В естественных условиях Одноместный молекула отслеживания на терминале Пресинаптический двигательного нерва дрозофилы

Нейронные связи опирается на нейромедиатора релиз, в котором происходит через регулируемые синтез содержащих нейромедиатор синаптических пузырьков с плазматической мембраны¹. Этот процесс называется экзоцитоз^2,3,4,5,6 очень динамичен и может быть вверх или вниз регулируемой согласно колебания курса стимуляции⁷. Белков, участвующих в этих процессах подлежат броуновского движения и таким образом отображать наноструктурном Организации, способной выдержать ряд обязательных действий, которые лежат в основе этих физиологических функций. Белки плазмы мембраны очень динамичный, позволяя бокового захвата молекул в нанокластерами на плазматической мембране^{7,8,9,10,11, 12}. Таким образом расследование мобильности этих белков помогает прояснить их режим действий⁸. Синаптических белков, таких как растворимые N-ethylmaleimide чувствительным фактором вложения белок рецепторы (ловушки), например Синтаксин 1A, теперь известны демонстрируют боковой быстро мобильности, а также боковые треппинга в пределах нанокластерами, который может служить как молекулярная складов и мест для везикул фьюжн^9,13,14,15.

Недавнее развитие photoconvertible флуоресцентных белков, таких как мономерные (m) Eos^16,17 и¹⁸Каэдэ позволила наноструктурном резолюции нейрональных плазмы мембранных белков с помощью подходов таких как фото активированный локализации микроскопии (PALM) и стохастические оптических реконструкции микроскопии (шторм)^14,15,19. Эти события позволили расследования мобильность и nanoclustering биологических белков в культивировали живые клетки и нейроны. Совсем недавно были проведены исследования для выяснения (на аналогичных высоких разрешениях) динамика и организации этих мембранных белков в нейронах живых организмов нетронутыми такие Mus musculus, Caenorhabditis elegans и Drosophila melanogaster^14,20,21,22.

Изучение динамики и организации белка в естественных условиях требует не только использования недавно разработанных суперразрешением изображений инструментов (таких как пальмы, буря и photoconvertible флуорофоров), но также способность преодолевать препятствия такой как доступность белка и глубина проникновения изображений лазера. Imaging внутриклеточных белков в неповрежденной животное изначально сложным, как изображений белков на структуры, встроенных глубоко в живых тканях нетронутыми животного, например гиппокампа нетронутыми мыши. Следовательно более легко отражаются белки на или вблизи поверхности ткани. Еще одна трудность с imaging в естественных условиях — в деле обеспечения воспроизводимости через животных. Как Анатомия может отличаться от одного образца на другой, выбрав структуру с легкостью репликации в различных образцах нетронутыми животных также может оказаться сложной задачей. Использование стереотипных структур, таких как синапсов, помочь в преодолении некоторых из этих трудностей.

Недавние исследования отображаемого подвижности белков в животных с оптически прозрачные эпидермис например Caenorhabditis elegans²², в то время как другие исследования образ Организации белков на поверхности ткани/органа, например Актин изображений в корковых нейронов через череп живут мыши²¹. В некоторых случаях обезболивающих средств были использованы для держать животное неподвижной; Однако конкретные анестетиков может отрицательно повлиять на протеина интереса. Альтернативные средства, чтобы сохранить животных неподвижной во время визуализации в естественных условиях следует изучить таким образом свести к минимуму ошибки.

Еще один нюанс суперразрешением изображений, в естественных условиях , что лазеры, используемые для освещения протеинов интереса может отрицательно сказаться на окружающие ткани, и таким образом сохраняя интенсивность возбуждения как можно ниже рекомендуется. Освещение окружающие ткани лазером также имеет тенденцию к увеличению фонового сигнала. Использование низких возбуждения интенсивности помогает снизить фон, оговоркой, что это также может привести к снижению урожайности Фотон флуоресцентный белок. Вычитание фона во время анализа могут использоваться как альтернативное средство для снижения фонового сигнала до анализа изображений.

Дрозофилы представляет идеальный организм для в vivo изображений как он обеспечивает налаженные генетических инструменты для расследования конкретных белков функции. Вверх по течению активации последовательности (УАС)-система Gal4 позволяет временных и пространственных экспрессию белков и поэтому может использоваться для манипулирования синапсах²³, что термо генетические стимуляции с помощью дрозофилы переходных рецептор потенциальных суб семья А1 (dTRPA1)²⁴ или опто генетические стимуляции с помощью смещается far красных CsChrimson²⁵ может сочетаться с изображений¹⁴. Мы преодолеть многие из осложнений выполнения в vivo сингл молекула изображений в этой системе и теперь описать как сингл частица отслеживание может осуществляться в Drosophila melanogaster третьего возраста личинок.

1. дизайн трансгенных дрозофилы выражения с меткой mEos2 белков

1. Выберите белка, чтобы быть помечены с белком mEos2. Чтобы увеличить скорость обработки изображений успеха, выберите белки с доменом трансмембранного в нейрональных плазматической мембраны¹⁴ (например, Синтаксин 1A), белки на синаптических пузырьков или autophagosomes^26,27 (например, Synaptobrevin-2), или цитозольной белки с тесное взаимодействие с белками плазмы мембране нейронов (например, Munc18-1).
2. Постройте трансгенов, шифруя протеин тегами mEos2 (рис. 1). Дизайн прямого и обратного Праймеры для белков и mEos2.
   Примечание: MEos2 кодирующая последовательность может быть усилена с pmEos2-N1 плазмида, который предназначен для предохранителя для C-конечная протеина интереса. Клонирование например могут быть выполнены путем рекомбинации в естественных условиях в Saccharomyces cerevisiae с помощью pFL44S-attB-MCS-w + вектор^14,28, попеременно могут использоваться другие методы клонирования как Гибсон Ассамблея протокол²⁹.
   1. Линеаризации вектор с BamHI и XbaI и совместно превратить в ura3 - дрожжевых клеток вместе с ПЦР фрагментов кодировки mEos2 и протеина интереса. Придать дрозофилы эмбрионов с помощью конструкции для создания трансгенных летать линии³⁰.
3. Задние трансгенных культур летать на стандартных дрожжей и мелассы среднего или некоторые другие подходящую замену, содержащихся в пластиковых флаконах. Для обеспечения здоровой и довольно большой синаптической boutons³¹, избежать переполненности мух в ампул и флип мух для новых флаконах после каждого дня откладки; Это гарантирует третьего возраста личинок кормят хорошо и достичь надлежащего размера к времени, когда они начнутся, блуждающих на носителе. Поднимите трансгенных летать при комнатной температуре (25 ° C).
   Примечание: Большие синаптической boutons, как правило, дают большее количество белков, визуализируется во время визуализации.

2. рассечение третьего Instar личинка

1. Сделайте цилиндрическую или semicylindrical формы полидиметилсилоксан (PDMS) базовый ≤20 мм в диаметре и ≤20 мм в высоту, с помощью соответствующего силиконовые эластомера kit (рисунок 2A). Mix силиконового эластомера с силиконовой отвердителя в соотношении 10:1.
   1. Перемешайте смесь тщательно для 5 минут залить смесь в форму с dimsensions, перечисленных выше. Пусть это затвердевают в духовке при 100 ° C на 45 мин. PDMS база будет служить основой для проведения вскрытия. Обеспечения, база PDMS вписывается в хорошо прозрачным дном культуры блюдо.
2. Выберите блуждающих третьего instar личинка стенке флакона. Используйте оптический стерео Микроскоп на 4,5 увеличение визуализировать личинка, размещены на базе PDMS цилиндрические с спинной стороне вверх.
3. Использование изогнутые и угловые пинцет придерживаться minutien штыри на голове над рот крючки, между ними передней дыхальца, расширяя и на хвосте через анус, между двумя задние дыхальца. 40 мкл Шнейдера насекомых среднего, при комнатной температуре на иммобилизованных личинка.
   Примечание: Hemolyph как решения (HL3 или HL6) может также использоваться вместо Шнейдера решения^32,33.
4. Предоставлять доступ через спинной стороне брюшной стенки тела личинки, использование ПИН-кода minutien для надрезать в средней линии стены.
5. Использование весной ножницы, чтобы вырезать стенки тела открыть от точки разреза. Разрежьте вдоль средней линии в направлении передней задней³⁴.
6. Использование тонкой щипцами и пружинные ножницы для потрошить личинка: удаление внутренних органов, включая слюнных желез, трахею и кишечнике. Вымойте личинка дважды с Шнейдера насекомых средой.
7. С тонкой щипцами удерживайте две стенки тела закрылки, мягко растянуть их вне и придерживаться двух minutien контактов на каждой стороне. Это следует производить с шестигранной формы подготовки (рисунок 2A).
8. Отсоединить мозг от воспалении брюшины шнур, с помощью ножниц весной для уменьшения возможности движения мышц во время визуализации; Это также служит для проведения подготовки плоский против изображений блюдо. Для проталкивания все шесть minutien контакты в базу PDMS используйте Изогнутый пинцет.
   Примечание: Только небольшую часть контакты должны быть внедрены в брюшной стенки.
9. Чтобы подтвердить, что личинка пережил процедуру диссекции, слегка совать шнур воспалении брюшины, это должно выявить перистальтического сокращения личинка брюшной стенки.

3. слегка косо освещения сингл частица отслеживания микроскопия

1. Инвертируйте базу расчлененных личинка PDMS на прозрачным дном культуры блюдо. Заполните изображений блюдо с 2 мл комнатной температуре Шнайдер насекомых среды (рис. 2B).
2. Найдите двигательных нейронов в втором и третьем сегментах с синапсов на мышцы живота, 6 и 7³⁵ с помощью 63 x / 1,2 Цель NA погружения в воду на микроскопе флуоресцирования (TIRF) флуоресцентных полного внутреннего отражения.
3. Используйте окуляры микроскопа для поиска расчлененных личинка; Определите мышцы 6 с использованием яркой области освещения.
4. Использовать программное обеспечение приобретение микроскопа (см. Таблицу материалы), TIRF конфигурации; слайд угол камеры коллиматор 1 ° для увеличения глубины проникновения, в противном случае выйти из TIRF критический угол для достижения наклонный освещения.
5. Включите 488 нм лазер для визуализации mEos2 зеленым цветом. Используйте мощность лазера низкой (менее 5% 22,8 МВт) во избежание обесцвечивания зеленой флуоресценцией. Найдите нервно узлов (которые выглядят как бусы на строку) и приобрести TIRF изображение с низким разрешением.
6. Одновременно включается 405 нм лазер (photoconverts mEos2 от зеленого до Красного видов) и 561 Нм лазер (изображение photoconverted красный mEos2) ковшах локализовать одного mEos2 флуоресцентных белков.
   Примечание: Рекомендуется использование маломощных 405 нм лазер (0,005 до 0,9% 4,78 МВт) как это позволяет для скорости относительно постоянной photoconversion во время приобретения фильма. Между 50 и 75% 561 Нм лазер (20,1 МВт), как это достаточно приобрести флуоресценции Красного mEos2 видов без ущерба морфология вокруг перекрестка нервно-мышечной ткани.
7. Для каждой цепи нервно-Джанкшн приобрести время серии, состоящий из 15 000 кадров или более 33 Гц. as.czi формат сохранения для сохранения сопутствующих мета данные для возможного использования.
8. Используйте ImageJ с конвертировать файлы фильмов «.czi» в «TIFF»-файлов.
9. Анализировать приобретенные фильмы с подходящим сингл молекула отслеживания аналитического программного обеспечения^11,,1436 таких TrackMate на Фиджи/ImageJ³⁷ (см. Таблицу материалы). Находит «x» и «y» координаты каждой локализации по Гауссу fit интенсивность точки распространения функция (PSF).
   Примечание: Устранение неполадок: Если зеленая Флуоресценция не наблюдается или слишком тусклый, на перекрестке нервно под воздействием 488 нм лазер, кратко перейти на photoconverting и визуализации лазеры (405 нм и 561 Нм), как это помогает производить больше Красного видов mEos2. Затем переключитесь обратно на 488 нм лазер и взять образ TIRF.

4. single молекула локализации в фиксированных личинки

1. Измерить размер нанокластерных белка через ладонь, замените Шнайдер насекомых среднего после вскрытия с фиксатором - параформальдегида 4% разбавленный-фосфатный буфер (PBS).
2. Инкубируйте личинка на 30 минут при комнатной температуре.
3. Удаление рассечение булавки и фиксированной личинка в 1,7 мл Снимите пробки microcentrifuge оснастки lock.
4. Вскрыть и исправить, как многие другие личинки по мере необходимости, затем вымыть их три раза с PBS.
5. Замените блок буфера (раствор PBS, 0,1% тритон X-100 и 3% нормальной козьего сыворотки) PBS.
6. Вымойте личинки с PBS три раза, а затем инкубации с необходимыми основное антитело (разбавленный раствор буфера блока).
7. Инкубируйте на ночь на 4 ^oC.
8. Вымойте личинки три раза с PBS, затем инкубации с необходимыми вторичное антитело (разбавленный раствор буфера блока).
9. Вымойте личинки три раза с PBS, приложите личинка обратно на PDMS базы и изображения, как описано для отслеживания одной молекулы.

Используя протокол, перечисленных выше, Синтаксин 1A-mEos2 трансгенных Drosophilamelanogaster были созданы (рис. 1). Трансгенные третий Инстар дрозофилы личинки были расчленены на базе PDMS цилиндрические (рисунок 2A-F). Чтобы визуализировать одной молекулы Синтаксин-1а, мы использовали PALM на TIRF микроскопа с слегка косо лазерной подсветки14.

Одной молекулы Синтаксин 1A были отслежены на терминалах Пресинаптический двигательного нерва на мышцу 6 второй брюшной сегмент. Зеленая Флуоресценция mEos2 могут быть обнаружены как показано с низким разрешением изображения Синтаксин 1A-mEos2 на boutons тип 1b при возбуждении, используя 488 нм лазер (рис. 3A). В тепловизионных экспериментах, 405 нм и 561 Нм возбуждения лазерной обработки изображений глубины были 133,5 Нм и 165.6 Нм, соответственно. Зеленый образ был приобретен как в среднем 16 отдельных кадров. Этот зеленый образ был использован для создания области интереса, используемых для ограничения анализа локализаций в фильме photoconverted на пресинаптическом двигательного нерва клеммы только.

Анализ приобретенного photoconverted sptPALM фильмы создаются супер решена интенсивности, коэффициент диффузии, и траектории карты (рис. 3A). Синтаксин 1A-mEos2 мобильности был далее количественно методом анализа среднеквадратичной перемещения (MSD) индивидуальных траекторий (рис. 3B). Статистические сравнения может быть сделано с помощью площадь под кривой MSD (рис. 3B). Дальнейший анализ мобильности дает распределение коэффициента диффузии Синтаксин 1A-mEos2, и это статистически оцениваться путем сравнения мобильных неподвижной населению (рис. 3 c).

Рисунок 1 : Создание mEos2-тегами конструкций. PFL44S-attB-MCS-w + вектор линеаризованных с BamHI и XbaI. Перекрывающиеся полимеразной цепной реакции (ПЦР) фрагменты, шифруя протеин интереса (POI) и mEos2, соответственно, можно клонировать, например, в естественных условиях рекомбинации в ura3 - дрожжевых клеток или Ассамблеей Гибсон. Обратите внимание, что для создания Синтаксин 1A-mEos2 трансген, мы клонирован конструкции, обрамленная эндогенного Синтаксин 1A промоутер и Терминатор последовательности. Результирующая структура впоследствии могут быть введены в дрозофилы эмбрионов для создания трансгенных летать линии выражения протеина интереса (POI) сливается с mEos2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Дрозофила личинка диссекции и косые освещения. (A) схема дрозофилы личинка рассечение осуществляется на базе полуцилиндрические PDMS. Larva филе был проведен на PDMS гель с использованием minutien штыри. (B-C) Личинка PDMS prep был помещен внутри прозрачным дном культуры блюдо, содержащие Шнейдера насекомых среднего. Микроскопом TIRF в конфигурации слегка косо освещения была использована для визуализации Синтаксин 1A-mEos2 в терминалах двигательного нерва. (D-F) Полуцилиндрические PDMS база с расчлененных дрозофилы личинки. Личинка PDMS подготовки был помещен в визуализации блюдо, наполненный Шнейдера среднего, и личинки было imaged на микроскопе PALM суперразрешением. Линейки, 10 мм., (эта цифра была изменена с14). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 : В естественных условиях Отслеживание Синтаксин 1A-mEos2 на пресинаптическом двигательного нерва терминала. (A) A разрешением TIRF изображение Синтаксин 1A-mEos2 на тип 1b двигательного нерва терминала. Анализ photoconversion фильмов образы на 33 Гц генерируется sptPALM супер-решена интенсивности, коэффициент диффузии и траектории карты. 5,309 индивидуальных траекторий были фотосъемка приобретения более 16 000 кадров фильма. Линейки, 3 мкм. (B-C) Среднеквадратическая перемещения (MSD) Синтаксин 1A-mEos2 был заговор от 6 различных двигательного нерва терминалы; Площадь под кривой (AUC) MSD был использован для количественного определения уровня мобильности. Распределения коэффициента диффузии показывает мобильных и неподвижным Синтаксин 1A населения, которые могут быть количественно как коэффициенты друг от друга; в среднем ~ 2400 траекторий были получены за двигательного нерва терминала (n = 3 личинок). Данные представлены как средние Среднеквадратичная ошибка среднего. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Авторы не имеют ничего сообщать.