Методическая статья

Полуколичественного обнаружение РНК зависимой РНК-полимеразы активности человека теломеразы транскриптазы белка

DOI:

10.3791/57021

⸱

12 июня 2018 г.

 ,  ,  ,  , 
1Division of Cancer Stem Cell, National Cancer Center Research Institute

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Человека теломеразы обратной транскриптазы (ТРЕТ) синтезирует не только telomeric ДНК, но также двуцепочечные РНК РНК зависимой РНК-полимеразы деятельности. Здесь мы описываем недавно созданной пробирного обнаружить РНК зависимой РНК-полимеразы активность эндогенного ТРЕТ.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Человека теломеразы обратной транскриптазы (ТРЕТ) является каталитическая субъединица теломеразы, и она удлиняет теломеры через РНК зависимой ДНК-полимеразной активности. Хотя ТРЕТ называется обратной транскриптазы, структурные и филогенетический анализ ТРЕТ продемонстрировать, что ТРЕТ является членом правша полимеразы и относится к вирусной РНК зависимой РНК-полимеразы (RdRPs), а также вирусная обратной транскриптазы. Во-первых, мы определили RdRP деятельности человека ТРЕТ, который генерирует дополнительные РНК стоять в шаблон кодирования РНК и способствует РНК, глушителей в раковых клетках. Для анализа этой неканонических ферментативной активности, мы разработала RdRP пробирного с рекомбинантным ТРЕТ в 2009 году, затем в vitro RdRP assay для эндогенного ТРЕТ. В этой рукописи мы описываем последний метод. Вкратце ТРЕТ иммунных комплексов изолированы от клеток и инкубировали с шаблоном РНК и rNTPs, включая радиоактивные rNTP RdRP реакции. Чтобы устранить одноцепочечной РНК, продуктов реакции лечатся РНКазы с электрофореза геля полиакриламида анализируются я и готовой продукции. Radiolabeled RdRP продукции может быть обнаружен радиоавтографией после ночи воздействия.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Человека теломеразы обратной транскриптазы (ТРЕТ) хорошо известен как каталитическая субъединица теломеразы, и она удлиняет теломеры, используя теломеразы РНК компонента (TERC), конкретные РНК шаблон1. Хотя ТРЕТ polymerizes telomeric ДНК как компонент теломеразы, структурные и филогенетических анализов показывают, что ТРЕТ тесно связано с вирусной РНК зависимой РНК-полимеразы (RdRPs), а также вирусная обратной транскриптазы и разделяет домены с Эти полимеразы2,3,4. RdRP — фермент, который генерирует дополнительные strand РНК в шаблон РНК. Фермент кодируется не только в вирусов, но и в модели организмов, таких как завод, дрожжей и червя, и двуцепочечной РНК синтеза RdRP способствует сайленсинга генов транскрипционный анализ и post-transcriptional в этих организмах5,6 . Хотя человеческое RdRP отсутствует долгое время, мы нашли RdRP деятельность человека ТРЕТ в 20097.

Мы впервые подтвердил RdRP активность ТРЕТ с рекомбинантных белков7, а затем созданы чувствительные в vitro пробирного обнаружить RdRP активность эндогенного ТРЕТ8. Здесь мы демонстрируем в vitro RdRP assay (IP-RdRP пробирного) для эндогенного ТРЕТ. Этот метод начинается с иммунопреципитации (IP) эндогенного ТРЕТ и следуют в vitro RdRP реакции, в которой радиоактивных ribonucleotides включены в зарождающейся РНК нити.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Реагент установки

  1. Реагенты, используется для синхронизации клеток
    1. Для создания Дульбекко изменение орла среднего (DMEM) содержащий 2,5 мм тимидина, Растворите 30.28 мг тимидин в 1 мл воды класса тканевой культуры подготовить тимидина 125 мм. Фильтрата раствора с блоком фильтра шприц 0,22 мкм. Добавьте 1 mL тимидина свежеприготовленные 125 мм на 50 мл DMEM дополнена 10% (vol/vol) плода бычьим сывороточным (ФБС).
    2. Для создания DMEM, содержащие 0,1 мкг/мл Нокодазол, растворяют Нокодазол в диметилсульфоксида (ДМСО) подготовить 5 мкг/мкл Нокодазол. 1 мкл 5 мкг / мкл Нокодазол на 50 мл DMEM дополнена 10% (vol/vol) FBS.
    3. Для создания DMEM, содержащие 0,002% (vol/vol) ДМСО, добавьте 1 мкл ДМСО на 50 мл DMEM дополнена 10% (vol/vol) FBS.
  2. Реактивы, используемые для IP-RdRP assay
    1. Подготовить лизис буфера A: 150 мм NaCl, 20 мм трис-HCl (рН 7,4) и 0,5% (vol/vol) Nonidet P-40 (NP-40). Магазин реагента при 4 ° C.
    2. Подготовить 5 x ацетат буфера: 50 мм 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic кислоты (HEPES)-Кох (рН 7,8), ацетат калия 500 мм и 20 мм MgCl2. Храните реагента при комнатной температуре.
    3. Подготовить мыть буфер 1: 1 x ацетат буфера, глицерина 10% (vol/vol), 0,1% (vol/vol) Тритон X-100 и 0,06 x ингибитор протеазы коктейль, ethylenediamenetetraacetic кислоты (ЭДТА)-бесплатно. Подготовьте мыть буфера 1 день использования или на день перед использованием. Магазин реагента при 4 ° C.
    4. Приготовляют раствор АРУ: 1 x ацетат буфер, 10% (vol/vol) глицерина и 0,02% (wt/vol) 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonat (главы). Магазин реагента при 4 ° C.
    5. Чтобы создать СМЖЛ раствор, содержащий 2 мм CaCl2, 100 мкл CaCl 1 М2 на 50 мл раствора СМЖЛ. Магазин реагента при 4 ° C.
    6. Для создания СМЖЛ раствор, содержащий 3 мм этиленгликоля бис (b-aminoethylether)-N, N, N', N'-tetraacetic кислота (EGTA), мкл 375 0,4 М EGTA (рН 7,5) 50 мл раствора СМЖЛ. Магазин реагента при 4 ° C.
    7. Подготовьте мыть буфер 2: 1 x ацетат buffer и 0,02% (wt/vol) CHAPS. Магазин реагента при 4 ° C.
    8. Приготовляют раствор HMD: 0,2 М HEPES-Кох (рН 7,8), 40 mM MgCl2 и 2 мм Дитиотреитол (DTT). Магазин реагента при-20 ° C.
      Примечание: HMD раствор должен быть продлен по крайней мере за три месяца.
    9. Готовить 2 x протеиназы K буфера: 20 мм трис-HCl (рН 7,6), ЭДТА 20 мм и 1% (wt/vol) лаурилсульфат натрия (SDS). Магазин реагента при-20 ° C.
    10. Готовить 2 x загрузки буфера: 95% (vol/vol) формамид, ЭДТА 20 мм и 1% (wt/vol) оранжевый G. хранят реагент при-20 ° C.

2. Подготовка клеток HeLa

Примечание: Подготовка клетки HeLa синхронизировать в митотическая фазы (манипулировать) или деления асинхронно (unmanipulated). Культура клетки присутствии 5% CO2 при 37 ° C.

  1. Синхронизации клеток HeLa в митозе
    1. Пластина 1 x 106 клеток HeLa с 10 мл DMEM дополнена 10% (vol/vol) FBS в 10 см культуры блюдо.
    2. Через два дня после покрытия, замените средний 10 мл DMEM, содержащих тимидина 2,5 мм и 10% (vol/vol) FBS. Культура клетки за 24 ч.
    3. Вымыть клетки три раза с 10 мл-фосфатный буфер (PBS) (-) и культура клетки с 10 мл DMEM, содержащие 10% (vol/vol) FBS за 6 ч.
    4. Замените носитель с 10 мл DMEM, содержащие 0,1 мкг/мл Нокодазол и 10% (vol/vol) FBS и культура клетки для 14 h.
    5. Слегка встряхните культуры блюдо и извлекать супернатанта, содержащий отдельный митотическая клетки. Подсчитать ячейки для IP-RdRP assay.
    6. Центрифугуйте образцы на 490 x g 5 минут при температуре 4 ° C и отбросить супернатант.
      Примечание: Гранулы клетки могут храниться при температуре-80 ° C.
  2. Подготовка unmanipulated клеток HeLa
    1. Пластина 1 x 106 клеток HeLa с 10 мл DMEM дополнена 10% (vol/vol) FBS в 10 см культуры блюдо.
    2. Через два дня после покрытия, замените средний 10 мл DMEM, содержащие 10% (vol/vol) FBS. Культура клетки для 30 ч.
    3. Замените носитель с 10 мл DMEM, содержащих 0,002% (vol/vol) ДМСО и 10% (vol/vol) FBS и культура клетки для 14 h.
    4. Соберите клетки trypsinization, используя 0,7 мл трипсина (2,5 г/Л), содержащие 1 мм ЭДТА. Подсчитать ячейки для IP-RdRP assay.
    5. Центрифугуйте образцы на 490 x g 5 минут при температуре 4 ° C и отбросить супернатант.
      Примечание: Гранулы клетки могут храниться при температуре-80 ° C.

3. IP-RdRP Assay

  1. Белок А-агарозы шарик подготовка
    1. Передача 1 мл (кровать объем 500 мкл) сродство смолы пробки microcentrifuge 1,5 мл. Центрифуга на 800 x g 5 минут при температуре 4 ° C и отбросить супернатант.
    2. Добавить 800 мкл буфера Lysis A бисер и перемешать хорошо, инвертирование трубке несколько раз. Центрифуга на 800 x g 3 мин при температуре 4 ° C и отбросить супернатант. Повторите этот шаг два раза (всего три автомойки).
    3. Добавить 800 мкл буфера Lysis A бисер, смесь хорошо, инвертирование трубке несколько раз. Поворот трубы на ночь (или по крайней мере 4 h) при 4 ° C на роторный шейкер.
    4. Центрифуга для трубки на 800 x g 3 мин при температуре 4 ° C и отбросить супернатант.
    5. Добавить 500 мкл буфера Lysis A бисер и перемешать хорошо, инвертирование трубке несколько раз. Храните бусы на 4 ° C.
  2. Подготовка lysate клетки
    1. (Необязательно) Если клетки замораживаются в шаге 2, место и разморозить замороженные клетки на льду, до тех пор, пока клетки становятся рыхлыми.
    2. Вымойте клетки один раз с 10 мл PBS (-). Центрифугуйте образцы на 1450 x g 5 минут при температуре 4 ° C и отбросить супернатант.
    3. Лизируйте клетки с ледяной литического буфера (1 мл буфера Lysis A за 1 x 10-7 клеток), нежный закупорить.
    4. Sonicate образец в 1,5 мл тюбик с следующих условий; усиление sonicator на 25% и sonicate для 10 s.
    5. Центрифугуйте образцы на 20 400 x g 15 мин при 4 ° C.
    6. Соберите супернатант. Перевести 1 мл раствора супернатант в 1,5 мл пробирок microcentrifuge.
      Предупреждение: Выполните все процедуры РНКазы свободных условиях.
  3. Иммунопреципитация
    1. Предварительно снимите lysate из шага 3.2.6, добавив 40 мкл (шарик объем 20 мкл) prewashed белок А-агарозы бусы на 1 мл lysate. Смесь хорошо, инвертирование трубке несколько раз и вращать образец для 30 мин при 4 ° C.
    2. Центрифугуйте образцы на 13 000 x g 1 мин при температуре 4 ° C и восстановить супернатант.
    3. Добавить 40 мкл (кровать объем 20 мкл) prewashed белок А-агарозы бусины и 10 мкг античеловеческие ТРЕТ антитела (клон: 10E9-2)8 в предварительно отобранных lysate. Смесь хорошо, инвертирование трубке несколько раз и поворота образца при температуре 4 ° C ночью.
    4. Центрифугуйте образцы на 3300 x g для 0,5 мин при температуре 4 ° C и удалить супернатант.
    5. Вымойте бусины с мыть буфер 1: добавить 1 мл мыть буфера 1 бисер, смесь хорошо, инвертирование трубки и вращать образец для 5 мин при 4 ° C. Центрифугуйте образцы на 3300 x g для 0,5 мин при температуре 4 ° C и удалить супернатант. Повторите этот шаг еще три раза.
    6. Один раз промойте бисер СМЖЛ раствор, содержащий 2 мм CaCl2: добавить 1 мл раствора СМЖЛ, содержащий 2 мм CaCl2 корда, смесь хорошо, инвертирование трубки и вращать образец для 5 мин при 4 ° C. Центрифугуйте образцы на 3300 x g для 0,5 мин при температуре 4 ° C и удалить супернатант.
    7. Лечить бусины с Микрококковая Нуклеаза (MNase): подготовить смесь реакции MNase, описанных в таблице 1. Ресуспензируйте бисер в 60 мкл реакционной смеси MNase, нежный закупорить. Образец осторожно встряхнуть (20-25 мин) на проигрыватель шейкер в инкубатор Пельтье тип 15 мин при температуре 25 ° C.
      Примечание: Очень важно использовать волнообразный шейкер и строго соблюдать ограничения скорости в этом шаге. Другой тип шейкеры, таких как Вращающиеся мешалки, не рекомендуется.
    8. Центрифугуйте образцы на 3300 x g для 0,5 мин при температуре 4 ° C и удалить супернатант.
    9. Дважды промыть бисер СМЖЛ раствор, содержащий 3 мм EGTA: добавить 1 мл раствора СМЖЛ, содержащий 3 мм EGTA-бисер, смесь хорошо, инвертирование трубки и вращать образец для 5 мин при 4 ° C. Центрифугуйте образцы на 3300 x g для 0,5 мин при температуре 4 ° C и удалить супернатант. Повторите этот шаг один раз.
    10. Мыть бусины с мыть буфер 2: добавьте 1 mL мыть буфера 2бусины, смесь хорошо, инвертирование трубки и вращать образец для 5 мин при 4 ° C. Центрифугуйте образцы на 3300 x g для 0,5 мин при температуре 4 ° C и удалить супернатант. Храните бусы на льду при настройке RdRP реакции.
      Предупреждение: Выполните все процедуры РНКазы свободных условиях.
  4. Реакция RdRP
    1. Приготовить смесь реакции RdRP в новой трубки, как описано в таблице 2.
    2. 6 мкл [α -32P] UTP (3000 Ci/ммоль) в смеси и перемешать хорошо, закупорить.
      Примечание: СПС [α -32P], [α -32P] CTP, или GTP [α -32P] может использоваться для реакции вместо [α -32P] UTP.
    3. 1 мкл шаблона РНК (1 мкг/мкл) к смеси и перемешать хорошо, закупорить.
      Примечание: Чтобы установить RdRP assay, рекомендуется следующий шаблон РНК: 5'-GGGAUCAUGUGGGUCCUAUUACAUUUUAAACCCA-3' 9.
    4. Ресуспензируйте бусины с 20 мкл реакционной смеси из шага 3.4.3 RdRP, закупорить.
    5. Образец осторожно встряхнуть (20-25 мин) на проигрыватель шейкер в инкубатор Пельтье тип втечение 2 ч при температуре 32 ° C.
    6. Добавьте 5.4 мкл протеиназы K (20 мг/мл) и 45.4 мкл 2 x протеиназы K буфера в реакционной смеси. Смешать, закупорить и поколебать (20-25 мин) образца на поворотный круг в инкубатор Пельтье типа на 30 минут при 37 ° C.
    7. Мкл 109.2 РНКазы свободной воды на образец.
    8. Добавьте 200 мкл кислоты фенол хлороформ образца. Смесь хорошо, вихрь и затем Центрифугуйте образцы на 21100 x g 5 мин при комнатной температуре. Передача водной фазе к новой пробке. Повторите этот шаг один раз.
    9. 20 мкл ацетат натрия 3 M (рН = 5.2), 4 мкл осадков перевозчика и 250 мкл этанола в водной фазе. Встряхнуть трубка хорошо для смешивания, а затем Центрифугуйте образцы на 21100 x g 20 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
    10. Помыть лепешка с 300 мкл холодного этанола (vol/vol) 70%, хранятся при температуре-20 ° C. Центрифугуйте образцы на 21100 x g 15 мин при 4 ° C.
    11. Отменить супернатант и просушите гранулы.
      Предупреждение: Выполните все процедуры РНКазы свободных условиях.
      Примечание: Гранулы из шага 3.4.11 может храниться при температуре-20 ° C по меньшей мере 2 дня.
  5. РНКазы лечение
    1. Ресуспензируйте гранулы от шага 3.4.11 в 20 мкл РНКазы свободной воды.
    2. Приготовить смесь реакции РНКазы в новой трубки, как описано в таблице 3.
    3. 180 мкл реакционной смеси РНКазы образца и инкубировать трубки для 2 ч при 37 ° C.
    4. 2.3 мкл 10% (vol/vol) SDS для образца и Инкубируйте 15 мин при температуре 37 ° C.
    5. 2 мкл протеиназы K (20 мг/мл) в образце и Инкубируйте 15 мин при температуре 37 ° C.
    6. 205 мкл кислоты фенол хлороформ, к образцу. Смесь хорошо, вихря, затем центрифуга образца на 21100 x g 5 мин при комнатной температуре. Передача водной фазе к новой пробке.
    7. 20 мкл ацетат натрия 3 M (рН 5.2), 4 мкл осадков перевозчика и 250 мкл этанола в водной фазе. Встряхнуть трубка хорошо для смешивания, а затем Центрифугуйте образцы на 21100 x g 20 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
    8. Помыть лепешка с 300 мкл холодного этанола (vol/vol) 70%, хранятся при температуре-20 ° C. Центрифугуйте образцы на 21100 x g 15 мин при 4 ° C.
    9. Отменить супернатант и просушите гранулы.
      Примечание: Гранулы из шага 3.5.9 может храниться при температуре-20 ° C по меньшей мере 2 дня.
  6. Электрофорез геля и авторадиографии
    1. Ресуспензируйте образца с 20 мкл РНКазы свободной воды.
    2. 20 мкл 2 x загрузки буфера.
    3. Отварить образца для 10 мин при 95 ° C. Измельчить образец на льду.
    4. Побегите гель. В случае, если шаблон размер 34 НТС (см. также шаг 3.4.3), 7 M мочевины - 10% геля полиакриламида используется для Денатурирующий гель-электрофорез.
    5. Сухие гель гель фен.
    6. Разоблачить фильм высушенный гель в рентгеновской кассеты с интенсификацией экрана-80 ° c.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рекомендуемый шаблон РНК радиоактивных продуктов RdRP наблюдаются между 20-30 нуклеотидов (nt) конкретно в клетки HeLa в фазе митотического после ночи воздействия (рис. 1A). Как правило, интенсивность сигнала RdRP продукции демонстрирует две вершины, которые расположены около 25 nt и 30 nt в соответствии с распределением размера продукции подтверждено следующего поколения последовательности9. В отличие от митотическая клетки клетки HeLa без синхронизации демонстрируют почти отсутствие радиоактивных продуктов nt 20 – 30. Овальный сигналы, которые находятся ниже 20 nt во всех пробах, являются неспецифическими сугробы.

В случае, если там только ~ 30 nt продукт с слабый сигнал в митотическая клетки HeLa, он указывает, что реакция RdRP не идут хорошо. Например, если MNase лечение проводится примерно и ненадлежащим образом, интенсивности сигнала в митотическая НеЬа клетки уменьшается значительно (рис. 1B). RdRP реакции с старый HMD решения также уменьшает продукцию (рис. 1 c).

figure-results-1
Рисунок 1 : Представитель RdRP продукции эндогенного ТРЕТ митотическая клеток HeLa. (A) три представителя результаты анализа IP-RdRP в клетки HeLa лечение Нокодазол (манипулировать) или ДМСО (unmanipulated). Химически синтезированных 34 nt РНК был использован в качестве шаблона. (B) IP-RdRP пробирного митотическая клеток HeLa, выступал с неуместным MNase лечения. (C) IP-RdRP пробирного в митотическая клетки HeLa, выступал с HMD решения либо свежие или старый. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

РеактивыОбъем
Микрококковая Нуклеаза, 20 U/мкл1 МКЛ
Микрококковая Нуклеаза буфера, 10 x8 МКЛ
РНКазы свободной воды51 МКЛ

Таблица 1: MNase реакции микс компонент.

РеактивыОбъем
РЕБЯТА, 0,07% (wt/vol)6 МКЛ
HMD решение2 МКЛ
rATP, 80 мм0.5 МКЛ
rGTP, 8 мм1 МКЛ
rUTP, 0,4 мм1 МКЛ
rCTP, 8 мм1 МКЛ
АБС битор РНКазы, 40 U/мкл0.5 МКЛ
РНКазы свободной воды1 МКЛ

Таблица 2: RdRP реакции микс компонент.

РеактивыОбъем
РНКазы один рибонуклеаза, 10 U/мкл0.2 МКЛ
Реакция буфера, 10 x20 МКЛ
РНКазы свободной воды159,8 МКЛ

Таблица 3: Рибонуклеазы реакции микс компонент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IP-RdRP assay является чувствительным методом для обнаружения RdRP деятельность человека ТРЕТ. Белок ТРЕТ высоко выражается в митотическая НеЬа клетки, в которых ТРЕТ образует RdRP комплекс8,9,10. Это свидетельствует о том, что митотическая НеЬа клетки являются оптимальный материал для обнаружения RdRP активности. В протоколе, описанных выше митотическая и синхронизированных клеток HeLa включены как положительный и отрицательный пример, соответственно. Как показано на рисунке 1A, RdRP пробирного продукты от рекомендуемый шаблон РНК в митотическая НеЬа клетки показывают широкий радиоактивных сигналов между 20-30 nt. Помимо клетки HeLa, мы выполняется проба с различными типами клеточных линий и обнаружили, что сигнал шаблон может быть изменен в различных клеточных типов9: некоторые показывают сильный сигнал только около 30 nt, некоторые показывают, аналогичная ситуация с НеЬа клетки. Мы также выполнили assay с РНК шаблоны помимо 34 nt шаблон8, короткие и длинные (~ 300 nt) РНК с различными последовательностями и успешно получил RdRP продуктов из этих шаблонов, хотя может существовать определенное предпочтение. Для первого судебного разбирательства однако, мы рекомендуем использовать клетки HeLa в фазе митотического и 34 шаблон nt РНК. RdRPs может генерировать двуцепочечной РНК в грунт зависимых и в грунт независимым образом11. Мы уже сообщали, что ТРЕТ сохраняет это свойство как человека RdRP7,9; ТЕРТ синтезирует двуцепочечной РНК шаблона с 3'-foldback структуры через механизм обратно грунтование7. В шаблоне 34 nt РНК ТРЕТ синтезирует дополнительные пряди без использования грунтовки9. Конкретно определить RdRP продуктов синтезируется в грунт независимым образом, т.е. de novo синтезированных РНК продукции, [α -32P] NTP могут быть заменены [γ -32P] NTP в реакции RdRP9.

MNase лечение ТРЕТ иммунных комплексов на бисер является важным шагом для достижения желаемых результатов. Если лечение MNase выполняется слишком долго или с интенсивной тряски, RdRP продуктов заметно сократится. Чтобы избежать таких неприятностей, настоятельно рекомендуется строго следовать протоколу тщательно. HMD решение является еще одним важнейшим фактором для достижения успеха. Если вы обнаружите, что сигналы очень слабы, замените HMD решение недавно подготовленных один.

На протяжении всего протокола следует принять большую осторожность, чтобы избежать загрязнения РНКазы. Рибонуклеаза лечение должны быть выполнены с специальное оборудование. После манипулирования рибонуклеаза, один следует отказаться советы и трубы с РНКазы немедленно, ликвидировать РНКазы специализированными раствором (например РНКазы тихий) и изменить рощи.

ТРЕТ взаимодействует с не только TERC , но также много видов эндогенных молекул РНК, и часть из них мы сообщали7. Изменения в IP-RdRP assay, например IP-RdRP assay без MNase лечения, обеспечит полный список эндогенного РНК шаблонов для RdRP ТРЕТ связанные активности и bioinformatic руководство на их последовательность функций. Мы успешно применили этот протокол lysate ткани. Потому что ТРЕТ выражается в различных нормальных и опухолевых тканей, этот assay может быть полезным для расследования неканонических ферментативные функции ТРЕТ человека.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана в части проекта для развития инновационных исследований по терапии рака (P-прямой) (15cm0106102h0002, к.м.) и проект для исследований рака и терапевтические эволюции (P-создать) (16 см 01061150001, к.м.) от агентства Японии для медицинских исследований и развития, AMED; Takeda научный фонд (ю.м.); Грант принцесса Такамацу онкологический научный фонд (13-24520, ю.м.); и номер гранта JSP-страницы KAKENHI JP16K07133 (ю.м.).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Дульбекко s модифицированный Eagle' s среда (DMEM)Wako044-29765
Фетальная бычья сыворотка (FBS)CORNING35-010-CV
Пенициллин-стрептомицин смешанный растворnacalai tesque26253-84
Раствор трипсина-этилендиаментетрауксусной кислоты (ЭДТА)nacalai tesque32777-44
Фосфатный буферный физиологический раствор (PBS(-))Wako166-23555
Тимидиннакалай теске07147-61
НокодазолСигмаM1404
Диметилсульфоксид (ДМСО)накалай теске08904-85
Хлорид натриянакалай теске31333-45
Трис(гидроксиметил)аминометаннакалайтеске 35434-21
Соляная кислотаnacalai tesque18321-05
Nonidet P-40 (NP-40)nacalai tesque25223-04
Pierce Protein A Plus AgaroseThermo scientific22812
2-[4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинил]этансульфоновая кислота (HEPES)nacalai tesque17514-15
Гидроксид калияWako168-21815
Калий ацетатnacalai tesque28405-05
Магния хлорид гексагидрат (MgCl2• 6H2O)Wako135-00165
Глицеринnacalaitesque 17045-65
Полиоксиэтилен(10) октилфениловый эфир (Triton X-100)Wako169-21105
cOmplete, без ЭДТАRoche Applied Science11 873 580 001
Дигидрат хлорида кальция (CaCl2• 2H2O)nacalai tesque06731-05
Микрококковая нуклеаза (MNase)Takara Bio2910A
Этиленгликоль бис (b-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N'-тетрауксусная кислота (EGTA)nacalai tesque15214-92
3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-пропансульфонат (CHAPS)nacalai tesque07957-64
Дитиотреитол (DTT)nacalai tesque14128-91
rCTP, rATP, rUTP, rGTP, по 100 мМ каждыйPromegaE6000
[a-32P]UTP (3,000 Ки/ммоль)PerkinElmerNEG507HИспользуйте свежий RI для анализа
ингибитора РНКазыTOYOBOSIN-201
Proteinase KTakara9033
Кислота-фенол:Хлороформ, pH 4,5 ( с IAA, 125:24:1)Life TechnologiesAM9720
3 M Ацетат натрияNIPPON GENE316-90081
Этанол (99,5)nacalai tesque14713-95
Dr. GenTLE Precipitation CarrierTakara Bio9094
РНКаза одна рибонуклеазаPromegaM4265
Додецилсульфат натрия (SDS)nacalai tesque02873-75
Формамид, деионизированныйnacalai tesque16345-65
Этилендиаминтетрауксусная кислота Дигидрат соли натрия (EDTA)nacalai tesque15130-95
Orange Gnacalai tesque25401-22
CO2 инкубатор,например, ASTECSCA-325DRS
Центрифуга,например, TOMYEX-135Для этапа B)
Микроцентрифуга с охлаждением, например, KUBOTA3740Для шага 6.2
СоникаторQsonicaQ125Установите микронаконечник (#4422) на соникатор, для шага 6.4
Микроцентрифуга с охлаждениемнапример, TOMYMX-305Для этапа 6.5
Охлаждаемый инкубаторнапример, PanasonicMIR-154-PJУстановите внутри ротационный шейкер
Роторный встряхиватель, например, TAITECRT-5
Охлаждаемый инкубатор Например, TAITECBR-43FLКомплект шейкера " МИНИ ВОЛНА» внутри, для ступени 7.7
МИНИ ВОЛНАКАК ОДНАWEV-03Шейкер для ступеней 7.7, 8.5 и 8.6
Инкубаторнапример, TAITECHB-80Установите шейкер " МИНИ ВОЛНА» внутри, для шага 8.5 и 8.6
Блочный инкубаторнапример, ASTECBI-516S
, , ,

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Martinez, P., Blasco, M. A. Telomeric and extra-telomeric roles for telomerase and the telomere-binding proteins. Nat Rev Cancer. 11 (3), 161-176 (2011).
  2. Nakamura, T. M., et al. Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human. Science. 277 (5328), 955-959 (1997).
  3. Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT. Nature. 455 (7213), 633-637 (2008).
  4. Salgado, P. S., et al. The structure of an RNAi polymerase links RNA silencing and transcription. PLoS Biol. 4 (12), e434(2006).
  5. Castel, S. E., Martienssen, R. A. RNA interference in the nucleus: roles for small RNAs in transcription, epigenetics and beyond. Nat Rev Genet. 14 (2), 100-112 (2013).
  6. Sugiyama, T., Cam, H., Verdel, A., Moazed, D., Grewal, S. I. RNA-dependent RNA polymerase is an essential component of a self-enforcing loop coupling heterochromatin assembly to siRNA production. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (1), 152-157 (2005).
  7. Maida, Y., et al. An RNA-dependent RNA polymerase formed by TERT and the RMRP RNA. Nature. 461 (7261), 230-235 (2009).
  8. Maida, Y., et al. Involvement of telomerase reverse transcriptase in heterochromatin maintenance. Mol Cell Biol. 34 (9), 1576-1593 (2014).
  9. Maida, Y., Yasukawa, M., Masutomi, K. De Novo RNA Synthesis by RNA-Dependent RNA Polymerase Activity of Telomerase Reverse Transcriptase. Mol Cell Biol. 36 (8), 1248-1259 (2016).
  10. Okamoto, N., et al. Maintenance of tumor initiating cells of defined genetic composition by nucleostemin. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20388-20393 (2011).
  11. van Dijk, A. A., Makeyev, E. V., Bamford, D. H. Initiation of viral RNA-dependent RNA polymerization. J Gen Virol. 85 (Pt 5), 1077-1093 (2004).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

RNA dependent RNA Polymerase ActivityHuman Telomerase Reverse TranscriptaseRdRP AssayTERT Immune Complex IsolationPolyacrylamide Gel ElectrophoresisAutoradiography DetectionRNase I TreatmentRadioactive rNTP IncubationProtein A agarose BeadsAnti human TERT Antibody

Похожие статьи