Методическая статья

Иммунопреципитация родной Chromatin, с использованием Neurospheres опухоли мозга мышиных

DOI:

10.3791/57016

⸱

29 января 2018 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan Medical School, 2Department of Neurosurgery, University of Michigan Medical School, 3Cancer Research Summer Internship Program (CARSIP), Cancer Biology Program, University of Michigan Medical School, 4Department of Biology, University of Puerto Rico-Río Piedras Campus

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эпигенетические механизмы часто изменяются в глиомы. Иммунопреципитации Chromatin может использоваться для изучения последствий генетических изменений в глиомы, которые в результате изменения гистона модификации, которые регулируют хроматина структуры и Джин транскрипции. Этот протокол описывает родной хроматина иммунопреципитации мышиных мозга опухоль neurospheres.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эпигенетические изменения могут быть вовлечены в развитии и прогрессировании глиомы. Изменения в метилирования и ацетилирование промоутеров и регулирования регионов онкогенов и супрессоров опухолевого роста может привести к изменения в экспрессии генов и играют важную роль в патогенезе опухолей головного мозга. Иммунопреципитации родной chromatin (обломока) является популярный метод, который позволяет обнаруживать изменения или другие белки, тесно привязанный к ДНК. В отличие от сшитого чип, в родной чип клетки не обрабатываются с формальдегидом для ковалентно связывать белок с ДНК. Это выгодно, потому что иногда сшивки может исправить белки, которые только временно взаимодействуют с ДНК и не иметь функциональное значение в регуляции генов. Кроме того антитела обычно поднимаются против нефиксированных пептиды. Таким образом специфичность антитела увеличивается в родной чип. Однако важно иметь в виду, что родной чип применима только для изучения гистонами или других белков, которые плотно связывать ДНК. Этот протокол описывает родной хроматина иммунопреципитации мышиных мозга опухоль neurospheres.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эпигеномные события являются частыми в глиомы и вероятно играть важную роль в патогенезе опухоли. Действительно в педиатрических полноценного глиомы, мутации генов, кодирующих гистона варианты H3.3 и H3.1 часто происходят1. Мутации влияют изменения гистона и имеют крупные эпигенетические последствия2,3. В подростка взрослый спектра рецидивирующий мутации гена isocitrate дегидрогеназа в 1/2 (IDH1/2), мутации, которая тормозит α-кг зависимых гистона и ДНК-де methylasaes и генетические изменения в другие регуляторы хроматина, как ATRX и DAXX происходят 4. Таким образом, оно имеет решающее значение для изучения, как мутации, которые влияют на эпигеномный регуляторы изменить структуру хроматина и регулирования гистона модификации, которые, в свою очередь, имеют сильное влияние опухолевых клеток транскриптом.

Иммунопреципитации Chromatin (обломока) является мощным инструментом, используемым для оценки влияния эпигеномные изменения в геноме5,6,7. В родной чип хроматина переваривается с Микрококковая Нуклеаза (MNase), immunoprecipitated, с использованием антител против протеина интереса, и затем ДНК очищается от immunoprecipitated хроматина комплекс6. Клетки не устанавливается во время процедуры, поэтому этот метод применим только для изучения белков, которые тесно взаимодействуют с ДНК6. Отсутствие cross-linking СПИДа специфичность антитела, так как антитела обычно поднимаются против нефиксированных пептидов и белков7. Кроме того так как нет никаких сшивки шаг, это уменьшает шансы установления переходных протеин дна взаимодействий, которые являются неспецифическими и не регулирования в7,8. Чип может использоваться для идентификации обогащения изменения гистона в определенном регионе геномной. Здесь мы подробно протокол для выполнения родной чип в neurospheres (NS) генерируется из генетически инженерии мыши модели глиомы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из университета штата Мичиган.

1. поколение опухоли мозга НС и культивирования условий.

  1. Подготовьте среднего нервных стволовых клеток (НСК) с Дульбекко изменение Eagle среднего/F12B27 дополнение (1 x), N2 дополнение (1 x) и противомикробные реагента. Дополнение НСК среднего в день использования с человеческого рекомбинантного эндотелиальный фактор роста (EGF) и basic фибробластический фактор роста (ФБП) в конечной концентрации 20 нг/мл каждый.
  2. Вызвать опухоль мозга мыши, используя Спящая красавица transposon системы, в которой вводится плазмид кодирования онкогенов или индуцируемый ориентации супрессоров в боковых желудочков новорожденных для создания спонтанной мозга опухоли9. Выберите мышь с большой опухоли, что подтверждается с работой с биолюминесценции образами.
    Примечание: Можно найти более подробную информацию о конструкции Спящая красоты Transposon системы и плазмиды, используемые в Кэлинеску и др. 9.
    1. Чтобы изображение мышей, придать 100 мкл раствора люциферин 30 мг/мл, внутрибрюшинно с помощью 26 иглы.
    2. 5 мин после инъекции люциферин, анестезировать животное, используя камеру анестезии с потока кислорода/изофлюрановая равным 2% изофлюрановая.
    3. Когда животные находятся под наркозом (обычно 2-3 мин), место животных в зале биолюминесценции с кислородом изофлюрановая равным 2% изофлюрановая. Если животные будет под наркозом дольше 5 минут, используйте глазная мазь для предотвращения сухости во время под наркозом.
    4. Изображение мышей, с использованием в vivo оптических изображений системы со следующими параметрами: автоматической экспозиции, большой биннинга и диафрагмы f = 1. Значение параметра считать большой опухоли — биолюминесценции > 10 /sr6 фотоны/s/см2.
  3. Усыпить мышь с передозировкой изофлюрановая ингаляционного анестетика в закрытой камере, проверьте, щепотка мыс, что животное наркозом и обезглавить мыши.
  4. Экстракт мозга и вскрыть его, как описано ранее в Кэлинеску и др. 9.
  5. Место мозга в 10 см Петри. Если опухоли индуцированные выражает флуоресцентный белок, использовать люминесцентные, рассекает микроскопом набор соответствующий канал флуоресцентные и 0,3 X увеличение, иначе определить массу опухоли на различия в ткани цвета и текстуры. Используйте скальпель и щипцы для разделения опухолевой ткани от нормального мозга.
  6. Фарш опухоли на мелкие кусочки в чашке Петри. Место расчлененных опухоли в 1,5 мл трубку с 300 мкл НСК среды.
  7. Используйте одноразовые пластиковые гранулы пестик, который подходит к стенкам трубки конические microcentrifuge нежно гомогенизировать опухоли. Добавьте 1 mL клеток отряд среды и Проинкубируйте образцы для 5 минут при 37 ° C.
    Примечание: Использование пестиком могут убить некоторых клеток. Если читатель хочет максимизировать жизнеспособность клеток, использование пестиком может быть пропущена.
  8. Передайте суспензию клеток от шаге 1.7 через стрейнер ячейки 70 мкм и мыть сито с 25 мл среды НСК.
  9. Центрифуга для подвески на 300 g x 5 мин при комнатной температуре, сцеживаться супернатант и вновь приостановить гранулы в 6 мл среды НБК.
  10. Пластина суспензию клеток опухоли из шага 1.9 в T-25 колбу культуры и культуры при 37 ° C в инкубатор культуры ткани с атмосферой 95% воздуха и 5% CO2. Обычно после 3 дней будет смесь некоторых мертвых клеток, придерживался клеток и некоторых клеток, образующих NS, которые плавают в среде.
  11. Передача в коническую пробирку 15 мл суспензии клеток, собирать только те ячейки, которые опускаться на дно с помощью микропипеткой и повторно пластины их на колбе культуры ткани T-75.
  12. Сохранить клетки на относительно высокой плотности (1-3 Х 106 клеток в T-25). Проход клеток, когда они вырожденная.
    Примечание: Confluency определяется размер сферы. Черный центров больших сферах означает что есть мертвых клеток в центре и указывают, что клетки должны быть пассированной немедленно.
  13. Добавьте факторы роста (EGF и basic ФБП; 20 нг/мл) каждые три дня. Изменение среднего когда клетки не притока и средних поворотов оранжевый свет.
  14. Чтобы изменить носитель, собирать старые среднего и центрифуги на 300 x g при комнатной температуре в течение 5 минут и вновь приостановить Пелле клеток в среде НБК, дополненная EGF и ФБП в концентрации, указанные в шаге 1.1.
    Примечание: Если сферы находятся в середине-высокой confluency, но не готовы быть пассированной (сфера размер мал с диаметром < 100 мкм), то гранулы могут быть разделены на две фляги.
  15. Для прохода клетки, центрифуга клетки на 300 g x 5 мин при комнатной температуре, декантируют супернатант и инкубации клеток в среде отряд ячейки для 5 минут при 37 ° C.
    1. Добавьте 5 мл сбалансированного солевого раствора разбавить отряд среднего и центрифуги на 300 g x 5 мин при комнатной температуре.
    2. Декант супернатанта, Ресуспензируйте Пелле клеток в 18 мл среды НСК и поровну разделить подвеска три колбы T-25.
  16. Чтобы заморозить аликвоты клеток, разбить ячейки как шаг 1.15 и заморозить клеток в 1 мл аликвоты плода бычьим сывороточным 90% с 10% диметилсульфоксида. Медленно остыть клетки, поместив клетки на льду за 10 мин, затем клеток-20 ° C на 30 мин и -80 ° C за 1 день. Следующий день, передачи клетки в контейнер для хранения жидкого азота.

2. родной чип

  1. Подготовка хроматину
    1. После внесения запас производных NS, культура NS в T-75 в 15 мл среды НСК при 37 ° C в инкубатор культуры ткани с атмосферой воздуха 95% и 5% CO2 до тех пор, пока NS стать вырожденная. Одна пластина вырожденная T-75 принесут 3-5 Х 106 клеток.
    2. Когда клетки становятся вырожденная, центрифуга NS на 300 g x 5 мин, декантируют супернатант и добавьте 1 mL среды диссоциации клеток. Инкубировать клетки при 37 ° C за 5 минут добавить 5 мл среды и подсчитать количество ячеек с помощью Горяева10.
      Примечание: 1 x 106 клеток необходимы в иммунопреципитации (IP) реакции. Обратите внимание, что предварительно иммунной сыворотки или IgG управления также должны быть включены11.
    3. Центрифуга NS в одной из труб microcentrifuge 1,5 мл на 300 x g 5 мин, сцеживаться супернатант и вновь приостановить NS лепешка с 1 мл раствора сбалансированного солевого раствора и передать низкопротеиновое привязки 1.5 мл пробирок microcentrifuge подвеска.
    4. Центрифуга NS на 300 x g 5 мин, декантируют супернатант и вновь приостановить Пелле клеток в 95 мкл буфера пищеварения (50 мм трис-HCl, рН 8,0, 1 мм2CaCl, 0,2% полиэтиленгликоль octylphenyl эфира) за 1 х 106 клеток дополнена протеазы ингибитор коктейль в высокой концентрации (1: 100). Сразу же накапайте клетки вверх и вниз для предотвращения слипания и избегать создания любые пузыри.
    5. Ресуспензируйте MNase в 50% глицерина сделать решение 1 мг/мл (1,15 единиц/мкл, хранятся при температуре-20 ° C), которое будет называться как «1 x» запас. Сделать «0.1 x» складе, делая второй разбавления 1:9 с 50% глицерина (например., 900 мкл «1 x» MNase и 100 мкл 50% глицерина) и хранить его при-20 ° C.
    6. Смешайте 5 мкл «0.1 x» MNase и 145 мкл буфера пищеварения. Держите фермента на льду все времена. 5 мкл разбавленного MNase, в буфере пищеварение за 1 х 106 клеток. Флик трубки смешивать и поместить трубку в блоке 37 ° C для ровно 12 мин процесс образцы один одновременно для обеспечения точной инкубации время 12 мин.
    7. 10 мкл 10 x MNase остановить буфера (110 мм трис-HCl, рН 8,0, ЭДТА 55 мм) за 1 х 106 клеток. Образцы должны храниться на льду с этого момента.
    8. Мкл 110 «2 x RIPA буфер» (280 мм NaCl, octylphenyl эфиром полиэтиленгликоля 1,8%, 0,2% лаурилсульфат натрия (SDS), 0,2% Na Дезоксихолат, 5 мм этиленгликоля bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-tetraacetic кислота (EGTA); хранить при 4 ° C) дополнена Ингибитор протеазы коктейль при высокой концентрации (1: 100) за 1 х 106 клеток. Флик трубки смешивать.
    9. Центрифуга для трубы 15 мин в отцентрифугировать на 4 ° C и 1700 x g. супернатант передать новые регулярные 1,5 мл microcentrifuge трубы (низкопротеиновое привязки microcentrifuge трубы больше не нужны) и хранить их на льду. Выбросите гранулы.
  2. Иммунопреципитация (IP)
    1. Смешайте белок и белок G магнитные бусы в соотношении 1:1. Для каждого IP-адреса готовить 25 мкл бисера.
    2. Вымойте бисер, добавив 1 мл Буфер RIPA (10 мм трис рН 8,0, 1 мм ЭДТА, 140 NaCl, 1% полиэтиленгликоль octylphenyl эфира, 0.1% SDS, 0.1% Na Дезоксихолат; хранить при 4 ° C) дополняют ингибиторы протеазы в низкой концентрации (1: 1000).
    3. Используйте магнит, чтобы позволить бусы отделяться от моющего раствора и декантировать моющий раствор (примерно 1 мин). Выполните шаг мыть дважды.
    4. Вновь приостановите бусы для исходного тома, используя буфер RIPA, дополняют ингибиторы протеазы (1: 1000).
    5. При необходимости, разбавляют хроматина, используя буфер RIPA, дополняют ингибиторы протеазы (1: 1000), так что каждый IP имеет объем 100-200 мкл. зарезервировать 10% от объема используется для ввода одного IP хроматина.
      Примечание: К примеру, если на IP используются 200 мкл, 20 мкл разбавленного хроматина должны быть зарезервированы для ввода. Для в общей сложности четыре IPs объем всего хроматина должны быть ослаблены 820 мкл.
    6. Подготовьте входные данные. Добавьте 100 мкл буфера TE (10 мм трис-HCl рН 8,0, ЭДТА 1 мм) дополнены протеиназы K (0.5 мг/мл) на вход и инкубировать входных данных при температуре 55 ° C за 1 ч.
      Примечание: Шаги 2.2.6-2.2.7 могут выполняться наряду с шаги 2.3.4 и 2.4.1.
    7. Очистить входные данные с помощью ПЦР очистки комплект инструкций изготовителя и элюировать в 50 мкл буфера комплекта.
    8. Измерить концентрацию ввода, с помощью microvolume спектрофотометром и записывать результаты в записной книжке. Пустой с Элюирующий буфер из комплекта.
      Примечание: В neurospheres мыши, мы использовали примерно 6 мкг ДНК для каждого IP-адреса.
    9. Запуск ввода на гель 1% или загрузить 1 мкл на Bioanalyzer ДНК, с использованием стандартных параметров. Храните остаток для использования в качестве входных данных в нисходящие приложения.
    10. Добавить 10 мкл промывают белка A & G магнитные бусы для каждого IP-адреса и IP инкубировать 1 час при 4 ° C.
      Примечание: К примеру, добавьте 30 мкл белка A & G магнитные бусы для трех IPs.
    11. Поместите образцы на магнит и позволить бусы для разделения. Разделите хроматина, ранее определяется сумма перевода в новый 1,5 мл трубку.
    12. Добавьте антитела и заверните колпачки пластиковые парафин пленкой во избежание испарения. Проинкубируйте образцы на ночь при 4 ° C с вращением на 20 об/мин.
      Примечание: Концентрация должна определяться эмпирически рекомендациям производителя.
    13. Следующий день, спин трубы с помощью мини-центрифуга при комнатной температуре, 2000 x g, 10 s. Затем 10 мкл бусы для каждого IP-адреса и IP Инкубируйте 3 ч при температуре 4 ° C с вращением на 20 об/мин.
  3. IP моет и переваривания белка
    1. 150 мкл Буфер RIPA, дополняют ингибиторы протеазы в низкой концентрации (1: 1000) для каждого IP-адреса и Инкубируйте IP на 4 ° C с вращением на 20 об/мин за 5 минут место образца на магнитную подставку и магнитные бусы для разделения. Чтобы удалить супернатант используйте пипетки. Повторите это пять моет ТЭП.
    2. Добавить 150 мкл буфера LiCl (250 мм LiCl, 10 мм трис рН 8,0, 1 мм ЭДТА, 0,5% NP-40, 0,5% Na Дезоксихолат; хранить при 4 ° C) дополняют ингибиторы протеазы в низкой концентрации (1: 1000) для каждого IP-адреса и Инкубируйте IP на 4 ° C с вращением на 20 об/мин за 5 минут место образца на магнитные стоять и позволяют магнитные бусы для разделения. Чтобы удалить супернатант используйте пипетки.
    3. 150 мкл холодной TE (не ингибиторы протеазы) и инкубации образца при температуре 4 ° C с вращением на 20 об/мин за 5 минут место образца на магнитную подставку и магнитные бусы для разделения. Чтобы удалить супернатант используйте пипетки.
    4. После окончательной стирки шага, вновь приостановить образца в 100 мкл буфера TE дополнена протеиназы K (0.5 мг/мл) и инкубации образца при температуре 55 ° C за 1 ч.
  4. Очистка ДНК и чип количественного PCR реального времени (ПЦР)
    1. Очищайте immunoprecipitated ДНК, используя комплект для очистки ПЦР. После добавления ДНК привязки буфера из комплекта для каждого образца Поместите трубку на магнит и ждать, пока магнитные бусы щебня, затем передать супернатант в столбце очистки. Следуйте инструкциям производителя и элюировать в 50 мкл буфера комплекта.
    2. Чтобы проверить, если IP является успешным, выполните ПЦР. В идеале грунтовки должны быть разработаны для регионов положительной и отрицательной контроля.
      Примечание: например, для IP выступал с H3K4me3 и H3K27me3, следующие примеры должны выполняться на ПЦР: H3K4me3, H3K27me3 и IgG чип ДНК, ввод ДНК, а не шаблон элемента (NTC) с праймерами для регионов обогащаться с H3K4me3 (положительный контроль) и регионах обогащаться с H3K4me3 (отрицательный контроль); Аналогичным образом для H3K27me3.
    3. Выполните стандартные протоколы для выполнения ПЦР12. Короче говоря выполняйте ПЦР, используя зеленый Мастер микс SYBR, 0.5 мкл 10 мкм рабочей концентрации каждого прямого и обратного грунтовка и 2 мкл рабочего раствора микросхемы или ввода ДНК. Прочитано пластины с помощью ПЦР в режиме реального времени системы. Грунтовка последовательности приведены в таблице 2. Gapdh грунтовка последовательности от Хван и др. были используемые13.
    4. Анализировать чип данных по отношению к входу, то есть процент ввода метода (% IP)14. Рассчитайте процент ввода, используя следующие формулы:
      Скорректированы ввода = среднее ct (вход)-вход2(DF)
      где DF является коэффициент разбавления начального ввода и
      DF = общий объем IP / объем ввода
      % IP = 100 × 2 ^ (с учетом ввода - Ct (IP))
      где КТ-коэффициент порогового значения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Схематическое представление NS, созданные от опухоли головного мозга, где клетки опухоли мозга являются Катюшка позитивные опухоли представлена на рисунке 1. На рисунке 2 это схематическое представление всей техники чип. Рисунок 3 показывает представитель результаты хроматина от опухоли мозга НС переваривается с MNase для 12 мин, уступая большинство моно, ди- и tri нуклеосом. После чип, ПЦР может вып...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокола, представленные здесь позволят пользователю выполнять родной чип на NS, производный от опухоли мозга генной инженерии. В отличие от сшивки чип, этот протокол ограничен для изучения белков, которые тесно связывают с ДНК6. Количество ячеек, которые используются может быть изменена в случае необходимости и протокол можно вычислить по маштабу. Мы использовали 1 Х 106 клеток / IP, однако, родной чип может также осуществляться с как мало, как 10 x 44 клетки

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана национальных институтов из здравоохранения/Национальный институт от неврологических расстройств и инсульта (NIH/NINDS) гранты R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 до M.G.C.; NIH/NINDS предоставляет R01-NS076991, R01-NS082311 и R01-NS096756 P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; Кафедра нейрохирургии; Лии Happy Hearts и Чад хотя Фонд M.G.C. и P.R.L. РНК биомедицины Грант F046166 в M.G.C. F.M.M. поддерживается путем F31 NIH/NINDS-F31NS103500. R.I.Z.-V. поддерживается NIH / NIGMS Грант 5T34GM007821-37.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Agilent 2100 БиоанализаторAgilentG2946-90004биоанализатор
AccuSpin Micro 17R, охлажденныйFisher Scientific13-100-676
C57BL/6TaconicB6-fC57BL/6 мышиный
хлорид кальцияAldrich22350-6буферный реагент
D-люциферин, калийная сольGoldbioLuckK-1g
Магнитный штатив DiaMag1.5ДиагенодB04000003для промывки магнитных шариков
DiaMag Rotator EUDiagenodeB05000001rotator
DMEM/F-12Gibco11330-057NSC компонент
Dynabeads Белок AThermo Fisher Scientific10001Dбелок A магнитные шарики
Dynabeads Protein GThermo Fisher Scientific10003Dбелок G магнитные шарики
EGFPeproTechAF-100-15готовят 20 мкм; г/мл акций в 0,1% BSA и аликвоте.
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)SigmaE-4884буферный реагент
этиленгликоль-бис(&бета;-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N'-тетрауксусная кислота) (EGTA)SigmaE-4378буферный реактив
Fast SYBR Green Master MixApplied Biosystems4385612реактив qPCR Фетальная
бычья сывороткаGibco10437028для замораживания клеток
FGFPeproTech100-18bPrepare 20 μ г/мл акций в 0,1% BSA и аликвоте.
ЩипцыFine Science Tools11008-13для рассечения опухоли
Глицерин, MB GradeEMD- Millipore356352
H3K4me3AbcamAb8580
H3K27me3Millipore07-449
HBSSGibco14175-103сбалансированный раствор соли
FlurisoVETone501017ингаляционный анестетик
Ivis SpectrumPerkin-Elmer124262in vivo оптическая система визуализации
HyqtaseHyClonSV3003001среды для отсоединения клеток
Хлорид литияSigmaL8895буферный реагент
Микротрубки с низким связыванием CorningCostarCLS3207микроцентрифуга с низким связыванием белков
Микроцентрифужная трубкаFisher21-402-903штатная микроцентрифужная пробирка
Micrococcal NucleaseThermo Fisher Scientific, Affymetrix70196Yкаждая партия может отличаться; приобретайте достаточное количество для экспериментов и аликвоты.
N2Gibco17502-048NSC компонент Нормальный
кролик IgGMillipore12-372
НормоцинИнвивогенNOL-36-063противомикробное средство, применение в дозе 0,1 мг/мл.
NP-40 (Igepal CA-630)Sigma18896-50MLбуферный реактив
Kimble Kontes Pellet PestleFisher ScientificK749515-0000
Коктейль ингибиторов протеазыSigma-AldrichP8340aliquot и хранить при -20 °C.
Протиназу КСигма-ОлдричP2308содержат в дозе 10 мг/мл в воде; аликвоте и хранят при -20°С.
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104Набор для очистки ДНК
ScalpelFine Science Tools10007-16для вскрытия опухоли
Sodium ChlorideVWR0241-5KGбуферный реактив
Дезоксихолат натрияSigma-AldrichD670-25Gбуферный реактив
Додецилсульфат натрия (SDS)SigmaL-4390буферный реактив
Tris BaseThermo Fisher ScientificBp152-1буферный реактив
Triton X-100Thermo Fisher ScientificBP 151-500полиэтиленгликоль октилфениловый эфир
стандартная мини центрифугаFisherbrand12-006-901стандартная мини центрифуга
SZX16 микроскопOlympusSZX16флуоресцентный препарирующий микроскоп
Система ПЦР в реальном времени viiA 7 с быстрыми 96-луночными блочнымиприкладными биосистемами4453535
нанодропом OneThermo-Fisher ScientificND-ONEC-W

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schwartzentruber, J., et al. Driver mutations in histone H3.3 and chromatin remodelling genes in paediatric glioblastoma. Nature. 482 (7384), 226-231 (2012).
  2. Bjerke, L., et al. Histone H3.3. mutations drive pediatric glioblastoma through upregulation of MYCN. Cancer Discov. 3 (5), 512-519 (2013).
  3. Bender, S., et al. Reduced H3K27me3 and DNA hypomethylation are major drivers of gene expression in K27M mutant pediatric high-grade gliomas. Cancer Cell. 24 (5), 660-672 (2013).
  4. Maleszewska, M., Kaminska, B. Is glioblastoma an epigenetic malignancy? Cancers (Basel). 5 (3), 1120-1139 (2013).
  5. Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645(2012).
  6. Thorne, A. W., Myers, F. A., Hebbes, T. R. Native chromatin immunoprecipitation. Methods Mol Biol. 287, 21-44 (2004).
  7. Turner, B. Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. , (2001).
  8. Tseng, Z., Wu, T., Liu, Y., Zhong, M., Xiao, A. Using native chromatin immunoprecipitation to interrogate histone variant protein deposition in embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 1176, 11-22 (2014).
  9. Calinescu, A. A., et al. Transposon mediumted integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. J Vis Exp. (96), (2015).
  10. Sambrook, J., Russell, D. W. Estimation of cell number by hemocytometry counting. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
  11. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  12. Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med. 27 (2-3), 95-125 (2006).
  13. Hwang, W. W., et al. Distinct and separable roles for EZH2 in neurogenic astroglia. Elife. 3, e02439(2014).
  14. Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3, 11(2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

A GRIPATE

Похожие статьи