Photoconversion одноклеточных в живых нетронутыми данио рерио

Несколько отдельных ячеек взаимодействуют для создания и поддержания сложных тканями растений и животных. Эти клетки часто вставными и трудно отличить от соседей на уровне отдельной ячейки без микроскопия высокого разрешения, которые требуют фиксации ткани. Однако, чтобы понять, как эти формы тканей, поддерживаются и стать больными, он был необходимым расследовать как сингл клеток в тканях, взаимодействующих с течением времени. В идеале эти эксперименты требуют маркировки единичных клеток в тканях неинвазивным способом без требования о фиксации. Теперь ученые разработали многочисленные методы для выполнения этой задачи^1,2,и^3,4.

Обнаружение и осуществление медузы Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) был один интересный подход, который позволил для маркировки отдельных клеток в тканях окружающей среды¹. С помощью конкретных клеток промоутеров, возможна генетически выбрать подмножество ячеек, которые помечены как¹. В качестве альтернативы вирусный индуцированных выражение гена GFP могут быть использованы для выбранного пользователем выражение гена GFP^3,4. Хотя довольно полезным, генетических опосредованной выражение гена GFP не позволяют выбранного пользователем выражение в рамках подмножества клеток в тканях; и вирусный выражение GFP, хотя и выгодно, может быть инвазивными. С появлением производных GFP и умные методы как Brainbow выразить собственный флуоресцентные белки более редко в тканях стало возможным для визуализации единичных клеток и их взаимодействия в сложных ткани^{2, 5}. Однако, эти подходы ярлык клетки случайным образом. Если нужный эксперимент требует визуализации одну ячейку или популяция клеток, определяемое экспериментатора, они таким образом ограничены. С таких экспериментов, было бы целесообразно иметь генетически выраженной флуоресцентный белок, который можно манипулировать, чтобы отличать, в одну ячейку моды, это от других флуоресцентные и не люминесцентные клеток.

Для достижения этой цели и визуализации клеточной биологии одиночных камер в сложных живых тканей, научное сообщество использует одну ячейку photoconversion собственный флуоресцентные белки^6,,78. С помощью генетически контролируемых экспрессии белка photoconvertible (то есть, eos, Каэдэ и т.д.), который переходит от зеленых красных флуоресцентных состояние при воздействии УФ (488 нм) света, мы можем выделить одну ячейку от его дневно обозначенные соседи^6,,78. Этот подход использует аппарат придает нашей Конфокальный микроскоп, который может направить свет от стека Лазерный дифракционный региона интерес. С этой техникой мы можем либо ярлык отдельные ячейки или больших популяций в форме, определяемой пользователем^9,10,11. Методика является минимально инвазивной по сравнению с одной ячейке инъекции вирусных GFP. Как доказательство концепции мы показываем, что мы можем photoconvert отдельные ячейки в пределах ганглия в периферической нервной системы и photoconvert больших популяций как клетки, расположенные на вентральной стороне спинного^{9,10, 11,12}. Затем мы можем визуализировать эти photoconverted клеточных популяций 24 часа позже, чтобы разобраться в их передвижения и дифференциация во время разработки.

Все исследования на животных были утверждены в Университете Нотр Дам институциональных животное уход и использование Комитета.

1. Подготовка образца данио рерио

1. Место один взрослый самец и один взрослый женский тг (кабриолет белка) в камеру спаривания в стандартные процедуры¹³. В этой рукописи используйте Tg(sox10:eos)⁹ рыбы из-за доступ, но другие трансгенных линий с photoconvertible белком может использоваться одинаково. Настройка более чем в одной палате, в случае, если рыба не укладывать. Разрешить рыбу, чтобы остаться на ночь в камере.
2. Следующим утром, Соберите яйца в чашках Петри 100 мм. Разрешить яйца созреть до 24 ч после оплодотворения (hpf) до скрининга.
3. Если животные выше были heterozygotes для трансген, экран 24 hpf блюда для Tg(sox10:eos) + эмбрионов с 488 нм источник света и GFP фильтровать наборы на рассечения микроскопа. Изолировать Tg(sox10:eos) + эмбрионов и позволяют Зрелые 48 hpf.
4. Dechorionate эмбрионы вручную с помощью иглы или пинцетом.
5. Подготовить и микроволновой 5 мл раствора точки агарозы легкоплавких 0,8%.
   1. Как только агарозы прохладный на ощупь, место 3-4 наркотизированных тг (sox10:eos) + 48 hpf рыбы в центре стекла coverslip 10 мм снизу Петри.
   2. Добавьте достаточно агарозы для покрытия поверхности coverslip, примерно в 1 мл. Использование иглы зондов устроить рыбы на их сторонах. Разрешить агарозы для закрепления обеспечить монтаж животных. Это может быть необходимо постоянно заново организовать данио рерио, до тех пор, пока агар затвердевает¹⁴. Затвердевания занимает около 2 мин.
6. После агарозы затвердевшим за 2 мин, медленно добавьте эмбриона носитель, содержащий Эстер аминобензойной кислоты 0,02% (Tricaine) чтобы блюдо до нижней поверхности агара и блюдо погружен. Это должно быть около 3 мл.

2. Микроскоп монтажа и предварительное преобразование изображений

1. Откройте конфокальный программного обеспечения и выберите окна захвата и фокус [рис. 1]. Под окном захват выберите лаборатории особенностях преобразования изображений под захват, установив раскрывающегося вкладки [рис. 1]. Здесь специфичные для лаборатории Настройка называется «Imaging рыбы.»
2. Поместите образец на конфокальный сферы и принести в фокус с помощью курс и плавная регулировка ручки.
3. Открыть окно фокус и найдите нужный регион интереса (то есть Спинной корень ганглиев).
4. Выберите c488 лазера под меню набор фильтров. Установить экспозицию до 300 мс, мощность до 5 лазера и активизировать до 75 [рис. 2].
5. В разделе записи тип установите флажок 3D. В разделе 3D захвата выберите использовать текущую позицию и проверьте диапазон вокруг тока. В этом же разделе Установите диапазон до 35, количество самолетов до 36 и размер шага 1. Диапазон может быть увеличивается или уменьшается для размещения для глубины области изображений. Для спинного значение диапазона между 35-40 стеками обычно является достаточно [рис. 5].
6. Выберите текущее местоположение [рис. 5].
7. Нажмите кнопку Пуск в нижней части окна захвата получить изображение.

3. сотовый Photoconversion

1. Откройте конфокальный программного обеспечения и выберите окна захвата и фокус [рис. 1]. Под окном захват выберите лаборатории особенностях преобразования изображений под захват, установив раскрывающегося вкладки [рис. 1]. Здесь специфичные для лаборатории Настройка называется «Рыба удалять полный чип».
2. Выберите c488 и c541 лазера под меню набор фильтров. Если не использовать то же программное обеспечение микроскопа, найдите меню для выбора различных лазеров и выберите 488 нм и 541 нм лазеры. Установите воздействия 300 мс, мощность до 5 лазера и активизировать до 75 [рис. 2]. Эти параметры лазера выбираются основе производить достаточно флуоресцентного сигнала не вызывая Фотообесцвечивание или токсичности. Если визуализируется токсичности или Фотообесцвечивание, уменьшите мощность лазера или воздействия.
3. Открыть окно фокус и нажмите на вкладку добавлены в окне фокус. Настройте параметры лазерного соответственно. Изменить стек мощность лазера 2 и затем нажмите кнопку Go. Изменить размер блока растр 1 и нажмите кнопку установить. Измените размер дважды на 4. Изменить линия лазера на v405 [рис. 3].
4. Откройте расширенный записать параметры в окне захвата. Выберите вкладку добавлены и изменить дважды повторений до 2. Нажмите кнопку OK [рис. 4].
5. Выберите вкладку XY в окне фокус. Дважды проверьте параметры лазерного из шага 2 в закладке добавлены [рис. 3, рис. 4]. Установите параметры лазерного photoconvert клетки интереса без photoconversion окружающих клеток.
   1. Если присутствует photoconversion смежных ячеек, уменьшите мощность лазера. Если не происходит photoconversion клеток, лазерной полномочий может быть увеличена. Оптимально установите мощность лазера photoconvert только региона интерес и не прилегающих районов.
6. Установите флажок timelapse под захват типа. Нажмите кнопку начать [Рисунок 6A].
7. После того, как откроется окно жить timelapse, выберите инструмент «круг» на верхней панели инструментов [Рисунок 7]
8. Нарисуйте круг в регионе пища ячейки. Щелкните правой кнопкой мыши обращается круг, выберите регион FRAPи ждать 3 секунды. Выделенная область должна стать диммер [рис. 8]. Нажмите кнопку остановить запись.
9. Если изображений более чем одного животного, вернитесь на вкладку XY в фокус меню и выберите позицию 2. Затем повторите шаги 4.1-4.6.
10. Чтобы преобразовать популяция клеток, следуйте протокол и лазерной параметры для действия 4.1-4.4, за исключением вместо рисования круга FRAP региона интерес, используйте инструмент «линия». Нарисуйте линию на области интереса и FRAP региона, используя те же параметры, перечисленные выше.

4. пост photoconversion изображений

1. После того как все точки photoconverted. Выберите стек лаборатории конкретных стандартных изображений, установка описана в precoversion изображений шаг 3. Это находится под захват, установив раскрывающегося вкладки в окне захвата [рис. 5].
2. Выберите c488 лазера и установить экспозицию до 300 мс, мощность до 5 лазера и активизировать до 75 [Рисунок 2].
3. Выберите c541 лазер находится в том же меню как лазер c488. Установить экспозицию до 500 мс, мощность до 10 лазера и активизировать до 75 [рис. 9].
4. В разделе записи тип установите флажок 3D. В разделе 3D захвата выберите использовать текущую позицию и проверьте диапазон вокруг тока. В этом же разделе Установите диапазон до 35, количество самолетов до 36 и размер шага 1. Номер диапазона может возрастать или уменьшаться для размещения на желаемую глубину визуализации [рис. 5].
5. Если существует несколько точек на вкладке фокус XY, выберите вариант многоточечные список в окне захвата. Если нет, выберите текущее местоположение.
6. Нажмите кнопку Пуск в нижней части окна захвата получить изображение.

Photoconversion флуоресцентных белков может использоваться для обозначения отдельных клеток внутри ткани6. Чтобы продемонстрировать это, Tg(sox10:eos) рыбы9 были использованы для выражения протеина photoconvertible Eos под регулирования последовательности sox10. Tg(sox10:eos) животных на 48 hpf были впервые установлены, а затем образ для обнаружения любых неспецифические photoconversion, которые могут иметь место. Eos необращенный флуоресцентного сигнала с мало Eos photoconverted флуоресцентного сигнала был затем визуализирована (Рисунок 10). Животные находились в темноте, чтобы убедиться, что неспецифические photoconversion минимальна. Затем регионы интереса подвергаются УФ света с помощью настройки конфокального микроскопа. Чтобы подтвердить, что отдельные клетки были photoconverted в результате воздействия УФ, мы взяли z стеки области, охватывающей photoconverted региона. В соответствии с успешным photoconversion, там было мало обнаружение не преобразован Eos вне области интереса и photoconverted Eos явно присутствовал в пределах области интереса. Результирующего изображения показывает одну ячейку в пределах ганглия, которая обозначена определенно от своих соседей (Рисунок 10).

Чтобы продемонстрировать полезность этой техники photoconversion, популяция клеток также подвергается УФ света. В этой парадигме pre-photoconversion изображения были взяты и нет сигнала Eos ООН photoconverted присутствовал. Далее вентральной стороне спинного подвергалась воздействию УФ линии (рис. 11). Для подтверждения успешной photoconversion, пост photoconversion изображения были взяты и photoconverted Eos в клетках вентральной спинного мозга в месте расположения линии интерес, который мы нарисовали были визуализированы (Рисунок 11). Non-photoconverted Eos сигнал был виден во всех других областях. Распространить эту технику мы затем взял одинаковых изображений через 24 часа после photoconversion. В этих образах photoconverted Eos+ клетки были замечены разбросаны во всем регионе спинного мозга в спинной и брюшной местах (Рисунок 12). Эти данные согласуются с гипотезой, что брюшной клеток спинного мозга переехал в спинной места, как ранее описанных10. Вместе эти две техники продемонстрировать что photoconversion Eos могут быть использованы для визуализации единичных клеток или популяции клеток в пределах региона ткани в форме, определяемой пользователем. Это способствовало более глубокому пониманию характеристик клеточной миграции клеток, коммуникации и динамика.

Рисунок 1 : Захват и сосредоточиться Windows. Снимок экрана с изображением расположение окна захвата и фокус и лаборатории конкретных «Рыба удалять полный чип» раскрывающегося вкладки программного обеспечения. Увидеть красные коробки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : параметры лазерного c488. Скриншот захвата окна показаны конкретные параметры для лазерной c488. Выдержка — это 5 300 г-жа мощность лазера. Активизировать 75. Увидеть красные коробки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 : Параметры лазерного Photoconversion. Скриншот добавлены вкладки в окне фокус с изложением конкретных лазерного параметры необходимые для photoconversion. Laserstack мощность-2. Дважды щелкните размер равен 4. Растровый размер блока равен 1. Увидеть красные коробки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4 : Расширенные параметры лазерного Photoconversion. Скриншот передовые лазерные параметры в окне захвата. Это открывает окно настройки захвата с вкладкой добавлены. Дважды щелкните повторов равным 2. Увидеть красные коробки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5 : Предварительное преобразование визуализации параметров. Скриншоты окон фокус и захват. Основные моменты захват окна конкретные параметры, необходимые для предварительного преобразования изображений. Установка захвата является «Рыба изображений.» В 3D установлен флажок под тип захвата. И захвата 3D параметры задаются в виде; Диапазон составляет 35, число самолетов 36, шаг размер равен 1, и смещение -15. «Текущее положение» и «диапазон вокруг ток» коробки также будут выбраны. Увидеть красные коробки. Изображает, как выбрать одну или несколько точек на окно захвата (слева) и для выбора отдельных точек на фокус окна (справа). Смотрите зеленый коробки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6 : Открытие окна Photoconversion. Снимок экрана с изображением timelapse захвата тип выбирается в соответствии с ранее установленные параметры. Увидеть красные коробки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 7 : Настройка Photoconversion. Скриншот с указанием местоположения круг инструмент (вверху) и захвата управления окно, которое появляется (справа). Увидеть красные коробки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 8 : Одной ячейки Photoconversion. Скриншот, изображающие использование инструмента photoconversion круг и правой кнопкой мыши выпадающем меню. Действия преобразования «FRAP всех регионов» расположен в правой кнопкой мыши меню падения вниз. Увидеть красные коробки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 9 : Параметры пост-Photoconversion c561Laser. Скриншот захвата окна показаны конкретные параметры для лазерной c561. Выдержка — это 10 500 г-жа мощность лазера. Активизировать 75. Увидеть красные коробки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 10 : Одной ячейки Photoconversion. (A). схема и конфокальный z прогнозы данио рерио Tg(sox10:eos) на 48 hpf показаны Спинной корень ганглиев в периферической нервной системе до photoconversion. Пунктирная линия показывает приблизительное местоположение DRG спинного вступления... (B). схема и конфокальный z прогнозы данио рерио Tg(sox10:eos) на 48 hpf показаны Спинной корень ганглиев в периферической нервной системе во время photoconversion. Пунктирная линия показывает запись спинного DRG. Желтый круг указывает сайт преобразование и освещение болт указывает под действием ультрафиолетовых лучей. (C). схема и конфокальный z прогнозы данио рерио Tg(sox10:eos) на 48 hpf показаны Спинной корень ганглиев в пост photoconversion периферической нервной системы. Пунктирная линия показывает запись спинного DRG. ЦНС-это аббревиатура для центральной нервной системы и ПНС это аббревиатура для периферической нервной системы (A-C). Линейки шкалы равен 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 11 : Photoconversion процедура в больших спинного регионе. (A). схема и конфокальный z прогнозы данио рерио Tg(sox10:eos) на 48 показаны hpf OPCs и спинной корень ганглиев в регионе вентральной спинного мозга до photoconversion. Пунктирная линия показывает спинной части спинного мозга. (B). схема и конфокальный z прогнозы данио рерио Tg(sox10:eos) на 48 показаны hpf OPCs и спинной корень ганглиев в регионе вентральной спинного мозга во время photoconversion. Сплошная желтая линия показывает выбранную область для photoconversion. Пунктирная линия показывает спинной части спинного мозга. (C). схема и конфокальный z прогнозы данио рерио Tg(sox10:eos) на 48 показаны hpf OPCs и спинной корень ганглиев в регионе вентральной спинного мозга после photoconversion. Пунктирные линии указывают спинной части спинного мозга. Линейки шкалы равен 10 мкм.

Рисунок 12 : Клеточной отслеживания и визуализации пост photoconversion. (A). схема Tg(sox10:eos) данио рерио спинного мозга на 48 показаны hpf OPCs и спинной корень ганглиев в регионе вентральной спинного мозга после photoconversion. Молния указывает УФ света преобразования. (B). конфокальный z прогнозы Tg(sox10:eos) данио рерио спинного начиная 48 показаны hpf OPCs и спинной корень ганглиев в регионе вентральной спинного мозга после photoconversion. Молния указывает УФ света преобразования. Линейки шкалы равен 10 мкм.

Авторы не имеют ничего сообщать.