Мурина, пить модели в развитии фармакотерапия для алкоголизма: пить в темных и две бутылки выбор

За последние 25 плюс лет, был введен значительные усилия в направлении разработки лекарств для лечения расстройства использование алкоголя (AUD)¹. Несмотря на многие успехи, AUD по-прежнему остается серьезной проблемой здравоохранения, затрагивающей более 18 миллионов американцев и стоимостью свыше $220 млрд ежегодно^2,3. В настоящее время есть только три утвержденные FDA лекарства, Дисульфирам, налтрексон и Акампросат, все из которых дали противоречивые результаты клинических испытаний и ограниченный успех даже тогда, когда в сочетании с психологической интервенции в параметрах клиника ^{4 , 5 , 6 , 7}.

Основная причина неудач текущие AUD терапии связано с разнородные характер AUD⁸. Хотя как экологические, так и генетические факторы способствуют развитию AUD, наследуемость составляет примерно 50-60% риска наступления⁹. Подобно для лечения депрессии, широко признается, что пациенты, страдающие от AUD потребуется целый ряд препаратов, которые приспособлены для удовлетворения потребностей каждого пациента¹⁰.

Очевидно существует настоятельная необходимость более эффективного лечения, которые бы облегчена, если уже напряженных и трудоёмкий процесс обнаружения наркотиков обтекаемый³. С этой целью следующий протокол демонстрирует доклинические применимость две грызунов питьевой модели, широко используется для изучения нейробиологических основу AUD¹¹. Говоря более конкретно, метод, представленный здесь можно оценить эффективность кандидата соединений на сокращение алкоголя потребления как в «умеренных» и «пьянство» сценарии использования двух бутылки выбор (TBC) и пить в темные парадигмы (DID), соответственно. Обе парадигмы изучить этанола не оперантного самоуправления, которой мышей глотать этанола в устной, так и на воле и поэтому иллюстрируют высокий лицо и построить действительность как модель человека алкоголизма¹¹.

В TBC, питьевой, также известный как свободный выбор, пить, пить, предпочтения или социальное питье две бутылки решения постоянно доступны в клетке, дома. 1 флакон содержит воды, а другой разбавленный раствор этанола, которой может изменяться концентрация этанола (например., 5-30% v/v)^11,12. Мыши имеют постоянный доступ к обоим бутылки и таким образом, можно выбрать сколько пить из каждой бутылки.

Эта модель оценивает потребления этанола каждой мыши (г/кг), а также отношение предпочтения этанола (объем потребления этанола ÷ общий объем жидкости потребляется). Обычно он используется для сравнения питьевой уровнях через различных штаммов мышей, или после конкретных генетических манипуляций (например., нокаут гена или нокдаун) и результаты в крови концентрации этанола (ящики) похож на то, что находится в организме человека при пить в меру^13,14.

В процедуре DID, 3 ч после начала цикла темные дома Кейдж бутылка воды осуществляется обмен с бутылкой 20% (v/v) этанола раствор для ограниченного доступа к питьевой сессии. Питьевой сессии происходят как подряд 4-дневного цикла, прочного 2 h на 1-3 и 4 ч в день 4. Дни 1-3 служат алкоголя привыкания период перед началом тестирования на 4 день. Следовательно, мышей надежно будет потреблять достаточно этанола для достижения ящики > 100 мг/дл и в результате, поведенческие последствия интоксикации, в людей, которые являются выпивка^13,14,15. Доступ к воде доступен на все времена Помимо питьевой сессии.

Существует несколько вариантов питьевой ограниченный доступ. Например в кратковременный доступ модели мышей получают две бутылки (один с водой и других содержащих 20% (v/v) этанола) только в понедельник, среду и пятницу с 24 h и 48 h период вывода на будние и выходные дни, соответственно¹⁶. После нескольких недель кратковременный доступ мышей будет постепенно и добровольно эскалации питьевой уровней, в конечном счете достижения звезд похож на то, что наблюдается в модели DID. DID, однако, по-видимому, наиболее часто используемые модели для оценки как выпивка питьевой поведение. Существуют другие модели периодически пить, но они полагаются на ограничение доступа к продовольствию или паров палата индуцированной увеличение добровольных самоуправления, что делает их менее представитель добровольных человека алкоголем потребления¹⁶.

Все описанные здесь процедуры были одобрены институциональный уход животных и использование комитетами студенческого городка здравоохранения наук Университета Южной Калифорнии.

1. Экспериментальная установка и Ассамблеи

1. Приобрести все следующих материалов и химических веществ до начала исследования: мышей, клетки/металл Кейдж топы, постельные принадлежности, еда, вода, этанол, пипец, sipper топы, термоусадочная упаковка, нож, zip связей, ленты, горелка Бунзена, масштаб, фары.
2. Получите мышей C57BL/6J, либо из коммерческих источников или доме колонии, имея в виду, что мышь может быть группа размещается до времени тестирования.
   Примечание: Общее количество закупаемых мышей зависит от сложности экспериментального дизайна. План для размещения примерно 12-15 мышей в группе, с экспериментальных исследований не менее 5-7 мышей для каждой группы. В представительных результаты, показанные ниже мы использовали простой настройки двух групп для оценки причинно следственной связи, с помощью одной дозы (5 мг/кг) препарата (МОКС).
3. Следуйте шагам ниже, чтобы собрать бутылки¹⁸.
   1. Тепло нож с помощью горелки Бунзена.
   2. Используя этот нож, сократить около дюйма от верхней и нижней концы Серологические Пипетки пластиковые 18 мл.
      1. Обратите внимание, что меньший объем пипетки (т.е., 10 мл) также может использоваться для повышения точности измерения.
   3. Теплый накапайте под тепловой пушки.
   4. Вставьте трубки sipper подшипник в концу пипетки (другими словами, открытие ближайший пунктир 18 мл) «снизу».
   5. Уплотнение sipper трубки в месте с термоусадочной пленкой, использование коммерчески доступных термоусадочная упаковка пистолет.
   6. Шапку другие открытия с пробкой силикона.

2. животных привыкания

1. Начиная по крайней мере за 1 неделю до даты начала эксперимента, передачи мышей в комнату, где экспериментальные процедуры должны осуществляться таким образом, чтобы они может акклиматизироваться к условиям животноводства (включая температуры окружающей среды (21 ± 1 ° C) и 12-h обратный цикл свет/темно, с огнями с 12 ч.) Не забудьте следовать институциональных руководящих принципов и уведомлять соответствующие каналы перед перемещением животных из одного места в другое.
   1. Если мыши передаются от стандартного цикла свет/темно позволяют 2 недель времени дополнительных привыкания.
2. Заполните новоиспеченных бутылки до краев с водой. Убедитесь, что крышка закрыта надежно и лишена каких-либо воздушных пузырьков или утечки из носика. Если раствор протекает, повторно установите крышку. Удалите все пузырьки воздуха, просто нажав на бутылке так, что воздух может избежать трубки.
3. По прибытии один дом каждой мыши в стандартных поликарбонат/полисульфон клетки с постельным бельем и металлическую сетку верхней клетке; Удалите крышку отсека, как он больше не будет использоваться.
   1. Обеспечение доступа к продовольственной и water bottle(s) ad libitum.
   2. Закрепите каждую бутылку в верхней клетке, завернув пластиковую стяжку вокруг каждой бутылке, чтобы удерживать его на месте. Обрежьте любой избыток пластик от стяжку обеспечить, что он не выступают в клетку.
      Примечание: Для питья в процедуре темный (DID), требуется только одну бутылку воды. Привыкания к парадигме две бутылки выбор (TBC), однако, требует, что клетка настройки включают две бутылки воды. Если металлическая сетка Хоппер условии предназначен для хранения только одну бутылку решения, осторожно согните врозь его баров для создания пространства для дополнительной пластины для размещения второй бутылки TBC.
4. Установите по крайней мере 3 клетки мыши свободный элемент управления. Это позволит обеспечить мониторинг любой жидкости потери, вызванные испарения или утечки из бутылки, которая это просто естественное явление, которое происходит как клетки помещают на и вне клетки стойки (см. шаг 2.6.3, 3.6.1 и 4.6.1 для уравнений).
5. Начиная день 4 адаптационного один корпус 1-недели, измерять и записывать ежедневные веса тела и питание каждой мыши, используя шкалу, (в граммах), а также потребление воды, используя офорты наряду с Перевернутый бутылка для записи высшая точка мениска (в мл).
   1. Хотя это стандартная практика научной читать самая низкая точка вогнутый мениск, потому что бутылки остаются в перевернутом положении во время измерения, записи высшая точка мениска.
6. Оценки параметров 2,5 с помощью уравнения ниже:
   1. Измерить изменение веса тела (g): вес текущего дня (g) - Вес предыдущего дня (g).
   2. Измерить потребление пищи (g): вес пищи на предыдущий день (g) - вес пищи на текущий день (g).
   3. Измерить потребление воды (мл): [объем воды на текущий день (мл) - объем воды на предыдущий день (мл)] - средняя воды потери от всех клеток управления (мл).
7. Повторите шаг 2,5 последовательно, дней 5-7, чтобы позволить для определения базового плана для трех дней непосредственно до введения этанола. Если запись подряд не могут быть собраны, расширить адаптационного периода для оценки базовых измерений.
8. После того как потребление воды стабилизировался на изменчивость ± 10% от среднего значения за последние 3 дня, начните этанола доступ с TBC (неограниченный доступ) или DID (ограниченный доступ).
   Примечание: В редких случаях, один или два дополнительных дней может потребоваться для субъектов для достижения этой стабильности; не пугайтесь, если потребуется дополнительное время для значения для отображения изменчивость ±10% от среднего значения за последние 3 дня.

3. 24-часовой две бутылки выбор (TBC)

Примечание: Схема готовится на рисунке 1.

1. Подготовка 10% (v/v) этанола раствор на 500 мл тома путем добавления 52.65 мл этанола 190 доказательство зерна (~ 95% этиловом спирте) 447.35 мл H₂O; не забудьте тщательно встряхнуть. Учитывая, что этанол быстро испаряется, замените решение в интервале каждые 3-4 дня.
   Примечание: Также могут использоваться другие концентрации этанола, но авторы рекомендуют 10% концентрации для этой модели.
2. В первый день TBC (8 день в ближайшее время) пустые 1 2 бутылки воды, в каждой клетке и заполнить его до краев с раствором свежеприготовленного этанола. Учитывая, что этанол и вода являются трудно отличить визуально, четко этикетке бутылки с их соответствующим содержанием. Просто применять кусок малярная лента к бутылке и маркировки его с маркером или написав непосредственно на бутылку.
3. При необходимости добавьте дополнительные решения бутылку воды.
4. Место бутылки обратно на клетке, убедившись, что все шапки закрыты надежно и лишена каких-либо воздушных пузырьков или утечки из носика. Если решение протекает, повторно установите крышку. Удалите все пузырьки воздуха, просто нажав на бутылке так, что воздух может избежать бутылку.
5. Альтернативные позиции бутылок каждый день, чтобы правильно для предпочтения кондиционером место связанные с влияний в питьевой активности (см. обсуждение для больше).
6. Помимо ежедневных измерений от 2.5 и 2.6, которая продолжается, начинают читать и записывать также уровни потребления этанола. Анализировать соотношение потребления и предпочтение 10% этанола, с помощью следующих уравнений:
   1. Мера 10% этанола доза (мл): [количество этанола на текущий день (мл) - объем этанола на предыдущий день (мл))]-средняя потеря этанола от всех клеток управления (мл).
   2. Мера 10% этанола потребление (г/кг): [10% этанола доза (мл) x 0.07893 г/мл] / тела (кг).
   3. Измерить % предпочтения: [10% этанола доза (мл) / вода (мл)] x 100.
7. Как только прием этанола стала стабильной, администрирование одного управления (физиологический) внутрибрюшинного (и.п.) впрыска (0,01 мл/г веса тела) для каждой мыши во время повседневной измерения. Таким образом предметы accustomed к себе инъекции.
   1. Стабильность определяется как изменчивость ± 10% от среднего значения за последние 3 дня (же, как и раздел 2.8).
      Примечание: Это может занять до 1 недели для этанола уровней стабилизации. Это особенно верно, если повторно используются от предыдущих эксперимента мышей и имели предыдущего воздействия этанола. Элемент управления является просто растворителя используется для растворения препарата.
8. После того, как базовый этанола с низкой изменчивости восстановлена, разделить мышей на дозирования групп с использованием значения потребления этанола, таким образом, чтобы все группы имеют примерно одинаковые средние значения потребления этанола.
   1. Назначить одной группы управления (продолжая получать физиологического раствора), а другая — экспериментальный (и.п. инъекция препарата исследованы на 0,01 мл/г веса тела). Начинаются ежедневные наркотиков дозирования, либо для острых или многодневные продолжительность. Впоследствии элемент управления может быть вновь внесен для тестирования после наркотиков эффекты (необязательно).
      Примечание: Потому что пить контролируется через длительный период 24-h, то время администрации дозировка зависит не темные цикла.

4. пить в темноте (сделал)

Примечание: Схема готовится на рисунке 3.

1. На каждый день доступ к расписанию этанола (дни 1-4) запись измерения, объем воды, пищи и вес тела и выполнять дозировки препарата. Сделать это в течение предварительно время свет цикла, который выбирается в соответствии с фармакокинетики препарата так что соединение в / или приближается максимальный мозга концентрации в питьевой период.
   Примечание: Помните, что дни 1-3 предназначены для просто акклиматизироваться мышей, чтобы пить обильное количество этанола в короткий период времени. В то время как мышь не достигают BEC уровня, сопоставимого с человека 0,08; в эти дни «обучение» убедитесь, что на день 4, немного больше питьевой сессии, они будут на самом деле пить до этого уровня.
   1. Дать все мыши элемент управления (физиологического раствора) на 1-3 дней и элемент управления или наркотиков на 4 день. Эта процедура DID происходит в течение 3 недель, чтобы включать предварительно наркотиков (1 неделя), наркотиками (2 недели) и после наркотиков (неделя 4) питьевой сессии.
   2. Примечание: Обратите внимание, что в течение недели, дозирование препарата, уровни потребления этанола день 3 используются для присвоить мышей группы управления или наркотиков образом, где уровни потребления этанола обеих групп наименее изменчивости. Это в отличие от TBC, который присваивает группы, основанные на среднем за 3 дня.
2. Подготовить 20% (v/v) этанола раствор (20E) на 500 мл тома путем добавления 105.25 мл этанола 190 доказательство зерна (~ 95% этиловом спирте) 394.75 мл H₂O; не забудьте тщательно встряхнуть.
3. Так что как только начинает DID бутылки с водой можно просто заменить бутылки алкоголя, заполните этанола бутылки перед началом питьевой сессии.
4. В ходе всей сессии DID (шаги 4,5-4,8) используйте красный свет фар, чтобы не беспокоить животных.
5. В начале DID, питьевой сессии, планируется начать в 3 часа в темной цикл запишите объем воды для каждой мыши. Затем замените каждую бутылку воды с бутылкой 20E решения и записывать начальный объем этанола.
6. Чтение и запись заключительного этанола объем 2 часа позже, в конце питьевой сессии на 1-3 дня и 4 часа позже на 4 день. Анализ потребления этанола 20%, с помощью следующих уравнений.
   1. Измерить 20% потребления этанола (мл): [объем этанола в конце питьевой сессии (мл) - объем этанола в начале питьевой сессии (мл)] - средняя этанола потери от всех клеток управления (мл).
   2. Измерить 20% потребления этанола (г/кг): [20% потребления этанола (мл) x 0.15786 г/мл] / тела (кг).
7. Только на день 4, сразу же после записи этанола томов и до повторного введения доступа к воде сбор крови для оценки концентрации этанола крови каждого мыши (необязательно).
   Примечание: Любой метод сбора крови-терминал может использоваться, как ретро орбиталь синуса крови, или коллекции подкожной вены кровь. Полезные протоколов см ссылки для Parasuraman и др. ²¹ и Ярдли и др. ²⁰.
   1. Выполнять анализ, используя различные методы, включая LCMS или коммерчески доступных машин (см. Таблицу материалы).
8. Замените все этанола бутылки бутылки воды и объем записи воды.

В следующих представитель расследований социальное питье был смоделирован с помощью выбора двух бутылка (TBC) парадигмы. Вкратце мышей имели доступ к двух бутылок раствора, одна из которых содержала воды, а другой-10% (v/v) этанола раствор. Предметы были впоследствии разделить и равномерно назначен группам лечения наркотиков, моксидектин (МОКС) vs. физиологический контроль, так что каждая группа будет среднем уровни потребления этанола с наименьшее количество вариантов.

Первоначальные базовые 10E потребление в период 24-h стабилизировалась на 14,46 ± 1,85 г/кг (n = 8) до инъекции начала и впоследствии вновь стабилизировались на 14,14 г/кг пост физиологическим инъекции. Оценить эффекты острого дозы (5 мг/кг) мох на прием этанола и предпочтения, пить деятельности был начисленных мох, мох, пред- и постатрибутам мох. Мы обнаружили, что разовая доза мох значительно сократить потребление алкоголя свыше 45%, по сравнению с pre мох инъекции [F (2, 22) = 26.33, p < 0.0001] (рисA) и предпочтение [F (2, 14) 17.35, p = < 0.0001] (рис. 2B ) превышает 30%. 10E потребление и предпочтения оставался значительно ниже, чем физиологического раствора на следующий день сразу же после лечения мох (более чем на 25% и 15% соответственно) показано как после инъекции мох на рис. 2).

В неопубликованные экспериментального исследования пьянство был смоделирован с помощью пить в темные (DID) процедура, которой мышей ежедневно имели ограниченный доступ (2 h) для одной бутылки содержащие 20E начала 3-h в суточный темные фазу, 3 дней подряд, с больше доступа период (4 ч) на день 4 (рис. 4). Самок мышей (n = 12, 6 мышей/группа) управляемых физиологическим инъекции (и.п.) в дни 1-4 с базовой 20E устанавливались на день 4 (предварительно наркотиков). Дни 1-3 2-й раз в неделю цикла, все мыши получил еще один физиологическим внутримышечно ежедневно. Значения потребления этанола от дня 3 затем были использованы для разделения мышей на две группы (n = 6 / группа), впоследствии получил либо одной инъекции (и.п.) мох (5 мг/кг) или физиологического раствора на 4 день (наркотиков). Следующей неделе всех мышей получил ежедневные инъекции засоленных на потребление 1-4 и этанола дней была измерена еще раз на день 4 (пост наркотиков). Острый отправления 5 мг/кг мох был проанализированы и изыскать значительно сокращена алкоголя свыше 54%, по сравнению с предварительно наркотиков инъекции (t = 7.635, p < 0,0001)

Рисунок 1 . Две бутылки выбор схемыпожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.  

Рисунок 2 . Две бутылки выбор (TBC). МОХ (5 мг/кг) уменьшает 10% v/v этанола (10E) потребление (A) и предпочтения (B) для самок мышей C57BL/6J с использованием 24-h доступ две бутылки выбор парадигмы. После достижения стабильного уровня питьевой 3 дней подряд, управлял мох. Бары представляют средний 10E уровни потребления от накануне мох инъекции (белая; Предварительно мох), день инъекции мох (черный; МОХ) и на следующий день после инъекции мох (серый; Пост мох). Значения представляют собой среднее ± SEM для 12 мышей. * P < 0,05, ** P < 0.01, *** P < 0,001, и *** P < 0,0001 против Pre MOX (крайняя левая горизонтальная линия) или опубликовать мох (правый горизонтальная линия), Тьюки в несколько пост hoc сравнения теста. Изменение от Huynh н. и др. 19 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 . Пить в темные схемыпожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.  

Рисунок 4 . Пить в темноте (DID). МОХ (5 мг/кг) уменьшает 20% v/v этанола (20E) потребление в самок мышей C57BL/6J с помощью пить в темной парадигмы. Бары представляют средний 20E уровни потребления на неделю до сот впрыска (до наркотиков), в неделю инъекций мох (наркотиков) и недели после инъекции мох (после наркотиков). Значения представляют собой среднее ± SEM для 12 мышей (6/группа) между физиологического раствора и мох группами. P < 0.0001 до наркотиков (крайняя левая горизонтальная линия) или после наркотиков (правый горизонтальная линия), Тьюки в несколько пост hoc сравнения теста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

МГ и Ла являются изобретателей на патент на повторное использование ивермектина и смежных avermectins для лечения расстройств употребления алкоголя. Авторы не имеют никаких других конфликтов интересов и несете полную ответственность за содержание научных бумаги.