал тип стремились различать локально действуя и системных медиаторов воспаления9. В pBDL основной желчных слияния правой и левой печени желчных протоков выше общего желчного протока тщательно визуализируется в рубчик, и только левая печеночная желчных протоков перевязано для создания локализованных обструктивного холестаза. pBDL предлагает ряд преимуществ для cBDL. В pBDL unligated правой доли служит одинаково соответствием внутреннего контроля для перевязаны левой доли, подвергается же системные эффекты, такие как состояние питания или циркулирующим факторов. Хотя присутствовали системные Провоспалительных медиаторов, Осава et al. наблюдается меньше фиброз и некроз в unligated лопастями, но более воспалительных клеток и преобразование фактор роста β выражение в перевязаны доли9.

Совсем недавно pBDL была пересмотрена для изучения печени Паренхиматозный эффекты нераспределенной желчь10. С помощью же животное для внутреннего контроля (unligated «Шам») и экспериментальных групп, pBDL эффективно половинки количество животных, необходимых на эксперимент, который в свою очередь является более экономически эффективным. Мышей терпеть последствия pBDL гораздо лучше, так что идеальное время, курс эксперимент (≥2 недель) может быть достигнуто в перевязаны доле. Самое главное pBDL можно выделить прямые последствия внутрипеченочных обструктивного холестаза и сохранил желчи компоненты в перевязаны доле, по сравнению с unligated управления мочку. В целом pBDL-привлекательный метод для изучения воздействия доли конкретных локализованных холестаза в печени.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры были проведены в соответствии с этические руководящие принципы использования Комитета из университета Питтсбурга и институциональный уход животных.

1. Основные методы и общие процедуры

  1. Автоклав все микрохирургическое оборудование перед использованием.
  2. Чтобы избежать убийство мыши, анестезии, внимательно проверьте его ритм дыхания.
  3. Сенсорных органов и кишечника, как возможно избежать повреждения органов и вызывая кровотечение. Пресс кровотечение точек с влажные ватные тампоны или марлевые губки.
  4. Используйте влажные ватные тампоны для нежные манипуляции органов. Мокрые, нетканый марлевые губки используются в двух размерах, 3,5 × 3,5 см и 6.0 × 6.0 см. использовать меньший отозвать весь печени. Используйте больше одной обернуть малых и больших кишечника.

2. Прехирургическая подготовка

  1. Использование самцов мышей c57/b6, 8-12 недель (когда вес тела находится приблизительно 20-35 g) для перевязки частичного желчных протоков.
  2. Разрешить свободный доступ к воде и продовольствию мышей до индукции анестезии.

3. Частичная желчных протоков операция перевязки

  1. Анестезировать мыши, поставив животного в камеру всасывание с сочетанием 1,5-2,0% кислорода изофлюрановая и 1 Л/мин. Тщательно следить за животное, наблюдая тарифа дыхания. При одном дыхании в секунду, частота дыхания животных хорошо наркотизированных находится указатель мыши. Так как рефлекс вывод передних конечностей исчезает более быстрыми темпами, щепотка задних конечностей ног а также подтвердить полное отсутствие вывода рефлекс. Глаза должны быть смазаны с агентом глазные смазки для предотвращения язвы роговицы. Обратите внимание что первая доза болеутоляющее может предоставляться предоперационная предотвратить стимуляции болевых рецепторов.
  2. Бритье брюшной стенки с машинки для стрижки волос и поместите курсор мыши на операционном столе под хирургический Микроскоп. Исправьте все конечности в таблицу с лентой. Использование изофлюрановая ингаляции сохранить мыши под общим наркозом.
    1. Отрегулируйте изофлюрановая испарителем и использовать изофлюрановая 2.0-3.0% для индукции.
  3. С помощью стерильных тампонов, лечить брюшной стенки сначала с 0,3-0,5 мл повидон йод применяется местно, после чего на 70% спирте. Животные должны быть покрыты стерильные пелерина.
  4. Сделайте длинный срединной брюшной разрез от мечевидного лобка, используя ножницы и Adson щипцами. После внесения брюшной разрез, уменьшить изофлюрановая 0,8-1,0% на эксплуатационные расходы.
  5. Разоблачить брюшной полости с помощью микро-втягивающего устройства. Держите мечевидный пинцетом комаров и убрать в сторону головы мыши. Исправьте комаров щипцы на месте с помощью мягкой глины.
  6. Привить 1-2 мл утепленные (37 ° C) стерилизованные фосфат амортизированное saline (PBS) в брюшную полость во избежание ранения брюшной полости. Аккуратно убрать их к голове мыши и удерживая тонкого кишечника с влажные ватные тампоны. Вырежьте связок между тонкого кишечника и retroperitoneum, чтобы избежать, ранив тонкого кишечника (рис. 1A).
  7. Оберните малые и большие кишечника с губкой влажной, нетканый марлей. Поместите их в хвостовой части брюшной полости. Кишечника, завернутые в стерильные марлевые могут размещаться на стерильную драпированные поле, чтобы избежать загрязнения.
  8. Аккуратно убрать весь печени к мечевидный, используя небольшой мокрой марлей нетканый Губка подвергать печеночная рубчика и гепато двенадцатиперстной связки (рис. 1B).
  9. Проверка для подтверждения анатомию печени рубчика. Общего желчного протока расположен на вентральной стороне воротной вены. Подтвердите расположение право и левая печеночная желчных протоков, которые стекают в основной желчных слияния в печени рубчик.
  10. Идентифицировать левой печени желчных протоков, который истощает левой доли и окружают его с швом нейлона 10-0, используя тупой стороной иглой шов (рис. 2A). Избегайте, ранив воротной вены, печеночной артерии и печени поверхности.
  11. Перевязать левой желчных протоков с 10-0 нейлон. (Рис. 2B).
  12. Место малых и больших кишечника в том же положении, как и до операции, используя влажные ватные тампоны.
  13. Убедитесь, что нет кишечных кручения и внутрибрюшного кровотечения, а затем закройте мышц и кожи в два слоя с Викрил 4-0. Плетеные шовные (Викрил) был использован для закрытия кожи, но леска предпочтителен для уменьшения вероятности заражения.
    Примечание: Закройте фасции, продолжение шов от мечевидного до лобка, а кожу на продолжение шов от лобка до мечевидного.
  14. Остановите анестезии после закрытия разреза.

4. послеоперационное лечение и последующая деятельность

  1. Просто после операции, щепотка спинной кожи мыши и придать Buprenex (0,1 мг/кг) и содержит цефазолина (100 мг/кг), подкожно, следуют Buprenex инъекции каждые 12 ч для 3 дней и содержит цефазолина каждые 24 ч в течение 3 дней соответственно11,12 ,13. Обратите внимание что первая доза болеутоляющее может предоставляться предоперационная предотвратить стимуляции болевых рецепторов. Цефазолин и другие периоперационную антибиотики необходимы только для иммунной подавлены животных, таких как те, которые используются в трансплантации исследований.
    Примечание: Если операция выполнена успешно, указатель мыши обычно восстанавливается в течение 30 мин активность мышей будет почти таким же, как дооперационном условие.
  2. Проверьте мышь ежедневно для каких-либо признаков бедствия.
    1. Пожертвуйте мышей, шейки матки дислокации под общим наркозом для закупки печень и другие образцы тканей в определенное время точках (т.е., 7, 14, 21 день) после pBDL.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для этого типичного эксперимента pBDL была выполнена в трех экземплярах PiZ трансгенных мышей, которые пилки человека заболевание печени в дефицита альфа-1 антитрипсина (A1AT). PiZ мыши overexpresses трансген, состоящий из нескольких геномной фрагментов ДНК, которые содержат кодирования регионах мутант человеческого гена A1AT и промоутер, вместе с интронов и ~ 2 kilobases вверх и вниз по течению, окаймляющие регионах14, 15. Норма...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хотя cBDL является наиболее распространенным Экспериментальная техника для обструктивного холестаза, он может представлять множество проблем в грызунов. В зависимости от количество послеоперационных дней, необходимых для достижения конечной точки животных может испытать значительные заболеваемости и смертности по ходу времени. Степень повреждения тканей и желчных некроз усугубляется при работе с некоторыми моделями трансгенные мыши заболевания печени, которые демонстрируют ненормальное паренхимы печени и функции в базовы...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы имеют не раскрытия.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Д-р Хан признает поддержке гранта NIH/NICHD K12HD052892, альфа-1 фонд, Фонд Хиллман и исследовательский центр в Питтсбурге печени. Д-р Михалопулос признает Грантовая поддержка от NIH/NIDDK P01DK096990. Мы высоко ценим прекрасный и щедрый технической помощи Anne Орр. Мы признательны также д-р Дэвид а. Геллер для предоставления доступа к лаборатории трансплантации/грызунов микрохирургии.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Микроскоп-Leica Wild M650, 6– в 40 раз; увеличениеLeica Microsystemsн/а
Tec 3 изофлуран воронка заполнение испарительобщий анестезиологический сервисн/а
Stevens Тенотомия ножницыAccurate Surgical & Scientific Instruments CorporationASSI.9193
Щипцы АдсонаFine science tools11006-12
Комары классические деликатные кровоостанавливающие щипцыCodman30-4472
МикроретракторMurdock; Хирургический инструмент RobozRS-6550
Нетканые марлевые губкиFisherband870-PC-DBL
Puritan 6" Маленькая ватная палочка с деревянной ручкойPuritan Medical Products Company868-WCS
Dumont SS Щипцы - стандартные наконечники / Прямые / Inox / 13,5 смИнструменты для тонкой науки11203-23
Щипцы Dumont SS - стандартные наконечники / Угловые 45 градусов / Inox / 13,5 смИнструменты для тонкой науки11203-25
Пружинные ножницы Vannas - 3 мм Режущая кромкаИнструменты для тонкой науки15000-00
Микроигольчатый держательAesculap Хирургические инструментыFD231R
Micro AROSuture, стерильный нейлоновый шовный 10-0, 70 &; m, TAP pointsAROSurgical Instruments CorporationT4A10N07
4-0 VicrylEthiconJ662H
5-мл ШприцBD309646
чашка для культуры тканей Falcon, 60 & 15 раз 15 ммCorning353002
изофлурана, Фармакопея США (USP) жидкость для ингаляций, 250 млPiramal HealthcareNDC 66794-017-25
Бупренекс инъекционный (бупренорфина гидрохлорид)Reckitt Benckiser PharmaceuticalsNDC 12496-0757-1
Цефазолин для инъекций, USPAPP PharmaceuticalsNDC 63323-238-61
Раствор для скраба PVP (povidone– йод 7,5%)MedlineNDC 12496-0757-1
70% этанолDecon Labs2716
фосфатный буферный физиологический раствор без кальция или магнияLONZA17-516F
Sirius RedSigma365548
гематолксилиномFisher (Richard-Allan Scientific)22-050-111 (7211)
EosinAnatech (Fisher)832 (NC9686037)
ФормалинФишерSF100-20

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Higgins, G. M., Anderson, R. Experimental pathology of the liver - Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal. Arch Pathol. 12, 186-202 (1931).
  2. Cameron, G. R., Oakley, C. L. Ligation of the common bile duct. The Journal of Pathology and Bacteriology. 35 (5), 769-798 (1932).
  3. Kountouras, J., Billing, B. H., Scheuer, P. J. Prolonged bile duct obstruction: a new experimental model for cirrhosis in the rat. Br J Exp Pathol. 65 (3), 305-311 (1984).
  4. Michalopoulos, G. K., Barua, L., Bowen, W. C. Transdifferentiation of rat hepatocytes into biliary cells after bile duct ligation and toxic biliary injury. Hepatology. 41 (3), 535-544 (2005).
  5. Dipaola, F., et al. Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice. Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).
  6. Guyot, C., Combe, C., Desmouliere, A. The common bile duct ligation in rat: A relevant in vivo model to study the role of mechanical stress on cell and matrix behaviour. Histochem Cell Biol. 126 (4), 517-523 (2006).
  7. Zhang, Y., et al. Effect of bile duct ligation on bile acid composition in mouse serum and liver. Liver Int. 32 (1), 58-69 (2012).
  8. Tag, C. G., et al. Bile duct ligation in mice: induction of inflammatory liver injury and fibrosis by obstructive cholestasis. J Vis Exp. (96), e52438(2015).
  9. Osawa, Y., et al. Systemic mediators induce fibrogenic effects in normal liver after partial bile duct ligation. Liver Int. 26 (9), 1138-1147 (2006).
  10. Khan, Z., et al. Bile Duct Ligation Induces ATZ Globule Clearance in a Mouse Model of alpha-1 Antitrypsin Deficiency. Gene Expr. 17 (2), 115-127 (2017).
  11. Birkhead, H. A., Briggs, G. B., Saunders, L. Z. Toxicology of cefazolin in animals. J Infect Dis. 128, 378(1973).
  12. Kunst, M. W., Mattie, H., van Furth, R. Antibacterial efficacy of cefazolin and cephradine in neutropenic mice. Infection. 7 (1), 30-34 (1979).
  13. Traul, K. A., et al. Safety studies of post-surgical buprenorphine therapy for mice. Lab Anim. 49 (2), 100-110 (2015).
  14. Carlson, J. A., et al. Accumulation of PiZ alpha 1-antitrypsin causes liver damage in transgenic mice. J Clin Invest. 83 (4), 1183-1190 (1989).
  15. Sifers, R. N., Finegold, M. J., Woo, S. L. Alpha-1-antitrypsin deficiency: accumulation or degradation of mutant variants within the hepatic endoplasmic reticulum. Am J Respir Cell Mol Biol. 1 (5), 341-345 (1989).
  16. Rudnick, D. A., Shikapwashya, O., Blomenkamp, K., Teckman, J. H. Indomethacin increases liver damage in a murine model of liver injury from alpha-1-antitrypsin deficiency. Hepatology. 44 (4), 976-982 (2006).
  17. Heinrich, S., et al. Partial bile duct ligation in mice: a novel model of acute cholestasis. Surgery. 149 (3), 445-451 (2011).
  18. Glaser, S. S., Alpini, G. Activation of the cholehepatic shunt as a potential therapy for primary sclerosing cholangitis. Hepatology. 49 (6), 1795-1797 (2009).
  19. Gurpinar, E., et al. A novel sulindac derivative inhibits lung adenocarcinoma cell growth through suppression of Akt/mTOR signaling and induction of autophagy. Mol Cancer Ther. 12 (5), 663-674 (2013).
  20. Alpini, G. G., Francis, H., Marzioni, M., Venter, J., Phinizy, J., LeSage, G. Madame Curie Bioscience Database. , Landes Bioscience. Austin, TX. (2013).
  21. Kirkland, J. G., et al. Reversible surgical model of biliary inflammation and obstructive jaundice in mice. J Surg Res. 164 (2), 221-227 (2010).
  22. Delhove, J. M., et al. Longitudinal in vivo bioimaging of hepatocyte transcription factor activity following cholestatic liver injury in mice. Sci Rep. 7, 41874(2017).
  23. Li, C., et al. Homing of bone marrow mesenchymal stem cells mediated by sphingosine 1-phosphate contributes to liver fibrosis. J Hepatol. 50 (6), 1174-1183 (2009).
  24. Xu, J., et al. Factors released from cholestatic rat livers possibly involved in inducing bone marrow hepatic stem cell priming. Stem Cells Dev. 17 (1), 143-155 (2008).
  25. Sharma, S., et al. Propitious role of bone marrow-derived mononuclear cells in an experimental bile duct ligation model: potential clinical implications in obstructive cholangiopathy. Pediatr Surg Int. 29 (6), 623-632 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Partial Bile Duct LigationBile Duct LigationObstructive CholestasisHepatic Bile DuctLiver RegenerationSurgical TechniqueMouse ModelLiver InjuryBile Duct ProliferationLocalized Obstruction

Related Articles