Полуколичественного обнаружение РНК зависимой РНК-полимеразы активности человека теломеразы транскриптазы белка

Человека теломеразы обратной транскриптазы (ТРЕТ) хорошо известен как каталитическая субъединица теломеразы, и она удлиняет теломеры, используя теломеразы РНК компонента (TERC), конкретные РНК шаблон¹. Хотя ТРЕТ polymerizes telomeric ДНК как компонент теломеразы, структурные и филогенетических анализов показывают, что ТРЕТ тесно связано с вирусной РНК зависимой РНК-полимеразы (RdRPs), а также вирусная обратной транскриптазы и разделяет домены с Эти полимеразы^2,3,4. RdRP — фермент, который генерирует дополнительные strand РНК в шаблон РНК. Фермент кодируется не только в вирусов, но и в модели организмов, таких как завод, дрожжей и червя, и двуцепочечной РНК синтеза RdRP способствует сайленсинга генов транскрипционный анализ и post-transcriptional в этих организмах^5,6 . Хотя человеческое RdRP отсутствует долгое время, мы нашли RdRP деятельность человека ТРЕТ в 2009⁷.

Мы впервые подтвердил RdRP активность ТРЕТ с рекомбинантных белков⁷, а затем созданы чувствительные в vitro пробирного обнаружить RdRP активность эндогенного ТРЕТ⁸. Здесь мы демонстрируем в vitro RdRP assay (IP-RdRP пробирного) для эндогенного ТРЕТ. Этот метод начинается с иммунопреципитации (IP) эндогенного ТРЕТ и следуют в vitro RdRP реакции, в которой радиоактивных ribonucleotides включены в зарождающейся РНК нити.

1. Реагент установки

1. Реагенты, используется для синхронизации клеток
   1. Для создания Дульбекко изменение орла среднего (DMEM) содержащий 2,5 мм тимидина, Растворите 30.28 мг тимидин в 1 мл воды класса тканевой культуры подготовить тимидина 125 мм. Фильтрата раствора с блоком фильтра шприц 0,22 мкм. Добавьте 1 mL тимидина свежеприготовленные 125 мм на 50 мл DMEM дополнена 10% (vol/vol) плода бычьим сывороточным (ФБС).
   2. Для создания DMEM, содержащие 0,1 мкг/мл Нокодазол, растворяют Нокодазол в диметилсульфоксида (ДМСО) подготовить 5 мкг/мкл Нокодазол. 1 мкл 5 мкг / мкл Нокодазол на 50 мл DMEM дополнена 10% (vol/vol) FBS.
   3. Для создания DMEM, содержащие 0,002% (vol/vol) ДМСО, добавьте 1 мкл ДМСО на 50 мл DMEM дополнена 10% (vol/vol) FBS.
2. Реактивы, используемые для IP-RdRP assay
   1. Подготовить лизис буфера A: 150 мм NaCl, 20 мм трис-HCl (рН 7,4) и 0,5% (vol/vol) Nonidet P-40 (NP-40). Магазин реагента при 4 ° C.
   2. Подготовить 5 x ацетат буфера: 50 мм 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic кислоты (HEPES)-Кох (рН 7,8), ацетат калия 500 мм и 20 мм MgCl₂. Храните реагента при комнатной температуре.
   3. Подготовить мыть буфер 1: 1 x ацетат буфера, глицерина 10% (vol/vol), 0,1% (vol/vol) Тритон X-100 и 0,06 x ингибитор протеазы коктейль, ethylenediamenetetraacetic кислоты (ЭДТА)-бесплатно. Подготовьте мыть буфера 1 день использования или на день перед использованием. Магазин реагента при 4 ° C.
   4. Приготовляют раствор АРУ: 1 x ацетат буфер, 10% (vol/vol) глицерина и 0,02% (wt/vol) 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonat (главы). Магазин реагента при 4 ° C.
   5. Чтобы создать СМЖЛ раствор, содержащий 2 мм CaCl₂, 100 мкл CaCl 1 М₂ на 50 мл раствора СМЖЛ. Магазин реагента при 4 ° C.
   6. Для создания СМЖЛ раствор, содержащий 3 мм этиленгликоля бис (b-aminoethylether)-N, N, N', N'-tetraacetic кислота (EGTA), мкл 375 0,4 М EGTA (рН 7,5) 50 мл раствора СМЖЛ. Магазин реагента при 4 ° C.
   7. Подготовьте мыть буфер 2: 1 x ацетат buffer и 0,02% (wt/vol) CHAPS. Магазин реагента при 4 ° C.
   8. Приготовляют раствор HMD: 0,2 М HEPES-Кох (рН 7,8), 40 mM MgCl₂ и 2 мм Дитиотреитол (DTT). Магазин реагента при-20 ° C.
      Примечание: HMD раствор должен быть продлен по крайней мере за три месяца.
   9. Готовить 2 x протеиназы K буфера: 20 мм трис-HCl (рН 7,6), ЭДТА 20 мм и 1% (wt/vol) лаурилсульфат натрия (SDS). Магазин реагента при-20 ° C.
   10. Готовить 2 x загрузки буфера: 95% (vol/vol) формамид, ЭДТА 20 мм и 1% (wt/vol) оранжевый G. хранят реагент при-20 ° C.

2. Подготовка клеток HeLa

Примечание: Подготовка клетки HeLa синхронизировать в митотическая фазы (манипулировать) или деления асинхронно (unmanipulated). Культура клетки присутствии 5% CO₂ при 37 ° C.

1. Синхронизации клеток HeLa в митозе
   1. Пластина 1 x 10⁶ клеток HeLa с 10 мл DMEM дополнена 10% (vol/vol) FBS в 10 см культуры блюдо.
   2. Через два дня после покрытия, замените средний 10 мл DMEM, содержащих тимидина 2,5 мм и 10% (vol/vol) FBS. Культура клетки за 24 ч.
   3. Вымыть клетки три раза с 10 мл-фосфатный буфер (PBS) (-) и культура клетки с 10 мл DMEM, содержащие 10% (vol/vol) FBS за 6 ч.
   4. Замените носитель с 10 мл DMEM, содержащие 0,1 мкг/мл Нокодазол и 10% (vol/vol) FBS и культура клетки для 14 h.
   5. Слегка встряхните культуры блюдо и извлекать супернатанта, содержащий отдельный митотическая клетки. Подсчитать ячейки для IP-RdRP assay.
   6. Центрифугуйте образцы на 490 x g 5 минут при температуре 4 ° C и отбросить супернатант.
      Примечание: Гранулы клетки могут храниться при температуре-80 ° C.
2. Подготовка unmanipulated клеток HeLa
   1. Пластина 1 x 10⁶ клеток HeLa с 10 мл DMEM дополнена 10% (vol/vol) FBS в 10 см культуры блюдо.
   2. Через два дня после покрытия, замените средний 10 мл DMEM, содержащие 10% (vol/vol) FBS. Культура клетки для 30 ч.
   3. Замените носитель с 10 мл DMEM, содержащих 0,002% (vol/vol) ДМСО и 10% (vol/vol) FBS и культура клетки для 14 h.
   4. Соберите клетки trypsinization, используя 0,7 мл трипсина (2,5 г/Л), содержащие 1 мм ЭДТА. Подсчитать ячейки для IP-RdRP assay.
   5. Центрифугуйте образцы на 490 x g 5 минут при температуре 4 ° C и отбросить супернатант.
      Примечание: Гранулы клетки могут храниться при температуре-80 ° C.

3. IP-RdRP Assay

1. Белок А-агарозы шарик подготовка
   1. Передача 1 мл (кровать объем 500 мкл) сродство смолы пробки microcentrifuge 1,5 мл. Центрифуга на 800 x g 5 минут при температуре 4 ° C и отбросить супернатант.
   2. Добавить 800 мкл буфера Lysis A бисер и перемешать хорошо, инвертирование трубке несколько раз. Центрифуга на 800 x g 3 мин при температуре 4 ° C и отбросить супернатант. Повторите этот шаг два раза (всего три автомойки).
   3. Добавить 800 мкл буфера Lysis A бисер, смесь хорошо, инвертирование трубке несколько раз. Поворот трубы на ночь (или по крайней мере 4 h) при 4 ° C на роторный шейкер.
   4. Центрифуга для трубки на 800 x g 3 мин при температуре 4 ° C и отбросить супернатант.
   5. Добавить 500 мкл буфера Lysis A бисер и перемешать хорошо, инвертирование трубке несколько раз. Храните бусы на 4 ° C.
2. Подготовка lysate клетки
   1. (Необязательно) Если клетки замораживаются в шаге 2, место и разморозить замороженные клетки на льду, до тех пор, пока клетки становятся рыхлыми.
   2. Вымойте клетки один раз с 10 мл PBS (-). Центрифугуйте образцы на 1450 x g 5 минут при температуре 4 ° C и отбросить супернатант.
   3. Лизируйте клетки с ледяной литического буфера (1 мл буфера Lysis A за 1 x 10-⁷ клеток), нежный закупорить.
   4. Sonicate образец в 1,5 мл тюбик с следующих условий; усиление sonicator на 25% и sonicate для 10 s.
   5. Центрифугуйте образцы на 20 400 x g 15 мин при 4 ° C.
   6. Соберите супернатант. Перевести 1 мл раствора супернатант в 1,5 мл пробирок microcentrifuge.
      Предупреждение: Выполните все процедуры РНКазы свободных условиях.
3. Иммунопреципитация
   1. Предварительно снимите lysate из шага 3.2.6, добавив 40 мкл (шарик объем 20 мкл) prewashed белок А-агарозы бусы на 1 мл lysate. Смесь хорошо, инвертирование трубке несколько раз и вращать образец для 30 мин при 4 ° C.
   2. Центрифугуйте образцы на 13 000 x g 1 мин при температуре 4 ° C и восстановить супернатант.
   3. Добавить 40 мкл (кровать объем 20 мкл) prewashed белок А-агарозы бусины и 10 мкг античеловеческие ТРЕТ антитела (клон: 10E9-2)⁸ в предварительно отобранных lysate. Смесь хорошо, инвертирование трубке несколько раз и поворота образца при температуре 4 ° C ночью.
   4. Центрифугуйте образцы на 3300 x g для 0,5 мин при температуре 4 ° C и удалить супернатант.
   5. Вымойте бусины с мыть буфер 1: добавить 1 мл мыть буфера 1 бисер, смесь хорошо, инвертирование трубки и вращать образец для 5 мин при 4 ° C. Центрифугуйте образцы на 3300 x g для 0,5 мин при температуре 4 ° C и удалить супернатант. Повторите этот шаг еще три раза.
   6. Один раз промойте бисер СМЖЛ раствор, содержащий 2 мм CaCl₂: добавить 1 мл раствора СМЖЛ, содержащий 2 мм CaCl₂ корда, смесь хорошо, инвертирование трубки и вращать образец для 5 мин при 4 ° C. Центрифугуйте образцы на 3300 x g для 0,5 мин при температуре 4 ° C и удалить супернатант.
   7. Лечить бусины с Микрококковая Нуклеаза (MNase): подготовить смесь реакции MNase, описанных в таблице 1. Ресуспензируйте бисер в 60 мкл реакционной смеси MNase, нежный закупорить. Образец осторожно встряхнуть (20-25 мин) на проигрыватель шейкер в инкубатор Пельтье тип 15 мин при температуре 25 ° C.
      Примечание: Очень важно использовать волнообразный шейкер и строго соблюдать ограничения скорости в этом шаге. Другой тип шейкеры, таких как Вращающиеся мешалки, не рекомендуется.
   8. Центрифугуйте образцы на 3300 x g для 0,5 мин при температуре 4 ° C и удалить супернатант.
   9. Дважды промыть бисер СМЖЛ раствор, содержащий 3 мм EGTA: добавить 1 мл раствора СМЖЛ, содержащий 3 мм EGTA-бисер, смесь хорошо, инвертирование трубки и вращать образец для 5 мин при 4 ° C. Центрифугуйте образцы на 3300 x g для 0,5 мин при температуре 4 ° C и удалить супернатант. Повторите этот шаг один раз.
   10. Мыть бусины с мыть буфер 2: добавьте 1 mL мыть буфера 2бусины, смесь хорошо, инвертирование трубки и вращать образец для 5 мин при 4 ° C. Центрифугуйте образцы на 3300 x g для 0,5 мин при температуре 4 ° C и удалить супернатант. Храните бусы на льду при настройке RdRP реакции.
       Предупреждение: Выполните все процедуры РНКазы свободных условиях.
4. Реакция RdRP
   1. Приготовить смесь реакции RdRP в новой трубки, как описано в таблице 2.
   2. 6 мкл [α -³²P] UTP (3000 Ci/ммоль) в смеси и перемешать хорошо, закупорить.
      Примечание: СПС [α -³²P], [α -³²P] CTP, или GTP [α -³²P] может использоваться для реакции вместо [α -³²P] UTP.
   3. 1 мкл шаблона РНК (1 мкг/мкл) к смеси и перемешать хорошо, закупорить.
      Примечание: Чтобы установить RdRP assay, рекомендуется следующий шаблон РНК: 5'-GGGAUCAUGUGGGUCCUAUUACAUUUUAAACCCA-3' ⁹.
   4. Ресуспензируйте бусины с 20 мкл реакционной смеси из шага 3.4.3 RdRP, закупорить.
   5. Образец осторожно встряхнуть (20-25 мин) на проигрыватель шейкер в инкубатор Пельтье тип втечение 2 ч при температуре 32 ° C.
   6. Добавьте 5.4 мкл протеиназы K (20 мг/мл) и 45.4 мкл 2 x протеиназы K буфера в реакционной смеси. Смешать, закупорить и поколебать (20-25 мин) образца на поворотный круг в инкубатор Пельтье типа на 30 минут при 37 ° C.
   7. Мкл 109.2 РНКазы свободной воды на образец.
   8. Добавьте 200 мкл кислоты фенол хлороформ образца. Смесь хорошо, вихрь и затем Центрифугуйте образцы на 21100 x g 5 мин при комнатной температуре. Передача водной фазе к новой пробке. Повторите этот шаг один раз.
   9. 20 мкл ацетат натрия 3 M (рН = 5.2), 4 мкл осадков перевозчика и 250 мкл этанола в водной фазе. Встряхнуть трубка хорошо для смешивания, а затем Центрифугуйте образцы на 21100 x g 20 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
   10. Помыть лепешка с 300 мкл холодного этанола (vol/vol) 70%, хранятся при температуре-20 ° C. Центрифугуйте образцы на 21100 x g 15 мин при 4 ° C.
   11. Отменить супернатант и просушите гранулы.
       Предупреждение: Выполните все процедуры РНКазы свободных условиях.
       Примечание: Гранулы из шага 3.4.11 может храниться при температуре-20 ° C по меньшей мере 2 дня.
5. РНКазы лечение
   1. Ресуспензируйте гранулы от шага 3.4.11 в 20 мкл РНКазы свободной воды.
   2. Приготовить смесь реакции РНКазы в новой трубки, как описано в таблице 3.
   3. 180 мкл реакционной смеси РНКазы образца и инкубировать трубки для 2 ч при 37 ° C.
   4. 2.3 мкл 10% (vol/vol) SDS для образца и Инкубируйте 15 мин при температуре 37 ° C.
   5. 2 мкл протеиназы K (20 мг/мл) в образце и Инкубируйте 15 мин при температуре 37 ° C.
   6. 205 мкл кислоты фенол хлороформ, к образцу. Смесь хорошо, вихря, затем центрифуга образца на 21100 x g 5 мин при комнатной температуре. Передача водной фазе к новой пробке.
   7. 20 мкл ацетат натрия 3 M (рН 5.2), 4 мкл осадков перевозчика и 250 мкл этанола в водной фазе. Встряхнуть трубка хорошо для смешивания, а затем Центрифугуйте образцы на 21100 x g 20 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
   8. Помыть лепешка с 300 мкл холодного этанола (vol/vol) 70%, хранятся при температуре-20 ° C. Центрифугуйте образцы на 21100 x g 15 мин при 4 ° C.
   9. Отменить супернатант и просушите гранулы.
      Примечание: Гранулы из шага 3.5.9 может храниться при температуре-20 ° C по меньшей мере 2 дня.
6. Электрофорез геля и авторадиографии
   1. Ресуспензируйте образца с 20 мкл РНКазы свободной воды.
   2. 20 мкл 2 x загрузки буфера.
   3. Отварить образца для 10 мин при 95 ° C. Измельчить образец на льду.
   4. Побегите гель. В случае, если шаблон размер 34 НТС (см. также шаг 3.4.3), 7 M мочевины - 10% геля полиакриламида используется для Денатурирующий гель-электрофорез.
   5. Сухие гель гель фен.
   6. Разоблачить фильм высушенный гель в рентгеновской кассеты с интенсификацией экрана-80 ° c.

Рекомендуемый шаблон РНК радиоактивных продуктов RdRP наблюдаются между 20-30 нуклеотидов (nt) конкретно в клетки HeLa в фазе митотического после ночи воздействия (рис. 1A). Как правило, интенсивность сигнала RdRP продукции демонстрирует две вершины, которые расположены около 25 nt и 30 nt в соответствии с распределением размера продукции подтверждено следующего поколения последовательности9. В отличие от митотическая клетки клетки HeLa без синхронизации демонстрируют почти отсутствие радиоактивных продуктов nt 20 – 30. Овальный сигналы, которые находятся ниже 20 nt во всех пробах, являются неспецифическими сугробы.

В случае, если там только ~ 30 nt продукт с слабый сигнал в митотическая клетки HeLa, он указывает, что реакция RdRP не идут хорошо. Например, если MNase лечение проводится примерно и ненадлежащим образом, интенсивности сигнала в митотическая НеЬа клетки уменьшается значительно (рис. 1B). RdRP реакции с старый HMD решения также уменьшает продукцию (рис. 1 c).

Рисунок 1 : Представитель RdRP продукции эндогенного ТРЕТ митотическая клеток HeLa. (A) три представителя результаты анализа IP-RdRP в клетки HeLa лечение Нокодазол (манипулировать) или ДМСО (unmanipulated). Химически синтезированных 34 nt РНК был использован в качестве шаблона. (B) IP-RdRP пробирного митотическая клеток HeLa, выступал с неуместным MNase лечения. (C) IP-RdRP пробирного в митотическая клетки HeLa, выступал с HMD решения либо свежие или старый. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Таблица 1: MNase реакции микс компонент.

Таблица 2: RdRP реакции микс компонент.

Таблица 3: Рибонуклеазы реакции микс компонент.

Авторы не имеют ничего сообщать.