Методическая статья

Выделение и характеристика нейтрофилов производные микрочастиц для функциональных исследований

DOI:

10.3791/56949

⸱

2 марта 2018 г.

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь описываются новые протоколы изолировать и характеризуют микрочастицы, производные от человека и мыши нейтрофилов. Эти протоколы используют ultracentrifugation, проточной цитометрии и immunoblotting методы для анализа содержания микрочастица, и они могут быть использованы для изучения роли микрочастицы, полученных из различных типов клеток в клеточную функцию.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Полиморфноядерных нейтрофилов производные микрочастиц (ПМН)-м/с), липидный бислой, сферические микровезикулы с размерами от 50 до 1000 Нм в диаметре. М/с являются недавно развивается, важной частью ячеек для связи и сигнализации машин. Из-за их размера и характера их выпуска до недавнего времени было игнорировать существование MP. Однако с усовершенствованной технологии и аналитические методы теперь становится их функции в здоровье и болезни. Здесь представлены протоколы направленные на изоляцию и характеризующие ПМН-МПС проточной цитометрии и immunoblotting. Кроме того приводятся некоторые примеры реализации. Эти протоколы для изоляции MP быстрый, недорогой и не требует использования дорогих комплектов. Кроме того они позволяют для маркировки депутатов после изоляции, а также предварительно маркировки источник клеток до выпуска MP, используя проточной цитометрии мембраны конкретных Люминесцентную краску для визуализации и анализа. Эти методы, однако, имеют некоторые ограничения, включая чистоты ПНЛ и депутатов и потребность в сложных аналитических приборов. High-end проточный цитометр необходима для надежного анализа м/с и свести к минимуму ложные положительные читает из-за шума или auto флуоресценции. Описанные протоколы могут использоваться для изоляции и определить биогенеза MP и охарактеризовать их маркеры и изменения в составе различных стимулирующих условиях. Размер неоднородность может быть использована расследовать ли содержание частиц мембраны против exosomes отличается, и ли они выполняют различные роли в ткани гомеостаза. Наконец можно изучить следующие изоляции и характеристика депутатов, их функции в клеточных реакций и различных моделей болезни (в том числе, ПМН ассоциированных воспалительных расстройств, таких как воспалительные заболевания кишечника или острого повреждения лёгких).

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Недавно, «микрочастицы/микровезикулы» возникая от в цитозоле клеток или плазматической мембраны стали большой научный интерес, как новые данные показывают, что эти структуры, начиная от 50-1000 Нм в диаметре, может нести биологической информации и служить неканонических метод сотовой связи. Иммунной клетки производные м/с, и особенно производимые полиморфноядерных нейтрофилов (ПНЛ) представляют большой интерес, учитывая важную роль ПНЛ в принимающей обороны1,2, воспалительные реакции3и заживление ран 4. до настоящего времени, интригующе, многочисленные доклады показали, про воспалительных и противовоспалительным функции ПМН-МПС5, предлагая потенциальным контекст-, болезни-, видов-и органоспецифическая роль депутатов.

Описанные протоколы в этой связи обеспечивают экономически эффективные, инновационные и адаптируемой метод для изучения функции депутатов в здоровье и болезни. Они применимы для многих модельных организмов, органов и стимуляции условий. Они позволяют для идентификации нескольких типов депутатов и может использоваться в будущем для решения их про воспалительных и противовоспалительными функций. В качестве примера, описанные здесь, как для изучения функции ПМН-депутатов в эпителиальных рану исцеления, в пробирке и в естественных условиях. Представленные протокол для изоляции мыши, костного мозга, полученных ПНЛ был адаптирован с некоторыми изменениями из ранее описанных метод6.

Кроме того, протоколы, описанные в данном исследовании позволяют для обнаружения и определения характеристик определенных маркеров, которые могут быть найдены на ПМН-МПС двумя взаимодополняющими методами: западной помарки и проточная цитометрия. Мы находим, что immunoblotting депутатов, используя стандартные протоколы5 легко и надежно, однако, последние достижения в чувствительность потока цитометрии инструментов и улучшение коэффициента шума на сигнал теперь позволяют для дальнейшего анализа депутатов с помощью этого метода. Описанные протоколы в этом исследовании включать последние достижения и рекомендации от оригинальных научных статей, включая изменения в центрифугирования скорости и времени, помимо условий фильтрации и замораживания/хранения образца7 , 8и как уменьшить «шумы», повысить предел обнаружения ПМН-депутатов и дискриминацию между различными размерами депутатов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все животные работы был одобрен северо-IACUC. Все эксперименты были завершены в соответствии и соблюдение всех соответствующих нормативных и институциональных руководящих принципов. Для сдачи донорской крови человека предметов осознанного согласия был представлен и подписано; Кроме того все человеке в этом исследовании рассматривались в соответствии с институциональной и федеральные руководящие принципы для благополучия человека.

Примечание: Протокол шаги, перечисленные в следующих подразделах: (i) изоляция клетки костного мозга мыши; (ii) ПМН изоляции из мышиных костного мозга; (iii) ПМН изоляции от человеческой крови; (iv) MP изоляции от ПМН Supernatants (по Ultracentrifugation); (v) Характеристика депутатов, западный Blotting; (vi) Характеристика депутатов подачей Cytometry; (viii) применение изолированных депутатов для исследования рану исцеление

1. мышь изоляция клетки костного мозга

  1. Рассечение бедренной и большеберцовой кости от мыши задних лапах
    1. Подготовьте эвтаназии поле (например, поле Подсказка пустым 1 мл) для ингаляционной анестезии. Добавьте несколько капель 100% изофлюрановая на стерильной тканью, приклеенный к внутренней крышкой пластиковая коробка. Согласно новой IACUC руководящие принципы животные не приходят в прямой контакт с изофлюрановая, таким образом место Наконечник держателя между мышью и марля, содержащие изофлюрановая.
      Примечание: Изофлюрановая является мощным ингаляционных анестетика и следует подходить с крайней осторожностью внутри зонта.
    2. Усыпить мышей согласно рекомендации IACUC. Поместите мышь внутри окна эвтаназии, описанный в шаге 1.1.1 для 1 – 5 мин, до тех пор, пока он перестал дышать. Обеспечения смерти животного, выполняя шейки матки дислокации.
    3. Поднимите брюшной кожи с использованием нержавеющей стали, 12 см изогнутая, 0.17 мм X 0,1 мм пинцет и вырезать кожу на полпути между верхних и нижних конечностей. Очистите кожу от здесь в разделе наиболее дистальных мыши тела, включая нижних конечностей. С 10 см длиной прямо рассекает ножницы, удалите мышцы из задних ног и вывихнуть тазобедренного сустава, оставляя нетронутыми головку бедренной кости.
    4. Используйте ножницы, чтобы рассечь мышцы бедра и голени и бедра от голени. Убедитесь, что концы кости остаются нетронутыми, поскольку они содержат значительное количество костного мозга.
    5. Удалите все оставшиеся плоти прокаткой кости внутри бумажным полотенцем. Место чистой кости в чашку Петри, содержащие Serum-Free среднего (УЛП, т.е., средний (DMEM) Дульбекко изменение орла без сыворотки или антибиотики).
    6. Промывайте кости в 70% этанола и затем УЛП.
    7. Подготовка 50 мл УЛП в 50 мл Конические трубки. Загрузить в 10 мл шприц 10 мл УЛП и прикрепить его к иглы 25 и 5/8 дюйма.
    8. Обрежьте конец кости с ножницами до тех пор, пока отверстие на костный мозг (красного цвета) является видимым.
    9. Промойте клеток костного мозга в новый Тюбик 50 мл. Используйте шприц 10 мл с иглой колеи 26 и 5/8 дюйма с приблизительно 3 мл/кость УЛП. По окончании промывки Ресуспензируйте клетки в трубе, дозирование (использование Наконечники одноразовые 1 мл) сломать агрегаты клеток.

2. ПМН изоляции из мышиных костного мозга

  1. Лизис эритроцитов
    1. Пелле собранных костного центрифугированием при 350 x g 8 мин при 4 ° C.
    2. Ресуспензируйте Пелле клеток в 20 мл 0,2% NaCl для примерно 20-30 s чтобы лизировать часть эритроцитов. Не превышать 30 s как это приведет к ПМН lysis. Добавить 20 мл 1,6% NaCl для восстановления осмотического давления.
      Примечание: Этот шаг может привести к очень мало ПМН активации.
    3. Вымойте клетки с 2 мл PBS и центрифуги как шаг 2.1.1 выше. Удалите супернатант.
    4. Перейти к изоляции ПНЛ, плотность градиентного центрифугирования.
  2. Изоляция нейтрофилов по плотности градиентного центрифугирования
    1. Polysucrose и натрия diatrizoate теплого, с плотностью 1.119 г/мл и 1,077 г/мл (см. Таблицу материалы), до комнатной температуры (RT) перед использованием.
    2. Подготовка polysucrose и натрия diatrizoate градиенты свежие, сразу перед нанесением клеток костного мозга, медленно расслоение 3 мл 1,077 г/мл раствора плотностью свыше 3 мл раствора плотностью 1.119 г/мл в 15 мл конические трубы.
      Примечание: Подготовка градиентного раствора слишком далеко заранее приведет к смешивания слоев и бедных нейтрофилов чистоты и восстановления.
    3. Ресуспензируйте Пелле клеток костного мозга в 1 мл ледяной PBS и наложение результирующий суспензию клеток на вершине polysucrose и натрия diatrizoate градиента (медленно, чтобы избежать смешивания слоев).
    4. Центрифуги для 30 мин при 850 x g при 25 ° C на RT, без тормозов. Держите реагентов на RT для эффективного разделения нейтрофилы от других клеток в костном мозге. Установите центрифуги на медленных замедления для градиента эффективно сформирована и сохранены после центрифугирования шага.
    5. Визуально обнаружить слоя мононуклеарных клеток на стыке PBS и 1,077 г/мл плотность раствора (верхний слой). Удалите этот слой и на остальной части плотность раствора не нарушая полосе ПМН.
    6. Соберите весь слой ПМН и некоторые из основных polysucrose и натрия diatrizoate 1.119 г/мл раствора в 15 мл пробирок с помощью пипетки передачи.
      Примечание: Чистоту изолированных ПНЛ будет зависеть от полного удаления верхнего слоя.
    7. Топ трубы с отфильтрованной PBS (фильтруется через фильтр размер поры 0,1 мкм) и центрифуги на 300 x g 5 мин, при 4 ° C.
    8. Вымойте гранулированных ПНЛ с 2 мл PBS с помощью центрифугирования условий как в шаге 2.2.7.
    9. Ресуспензируйте в 1 мл отфильтрованных PBS и рассчитывать изолированных ПНЛ, Горяева.
      Примечание: Для этого метода изоляции, результирующий чистоты PMN составляет ~ 85-90%, как оценивалась путем проточной цитометрии. Оставшиеся загрязнения фракции состоит главным образом из мононуклеарных лимфоцитов.
  3. ПМН стимуляции заставить MP-релиз
    Примечание: ПНЛ может стимулироваться выпустить м/с, с использованием различных условий активации, включая N-formyl-l-methionyl-leucyl-l-phenylalanine (fMLF), phorbol-12-миристат-13-ацетат (PMA) или гамма-интерферона (IFNγ). Важно отметить, что до моделирования, ПНЛ должны храниться на льду во все времена.
    1. Пелле ПНЛ (300 x g, 5 мин, 4 ° C) и Ресуспензируйте в 0,1 мкм фильтруют Хэнка сбалансированного солевого раствора раствор (HBSS), содержащий агент стимулирования выбора. Для оптимальной стимуляции используйте 100 мкл раствора стимуляции на 10 миллионов ПНЛ для 20-30 минут при 37 ° C в 15 мл пробирок.
      Примечание: Следующие активаторы успешно использовались концентрации в нашей предыдущей работы: fMLF (0.5-1 мкм для человека и 2-5 микрон для мыши ПНЛ), PMA (200 Нм), а IFNγ (100 нг/мл). Если выпуск предварительно помечены депутатов, инкубировать кератоз ПНЛ (1-5 х 106) с N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC (см. Таблицу материалы) (1 мкм в 100 мкл HBSS, 15 мин., 37 ° C). Приступайте шаги 2.3.1-2.3.3.
    2. Спин вниз на 850 x g 5 минут при температуре 4 ° C, чтобы удалить ПНЛ и передать новый 1,5 мл пробирок microcentrifuge supernatants клетки бесплатно.
    3. Для MP изоляции от supernatants клетки бесплатно перейдите к шагу 4.2.

3. ПМН изоляции от человеческой крови

  1. Набираем здоровых добровольцев для извлечения крови согласно рекомендациям институциональных IRB.
    1. Сбор крови от предплечья здоровых добровольцев в коммерчески доступных 5 мл натрия цитрат содержащие трубы (см. Таблицу материалы).
    2. Пипетка 5 мл раствора diatrizoate декстран и натрия (плотность 1,113 г/мл, смотрите Таблицу материалы) в стерильных 15 мл пробирок и медленно слой 5 мл свежевыделенных периферической крови человека поверх него.
    3. Центрифуга трубы 50 мин на 400 x g на RT (25 ° C) с низкой ускорение и без тормозов.
    4. В конце центрифугирования удалите плазмы и мононуклеарных клеток (верхний слой) с помощью стерильных пластиковых всасывания пипетки.
    5. Нижний слой (ПНЛ) перевести в новый стерильный 50 мл Конические трубки.
    6. Добавьте равным объемом 0,45% NaCl ПНЛ (смесь хорошо и аккуратно, повернув трубу).
    7. Центрифуги для 10 мин на 400 x g при 25 ° C.
  2. Лизис эритроцитов
    1. Добавить 10 мл ледяной, стерильной воды для гранулированных клетки для 45 s следуют 10 мл ледяной стерильные 1,8% NaCl для восстановления осмотического давления.
      Примечание: Все следующие шаги для изоляции ПМН должно производиться на льду, чтобы избежать активации ПМН и досрочного освобождения MP. Лизис шаг, сам приводит к активации ПМН незначительные, но не значительные, однако, важно для изоляции чисто ПМН населения для функциональных анализов.
    2. Центрифуга клетки для 10 мин на 250 x g при 4 ° C с мягкой замедление.
    3. Повторите шаги 3.2.1 и 3.2.2.
    4. Ресуспензируйте ПНЛ в 5 мл ледяной HBSS без кальция или магния. Граф всего живых клеток (используйте Горяева и жизнеспособности, пятнать в разведении 1:2, смотрите Таблицу материалы) до стимуляции.
      Примечание: Изолированные ПНЛ должны использоваться для стимуляции или иных экспериментов в течение 2 ч изоляции чтобы избежать изменения функциональных и клеточных и смерть клетки.

4. депутат изоляции от активированные ПМН Supernatants

Примечание: Аналогичный протокол используется для изоляции депутатов от ПНЛ мышиных и человека.

  1. Пелле ПНЛ (300 x g, 5 мин, 4 ° C) и Ресуспензируйте в 0,1 мкм фильтруют HBSS раствор, содержащий агент стимулирования выбора (например 1 мкм fMLF, см. Примечание: 2.3.1). Для оптимальной стимуляции используйте 100 мкл раствора стимуляции на 10 миллионов ПНЛ для 20-30 минут при 37 ° C в 15 мл пробирок.
  2. Следующие стимуляции, спин вниз активированные ПНЛ на 600 g x 5 минут при температуре 4 ° C и передавать новые 1,5 мл microcentrifuge трубы supernatants клетки бесплатно.
  3. Центрифуга ПМН очищены супернатант в 13000 x g, 10 мин, 4 ° C до удаления мусора клеток и передачи разминированных супернатант в новой ультрацентрифуга трубку.
  4. Центрифуги для 1 h на 100,000 x g, при 4 ° C. Удаление supernatants до хранения MP. При необходимости, магазин гранулированных м/с в ампулах ультрацентрифуга трубок-80 ° C до использования в экспериментах парафин.

5. изучение ПМН-депутатов, западный Blotting

  1. Добавить 1% SDS буфера (50-200 мкл рабочего раствора с pH трис 100 мм: 7,4) депутатам Пелле (из шага 4.4), передачи в новые трубы microcentrifuge 1,5 мл и варить лизированных депутатов за 5 мин.
    Примечание: Количество депутатов и объем буфера lysis необходимо скорректировать и оптимизированы для каждого протеина интереса.
  2. Загрузите равных количествах ПМН-депутатов за Лейн в загрузке буфер, содержащий 10% β-меркапто этанола.
    Примечание: С нашим методом мы загрузим м/с, которые были изолированы от такое же количество стимулировали ПНЛ.
    1. Отделить лизатов на SDS-PAGE на 10% полиакриламидном геле (использовать 50-100 V на 1-1,5 ч) и передачи всего белков на нитроцеллюлозную мембраны как описано9.
  3. Блокировать мембраны за 1 час с 5% обезжиренное молоко в солевой раствор 0,05% Tween-20 трис-буфер и проинкубируйте его с соответствующей первичной (на ночь при 4 ° C), следуют вторичных HRP-конъюгированных антител.
  4. Визуализируйте полос путем добавления chemoluminescence решение мембраны и подверженности рентгеновской пленки внутри свет доказательство кассету (1-24 ч).

6. изучение ПМН-депутатов по проточной цитометрии

  1. Для пятнать антитела, разбавьте антитела надлежащим образом в буфере СУИМ (PBS с 0,1 мм ЭДТА, азид натрия 0,1%). Ресуспензируйте гранулированных ПМН-МПС (производный от 1-3 х 106 ПНЛ/состояние) в раствор антител 100 мкл.
    1. Если окрашивание для Annexin V, Ресуспензируйте гранулированных ПМН-МПС в Annexin V буфер, содержащий 5 мкл FITC-конъюгированных Annexin V. Если совместно окрашивание с антителами, добавьте желаемый антитела (для примера см. Таблицу материалы) непосредственно Annexin V решение. Добавляют флуоресцентный липидов краситель, N-(2-aminoethyl) maleimide (см. Таблицу материалы), на 1 мкм концентрации в 100 мкл буфера СУИМ по маркировке и идентификации м/с.
  2. Инкубировать депутатов в окрашивание раствора для по крайней мере 20 мин при 4 ° C.
  3. Стирать депутаты ultracentrifugation (1 час на 100,000 x g, при температуре 4 ° C); Выбросите супернатант.
  4. Ресуспензируйте в буфере СУИМ и запуск образцов на назначенный проточный цитометр оснащены обновленный электронный блок для увеличения чувствительности (см. Таблицу материалы).

7. приложения для изолированных ПМН депутатов для изучения функции ПМН в заживлении ран

  1. В естественных условиях администрация ПМН-депутатов толстой раны
    1. Анестезировать мышей, внутрибрюшинного введения смеси кетамин (100 мг/кг) и ксилазина (5 мг/кг). Подтвердите анестезии, педаль рефлекс (фирмы мыс пинча) и корректировать по мере необходимости.
    2. Поместите курсор мыши на ее живот и с помощью биопсии 28-см щипцы и эндоскопа, оборудован с камерой с высоким разрешением (например ветеринарных эндоскоп для использования малых животных, см. Таблицу материалы), генерировать неглубокие раны 3-5 вдоль спинной стороне Колон. После завершения ранения возвращение мышей к клетке помещен на коврике контролируемой температурой (37 ° C) пока не оправился.
    3. Анестезировать мышей (как в шаге 7.1.1). Используйте эндоскопа для получения изображения, нанесенные раны 24 часа (1 день) после ранения. Пусть мышей восстановить как шаг 7.1.2.
    4. В то же время (24 ч после ранения) администрирование мышиных ПМН-МПС, производный от ПНЛ6 2 x 10 в 100 мкл HBSS + непосредственно в каждом рану сайт с помощью системы (используйте иголку 29 G) на основе колоноскопия микроинъекции9. Три дня позже (4-й день после ранения) анестезировать мышей (как в шаге 7.1.1) и использования эндоскопа для повторного получения изображения заживления ран. Пусть мышей восстановить как шаг 7.1.2.
    5. С помощью предпочтительный образ программного обеспечения для анализа (см. Таблицу материалы), набросков видны раны регионов в полученных изображений, мера области же раны на дней 1 и 4 после ранения и вычислить процент закрытия раны.
  2. Человека эпителиальных клеток в vitro заживление ран
    1. BBe Како-2 фото или T84, человека кишечные эпителиальных клеток, 5 x 105 клеток/хорошо Горяева и семян в 24-ну культуры пластин. Инкубируйте клетки в камере стандартного инкубации при 37 ° C и 5% CO2. Како-2 BBe или T84 достичь confluency в течение 48 ч9. Культура клетки эпителия, использовать DMEM и DMEM-F12 (50: 50) с добавками как ранее описанные9.
    2. Генерировать механические царапин ран в монослое с помощью кончика пипетки и низкой всасывания как описано4,9. Получать изображения участков раны сразу же после царапин с помощью микроскопа Перевернутый фазово контрастной дифференциальной помехи (5 X или 10 X цели), чтобы использоваться как время = 0 контрольной точки.
    3. Добавьте м/с (производный от 2-4 X 10 ПНЛ6 ) монослои царапается ранен эпителиальных клеток и инкубировать на дополнительные 24 часа (48 ч после ранения, при 37 ° C с 5% CO2). В настоящее время повторно получить изображения скретч-ран.
    4. Использовать программное обеспечение для анализа предпочтительный образ (см. Таблицу материалы) для измерения области раны на t = 0, t = 48 ч. вычислить процент закрытия РАН, определяя разницу в области раны в точках выбранного времени.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ представительных потока гранулярных депутатов, которые были изолированы от человека и мыши ПНЛ показаны на рисунке 1. Размер неоднородность ПМН-депутатов могут быть оценены путем сравнения для известных размера бусин, как показано на рисунке 1A, B для человека м/с. Примечание, никаких существенных различий в размер неоднородность наблюдались между мыши и человека MPs. Аналогичным образом с помощью проточно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом сообщении описываются протоколы изоляции и характеристика ПМН производные депутатов. Для успешного проведения процедуры необходимо учитывать несколько ключевых критических точек. Во-первых ПНЛ должен быть изолирован свежие и используется в экспериментах в течение 2 ч изоляции для предотвращения спонтанного активации и дегрануляции. Все обработки ПНЛ во время изоляции и вплоть до стимуляции должны выполняться на льду для предотвращения активации и преждевременной MP версии12. Во-вторых ultra...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют никакого конфликта интересов любого рода, связанных с этой связи

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарны за технической помощи Сваминатана Сучитра доктора, который проходит северо-Фейнберг Школа из медицины потока цитометрии ядро. Финансирование было предоставлено DK101675 (НИЗ).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DMEMCorning10-041-CV
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (Инактивированная при нагревании)Atlanta BiologicsS11150
Пенициллин/Стрептомицин (10 000 единиц пенициллина / 10 000 мг/мл стрептококка)GIBCO15140
0,5 M ЭДТАФишерBP2482
Хлорид натрияSigmaS9888Стерильный и отфильтрованный через 0,1 микронный фильтрующий блок
Стерильный фильтрованный Histopaque 1077Sigma10771
Стерильный фильтрованный Histopaque 1119Sigma11191Плотность 1,119 г/мл. Раствор полисахарозы и  Диатризоат натрия. Доведите до комнатной температуры
фосфатно-солевой буфер (PBS) без кальция и магнияCellgro210-40-CV
Этиловый спирт (200 proof)Decon labs2701
HBBSCorning21-022-CV
Трипановый синий раствор, 0,4%SigmaT8154  SIGMAРазбавленный 1:2 для подсчета жизнеспособности клеток
ИзофлуранAbbot50033
Anti-human CD11b-APC конъюгированныйBiolegend301350Клон ICRD44 (Итоговая концепция: 1 &микро; г/мл)
BODIPY FLInvitrogenB10250N-(2-аминоэтил) малеимид 
Аннексин V связывающий буферBiolegend422201
калибровочные шарики для проточной цитометрииBioCytex7803
FITC Аннексин VBiolegend640906
PolymorphprepAxis-Shield PoC ASДитризоат натрия/Декстран 500, плотность 1,113 г/мл
C57BL/6 мышейJackson Labs
15 мл центрифуга пробиркиCorning430053
50 мл центрифужные пипеткиBD Falcon352070
25 мл серологические пипеткиCelltreat229225B
10 мл серологические пипеткиCelltreat229210B
5 мл серологические пипеткиCelltreat229205B
Пастеровские пипетки BD Falcon357575
25 г x 5/8 дюйма Иглы (прецизионные скользящие иглы)BD305122
100 &микро; Пробирки для клеток Celltreat229485
VacutainerTubes BD367251
Equipment
LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP)BD(SORP)
Центрифуга с качающимся ведромThermoFisher Scientific75007210
UltracentrifugeBeckman(L8-80 M)
МикроцентрифугаThermoFisher Scientific  ВВ-17703-15 (Фреска 17)
Качающаяся ковшовая центрифугаThermoFisher Scientific  75004503 (Megafuge 40R)
Щипцы для биопсии, 28 смStorz27071zj
Software
Image JНациональный институт здравоохраненияс открытым исходным кодом 

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hickey, M. J., Kubes, P. Intravascular immunity: the host-pathogen encounter in blood vessels. Nat Rev Immunol. 9 (5), 364-375 (2009).
  2. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat Rev Immunol. 6 (3), 173-182 (2006).
  3. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).
  4. Butin-Israeli, V., et al. Deposition of microparticles by neutrophils onto inflamed epithelium: a new mechanism to disrupt epithelial intercellular adhesions and promote transepithelial migration. FASEB J. , (2016).
  5. Gasser, O., Schifferli, J. A. Activated polymorphonuclear neutrophils disseminate anti-inflammatory microparticles by ectocytosis. Blood. 104 (8), 2543-2548 (2004).
  6. Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. J Vis Exp. (77), e50586(2013).
  7. Shet, A. S. Characterizing blood microparticles: technical aspects and challenges. Vasc Health Risk Manag. 4 (4), 769-774 (2008).
  8. Dey-Hazra, E., et al. Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing. Vasc Health Risk Manag. 6, 1125-1133 (2010).
  9. Slater, T. W., et al. Neutrophil Microparticles Deliver Active Myeloperoxidase to Injured Mucosa To Inhibit Epithelial Wound Healing. J Immunol. 198 (7), 2886-2897 (2017).
  10. Enjeti, A. K., Lincz, L., Seldon, M. Bio-maleimide as a generic stain for detection and quantitation of microparticles. Int J Lab Hematol. 30 (3), 196-199 (2008).
  11. Headland, S. E., et al. Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis. Sci Transl Med. 7 (315), (2015).
  12. Andersson, T., Dahlgren, C., Lew, P. D., Stendahl, O. Cell surface expression of fMet-Leu-Phe receptors on human neutrophils. Correlation to changes in the cytosolic free Ca2+ level and action of phorbol myristate acetate. J Clin Invest. 79 (4), 1226-1233 (1987).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи