Цель настоящего Протокола заключается в создании ex vivo дрозофилы личиночной мозга культуры оптимизированы для мониторинга суточного молекулярной ритмы с долгосрочным флуоресценции покадровой изображений. Также обсуждается применение этого метода для фармакологических проб.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Одноклеточных резолюции флуоресценции живут изображений дрозофилы суточного часов в культуре личиночной мозга
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Контуре суточного кардиостимулятор оркеструет художественной поведенческие и физиологические выходы, координироваться с экологическими подсказки, например циклов день/ночь. Молекулярные часы, в течение каждого нейрона кардиостимулятор генерирует циркадные ритмы в экспрессии генов, которые лежат в основе художественной нейрональных функций, необходимых для функционирования схемы. Исследование свойств индивидуальных молекулярных осцилляторов в различные подклассы кардиостимулятор нейронов и их взаимодействие с нейронов сигнализации дает, лучшего понимания контуре суточного кардиостимулятора. Здесь мы представляем покадровой флуоресцентной микроскопии подход, разработанный для мониторинга молекулярных заводной будильник нейронов культивировали дрозофилы личиночной мозга. Этот метод позволяет записывать многодневные ритмов генетически закодированный флуоресцентные суточного Репортеры разрешением одной ячейки. Эта установка может сочетаться с фармакологическими манипуляции внимательно анализировать реального времени отклика молекулярных часов для различных соединений. За пределами циркадные ритмы этот универсальный метод в сочетании с мощным дрозофилы генетических методов дает возможность для изучения различных нейронов или молекулярных процессов в живой мозговой ткани.
Введение
Суточный часы помогают организмов приспособиться к периодических изменений в окружающей среде, порожденных 24 h вращения Земли. Блокируемые transcriptional поступательные обратной часто лежат в основе молекулярного механизма суточного часы различных видов1. Контуре суточного кардиостимулятор состоит из будильник содержащих нейронов интегрирует время день информацию, передаваемую по экологической подсказки, например Светлый/темный (LD) и температурных циклов, чтобы организовать ритмы множество ежедневных физиологические и поведенческих процессов2,3. Координация молекулярных ритмов с нейр....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. подготовка запасов решений под капотом культуры
- Подготовка 400 мл 1 x Шнайдер активной среды (SAM) оптимизирован для ex vivo культуры личиночной мозги (с изменениями от24,ссылку25) (Таблица 1). Алиготе до 5 мл и flash замораживание в жидком азоте (2л), хранить в - 80 ° C.
- Подготовка 1 x Dissecting солевой раствор (DSS) путем разбавления 10 x Стоковый раствор (изменение ссылки26) (Таблица 2).
- Аликвота фибриноген 10 мг и хранить при 4 ° C для одноразового использования.
Предупреждение: Весят фибриног....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Здесь мы показываем представитель результаты длительной записи суточного флуоресцентные репортер в ex vivo личиночной мозга культуры и живой визуализации результатов применения PDF Ванна репортер выражения.
Non Блуждающие L3 личинки, выражая молекулярные часы репортер %-TDT и бла mCD8::YFP driven часы нейрон водитель, Clk (856)-gal4 (рис. 1 c) были увлекаемого LD. мозги были расчле.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы описал метод для долгосрочного покадровой микроскопии флуоресцирования культивировали личиночной мозги. Успех такого рода экспериментов зависит от нескольких факторов, например, здравоохранения, культуры, метод для иммобилизации экспланта мозга, интенсивности флуоресценции и соотношение сигнал шум репортер, временного и пространственного разрешения, и доступность для экспланта. Эти факторы могут быть взаимоисключающими. Например покадровой чаще влияет на здоровье культуры, и иммобилизации экспланта мозга может п.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Мы благодарим Майкла Rosbash за его наставничества и поддержки на начальном этапе разработки этого метода. Эта работа финансировалась программой JST PRESTO, Швейцарский Национальный научный фонд (31003A_149893 и 31003A_169548), Совет Европы исследований (ERC-StG-311194), фонд Новартис лечебно-биомедицинских исследований (13A39) и Женевского университета .
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | Я не уверен, что это точно те же самые те, которые у нас есть в лаборатории. Я выбрал "подходит для культивирования клеток насекомых", когда это было доступно |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| D-(+) Глюкоза | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Экстракт дрожжей | Sigma-Aldrich | Y1000 | |
| Инсулин | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| Пенициллин-стрептомицин | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| BIS-TRIS | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| L-(−)-Яблочная кислота | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| D-(+)-Дигидрат трегалозы | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Янтарная кислота | Sigma-Aldrich | S9512 | |
| Фумаровая кислота | Sigma-Aldrich | F8509 | |
| α-Кетоглутаровая кислота | Sigma-Aldrich | K1128 | |
| Неинактивированная, эмбриональная сыворотка теленка (FCS) Скрининг на микоплазмы и вирусы | BioConcept Ltd. Amimed | 2-01F30-I | |
| HEPES-KOH, pH 7,4 | E& K Scientific Products | EK-654011 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| 2PO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| Сахароза | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Фибриноген из плазмы крупного рогатого скота | Calbiochem (Merck) | 341573-1GM | ВНИМАНИЕ: Вреден при вдыхании, при контакте с кожей и при проглатывании. Манипуляция под ламинарным потоком |
| Тромбин из бычьей плазмы | Sigma-Aldrich | T9549 | ВНИМАНИЕ: Опасность для здоровья, используйте перчатки |
| PDF, NH2-NSELINSLLPKNMNDA-OH | Chi Scientific | custom made | |
| Vaccum grease | Sigma-Aldrich | 18405 | |
| 35 мм Тарелка, No 1.5 Покровное стекло, диаметр стекла 20 мм, | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Corning Falcon Easy-Grip Тарелка для культуры тканей | fisherscientific | 08-772A | |
| Стерильная 500 мл Steritop-GP 33 мм резьбовой фильтр для бутылки, 0,22 μ m | Миллипоровая | SCGPS05RE | |
| политетрафторэтиленовая (ПТФЭ) пленка | Dupont | 200A Тефлоновая пленка | |
| Millex-HV Шприцевой фильтрующий блок, 0,45 &микро; м, ПВДФ, 33 мм, гамма-стерилизованный | Millipore | SLHV033RS | |
| Millex-GV Шприцевой фильтрующий блок, 0,22 &микро; м, ПВДФ, 33 мм, гамма стерилизованный | Millipore | SLGV033RS | |
| Трехлуночный стеклянный диск для препарирования | Любая компания | ||
| Тонкие щипцы, размер 5, Dumont | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Тандемный сканер инвертированный конфокальный микроскоп TCS SP5, с резонансным сканером и фотоумножителем HyD детекторы | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| Камера контроля температуры | Услуги по визуализации жизни | CUBE & Система контроля температуры BOX, специально разработанный | |
| Stage-top регулятор влажности | Life Imaging Services | на заказ | |
| Погружной микродиспенсер для воды: диспенсер, расширенный микронасос серии MP6 и программное обеспечение контроллера автоиммерсионного объектива | Leica микросистема CMS GmbH | ||
| Создание SUM-стека и 3D-коррекция дрейфа плагин | ImageJ программное обеспечение | ||
| 10x итеративная деконволюция | AutoQuant и программное обеспечение |
Ссылки
- Sheeba, V., Kaneko, M., Sharma, V. K., Holmes, T. C. The Drosophila circadian pacemaker circuit: Pas De Deux or Tarantella? Crit Rev Biochem Mol Biol. 43 (1), 37-61 (2008).
- Granados-Fuentes, D., Herzog, E. D. The clock shop: coupled circadian oscillators. Exp Neurol.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
